Застосування інгібіторів репарації пошкоджень днк для лікування раку

1. Застосування інгібітора поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази (PARP) для отримання медикаменту, який призначений для використання у способі лікування раку, дефектного за шляхом репарації двониткового розриву (double strand break, ДНР) ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, в індивідуума. 2. Застосування за п. 1, яке відрізняється тим, що спосіб включає у себе ідентифікацію ракового стану в індивідуума як дефектного за репарацією двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 2 (19) 1 3 12. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, в якому вказаний рак є лейкемією, саркомою, раком шкіри, раком міхура, раком молочної залози, раком матки, раком яєчника, раком простати, раком легенів, раком прямої кишки, раком шиї, раком печінки, раком голови та шиї, раком стравоходу, раком підшлункової залози, раком нирки, раком шлунку або раком мозку. 13. Застосування за будь-яким із попередніх пунктів, в якому вказаний рак є раком молочної залози, яєчника, підшлункової залози або простати. 14. Застосування за будь-яким із пп. 1-13, в якому інгібітор PARP вибирають з групи, яка включає нікотинаміди, бензаміди, ізохіноліни, дигідроізохіноліни, бензоімідазоли, індоли, фталазин-1(2H)они, хіназолінони, ізоіндолінони, фенантридини, бензопірони, похідні ненасичених гідроксамових кислот, кофеїн, теофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. 15. Застосування за п. 14, яке відрізняється тим, що інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADPribose)-полімерази являє собою фталазин-1(2H)он або його аналог, або похідне. 16. Застосування за п. 13, яке відрізняється тим, що інгібітор ексцизійної репарації основ являє собою пептидний фрагмент поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази. 17. Застосування за п. 13, яке відрізняється тим, що вказаний інгібітор ексцизійної репарації основ являє собою нуклеїнову кислоту, яка кодує поліаденозиндифосфорибозу-(ADP-ribose)-полімеразу повністю або частково, або її комплемент. 18. Застосування за будь-яким із пп. 1-17, яке відрізняється тим, що вказаний медикамент містить також хіміотерапевтичний агент, який пошкоджує ДНК. 19. Застосування за будь-яким із пп. 1-17, яке відрізняється тим, що вказане лікування включає також введення хіміотерапевтичного агента, який пошкоджує ДНК. 20. Спосіб лікування раку в індивідуума, який включає: введення інгібітора поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази вказаному індивідууму, при цьому вказаний рак є дефектним за шляхом репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 21. Спосіб за п. 20, який відрізняється тим, що включає операцію ідентифікації індивідуума як страждаючого раковим захворюванням, яке є дефектним за шляхом репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 22. Спосіб за п. 21, який відрізняється тим, що включає введення вказаному індивідууму хіміотерапевтичного агента, який пошкоджує ДНК. 23. Спосіб за будь-яким із пп. 20-22, який відрізняється тим, що вказаний рак включає одну або декілька ракових клітин, що мають знижену здатність або втратили здатність до репарації ДНР ДНК за допомогою гомологічної рекомбінації у порівнянні з нормальними клітинами. 24. Спосіб за п. 23, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини мають фенотип, дефектний за BRCA1 або BRCA2. 25. Спосіб за п. 24, який відрізняється тим, що 94209 4 вказані ракові клітини є дефектними за BRCA1 або BRCA2. 26. Спосіб за п. 25, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини є гомозиготними за мутацією у BRCA1 або BRCA2. 27. Спосіб за будь-яким із пп. 20-26, який відрізняється тим, що вказаний рак ідентифікується як рак, дефектний за репарацією двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, визначенням репараційної активності ракових клітин двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, в індивідуума у порівнянні з нормальними клітинами. 28. Спосіб за будь-яким із пп. 20-26, який відрізняється тим, що вказаний рак ідентифікується як рак, дефектний за репарацією двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, визначенням наявності у ракових клітинах в індивідуума однієї або більше мутацій або поліморфізмів у послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує компонент шляху репарації двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, в індивідуума. 29. Спосіб за будь-яким із пп. 20-28, який відрізняється тим, що вказаний рак є раком молочної залози, яєчника, підшлункової залози або простати. 30. Спосіб за будь-яким із пп. 20-29, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у гені, який кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 31. Спосіб за п. 30, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у BRCA1 та/або BRCA2. 32. Спосіб за будь-яким із пп. 20-31, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор пoлiaдeнoзиндифocфopибoзи-(ADP-ribose)пoлiмepaзи вибирають з групи, яка включає нікотинаміди, бензаміди, ізохіноліни, дигідроізохіноліни, бензоімідазоли, індоли, фталазин-1(2Н)-они, хіназолінони, ізоіндолінони, фенантридини, бензопірони, похідні ненасичених гідроксамових кислот, кофеїн, теофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. 33. Спосіб за п. 32, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази являє собою фталазин1(2H)-он або його аналог або похідне. 34. Спосіб за будь-яким із пп. 20-31, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор являє собою пептидний фрагмент поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази. 35. Спосіб за будь-яким із пп. 20-31, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази являє собою нуклеїнову кислоту, яка кодує поліаденозиндифосфорибозу-(ADP-ribose)-полімеразу повністю або частково, або її комплемент. 36. Спосіб оцінки стану індивідуума, страждаючого раковим захворюванням, який включає: ідентифікацію ракової клітини, отриманої в індивідуума, як дефектної за шляхом репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, у порівнянні з нормальними клітинами; 5 де індивідуум, який має клітину раку, яка ідентифікована як дефектна за шляхом репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, підходить для лікування інгібітором поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази. 37. Спосіб за п. 36, який відрізняється тим, що вказаний рак включає одну або декілька ракових клітин, які мають знижену здатність або втратили здатність до репарації ДНР ДНК за допомогою гомологічної рекомбінації у порівнянні з нормальними клітинами. 38. Спосіб за п. 37, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини мають фенотип, дефектний за BRCA1 або BRCA2. 39. Спосіб за п. 38, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини є дефектними за BRCA1 або BRCA2. 40. Спосіб за п. 39, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини є гомозиготними за мутацією у BRCA1 або BRCA2. 41. Спосіб за будь-яким із пп. 36-40, який відрізняється тим, що вказаний рак ідентифікується як рак, дефектний за репарацією двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, визначенням репараційної активності ракових клітин двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, в індивідуума у порівнянні з нормальними клітинами. 42. Спосіб за будь-яким із пп. 36-40, який відрізняється тим, що вказаний рак ідентифікується як рак, дефектний за репарацією двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, визначенням наявності у ракових клітинах в індивідуума однієї або більше мутацій або поліморфізмів у послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує компонент шляху репарації двониткового розриву ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, в індивідуума. 43. Спосіб за будь-яким із пп. 36-42, який відрізняється тим, що вказаний рак є раком молочної залози, яєчника, підшлункової залози або простати. 44. Спосіб за будь-яким із пп. 36-43, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у гені, який кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у BRCA1 та/або BRCA2. 46. Спосіб за будь-яким із пп. 36-45, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази вибирають з групи, яка включає нікотинаміди, бензаміди, ізохіноліни, дигідроізохіноліни, бензоімідазоли, індоли, фталазин-1(2Н)-они, хіназолінони, ізоіндолінони, фенантридини, бензопірони, похідні ненасичених гідроксамових кислот, кофеїн, теофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. 47. Спосіб за п. 46, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази являє собою фталазин1(2Н)-он або його аналог або похідне. 48. Спосіб за будь-яким із пп. 36-45, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор являє собою 94209 6 пептидний фрагмент поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази. 49. Спосіб за будь-яким із пп. 36-45, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази являє собою нуклеїнову кислоту, яка кодує поліаденозиндифосфорибозу-(ADP-ribose)-полімеразу повністю або частково, або її комплемент. 50. Спосіб передрікання реакції ракового стану в індивідуума на лікування наміченого раку, який містить дефективну репарацію ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, який включає введення у контакт інгібітора поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази (PARP) зі зразком ракових клітин, що отримані з індивідуума, що перебуває у стані раку, та визначення рівня клітинної смертності у вказаному зразку. 51. Спосіб за п. 50, який включає забезпечення інгібітора поліаденозиндифосфорибози-(ADPribose)-полімерази (PARP), придатного для введення вказаному індивідууму. 52. Спосіб за п. 50 або 51, в якому вказаний рак містить одну або декілька ракових клітин, які мають знижену здатність або втратили здатність до репарації ДНР ДНК за допомогою гомологічної рекомбінації у порівнянні з нормальними клітинами. 53. Спосіб за п. 52, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини мають фенотип, дефектний за BRCA1 або BRCA2. 54. Спосіб за п. 53, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини є дефектними за BRCA1 або BRCA2. 55. Спосіб за п. 54, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини є гомозиготними за мутацією у BRCA1 або BRCA2. 56. Спосіб за будь-яким із пп. 50-55, який відрізняється тим, що вказаний рак ідентифікований як рак, дефектний за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від гомологічної рекомбінації, шляхом визначення активності репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, ракових клітин, отриманих в індивідуума, у порівнянні з нормальними клітинами. 57. Спосіб за будь-яким із пп. 50-55, який відрізняється тим, що вказаний рак ідентифікований як рак, дефектний за репарацією ДНР, яка залежна від гомологічної рекомбінації, шляхом визначення наявності у ракових клітинах, отриманих від індивідуума, однієї або декількох мутацій або поліморфізмів у послідовності нуклеїнової кислоти, яка кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 58. Спосіб за будь-яким із пп. 50-57, який відрізняється тим, що вказаний рак є раком молочної залози, яєчника, підшлункової залози або простати. 59. Спосіб за будь-яким із пп. 50-58, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у гені, який кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 60. Спосіб за п. 59, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією 7 у BRCA1 та/або BRCA2. 61. Спосіб за будь-яким із пп. 50-60, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази вибирають з групи, яка включає нікотинаміди, бензаміди, ізохіноліни, дигідроізохіноліни, бензоімідазоли, індоли, фталазин-1(2H)-они, хіназолінони, ізоіндолінони, фенантридини, бензопірони, похідні ненасичених гідроксамових кислот, кофеїн, теофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. 62. Спосіб за п. 61, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-( ADP-ribose)-полімерази являє собою фталазин1(2Н)-он або його аналог або похідне. 63. Спосіб за будь-яким із пп. 50-60, в якому вказаний інгібітор являє собою пептидний фрагмент поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)полімерази. 64. Спосіб за будь-яким із пп. 50-60, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази являє собою нуклеїнову кислоту, яка кодує поліаденозиндифосфорибозу-( ADP-ribose)-полімеразу повністю або частково, або її комплемент. 65. Спосіб лікування раку в індивідуума, який включає: введення вказаному індивідууму інгібітора поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази, при цьому вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у гені, який кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 66. Спосіб за п. 65, який відрізняється тим, що вказаний рак містить одну або декілька ракових клітин, які мають знижену здатність або втратили здатність до репарації ДНР ДНК за допомогою гомологічної рекомбінації у порівнянні з нормальними клітинами. 67. Спосіб за п. 65 або п. 66, який відрізняється тим, що вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією у BRCA1 або BRCA2. 68. Спосіб за п. 67, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини мають фенотип, дефектний за BRCA1 або BRCA2. 69. Спосіб за п. 68, який відрізняється тим, що вказані ракові клітини є гомозиготними за мутацією у BRCA1 або BRCA2. 70. Спосіб за будь-яким із пп. 65-69, який відрізняється тим, що вказаний рак є раком молочної залози, яєчника, підшлункової залози або простати. 71. Спосіб за будь-яким із пп. 65-69, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази вибирають з групи, яка включає нікотинаміди, бензаміди, ізохіноліни, дигідроізохіноліни, бензоімідазоли, індоли, фталазин-1(2Н)-они, хіназолінони, ізоіндолінони, фенантридини, бензопірони, похідні ненасичених гідроксамових кислот, кофеїн, теофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. 72. Спосіб за п. 71, який відрізняється тим, що інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADPribose)-полімерази являє собою фталазин-1(2Н)он або його аналог, або похідне. 94209 8 73. Спосіб за будь-яким із пп. 65-70, який відрізняється тим, що інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази являє собою пептидний фрагмент поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази. 74. Спосіб за будь-яким із пп. 65-70, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази являє собою нуклеїнову кислоту, яка повністю або частково кодує послідовність амінокислот поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази, або її комплемент. 75. Спосіб за будь-яким із пп. 65-74, який включає ідентифікацію раку як дефектного за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від гомологічної рекомбінації. 76. Спосіб за п. 75, в якому рак ідентифікується як той, що має фенотип, дефектний за BRCA1 або BRCA2. 77. Спосіб за будь-яким із пп. 65-76, який відрізняється тим, що включає введення вказаному індивідууму хіміотерапевтичного агента, який пошкоджує ДНК. 78. Застосування інгібітора поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази для отримання медикаменту, який призначений для лікування раку в індивідуума, гетерозиготного за мутацією у гені шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 79. Інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADPribose)-полімерази для застосування при лікуванні раку в індивідуума, гетерозиготного за мутацією у гені шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 80. Інгібітор поліаденозиндифосфорибози-(ADPribose)-полімерази для застосування при лікуванні раку, дефектного за шляхом репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації. 81. Спосіб визначення активності шляху репарації ДНР ДНК, залежної від гомологічної рекомбінації, при раковому захворюванні індивідуума, який включає: контакт інгібітора поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази із зразком ракових клітин, отриманих в індивідуума, страждаючого вказаним захворюванням, та визначення рівня клітинної смертності у вказаному зразку. 82. Спосіб за п. 81, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази вибирають з групи, яка включає нікотинаміди, бензаміди, ізохіноліни, дигідроізохіноліни, бензоімідазоли, індоли, фталазин1(2Н)-они, хіназолінони, ізоіндолінони, фенантридини, бензопірони, похідні ненасичених гідроксамових кислот, кофеїн, теофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. 83. Спосіб за п. 82, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази являє собою фталазин1(2Н)-он або його аналог, або похідне. 84. Спосіб за п. 81, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази являє собою пептидний фрагмент послідовності поліаденозиндифосфори 9 94209 10 бози-(ADP-ribose)-полімерази. 85. Спосіб за п. 81, який відрізняється тим, що вказаний інгібітор поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази являє собою нуклеїнову кислоту, яка повністю або частково кодує послідовність амінокислот поліаденозиндифосфорибози(ADP-ribose)-полімерази, або її комплемент. 86. Спосіб за будь-яким із пп. 81-85, який відрізняється тим, що рак ідентифікують як дефектний за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від гомологічної рекомбінації. 87. Спосіб за п. 86, який відрізняється тим, що рак ідентифікують як такий, що має фенотип, дефектний за BRCA1 або BRCA2. Даний винахід відноситься до способів індукції летальності ракових клітин, зокрема, ракових клітин, які є дефектними за репарацією двониткових розривів (double strand break, DSB, ДНР) ДНК, яка залежить від гомологічної рекомбінації (homologous recombination, HR). Ефективна репарація пошкоджень ДНК в клітинах заснована на механізмі виявлення пошкодження з подальшою передачею сигналів порушення до ефекторів, які розташовані далі по шляху передачі сигналу (downstream effectors), які зупиняють клітинний цикл в контрольних точках та усувають порушення ДНК. Клітини містять ряд різних сигнальних шляхів та ефекторів, які опосередкують репарацію різних типів пошкоджень ДНК. Ці шляхи включають ексцизійну репарацію основ (base excision repair, BER), репарацію двониткових розривів (ДНР) ДНК, яка залежить від гомологічної рекомбінації (HR), негомологічне з'єднання кінців (non-homologous end joining), ексцизійну репарацію нуклеотидів (nucleotide excision repair, NER) та репарацію неправильно спарених основ (mismatch repair, MMR). Взаємодія та взаємозалежність між різними шляхами репарації ДНК дотепер до кінця не відома. Автори даного винаходу встановили, що інгібування ексцизійної репарації основ, BER, наприклад, шляхом інгібування поліаденозиндифосфорибози-(ADP-ribose)-полімерази (PARP), є, селективно летальним для ракових клітин, дефектних за репарацією двониткових розривів ДНК, яка залежна від HR. Це має велике значення для лікування ракових захворювань. Одним з аспектів даного винаходу є застосування інгібітору ексицизійної репарації основ для отримання медикаменту, який призначений для лікування ракового захворювання у індивідуума, при якому ракові клітини є дефектними за активністю репарації двониткових розривів ДНК, яка залежить від HR. Спосіб лікування раку у індивідуума може включати: введення вказаному індивідууму інгібітору ексцизійної репарації основ, при цьому вказаний рак є дефектним за шляхом репарації двониткових розривів ДНК, яка залежить від HR. Рак може містити одну або декілька ракових клітин, які мають знижену здатність або які втратили здатність усувати пошкодження ДНК за вказаним другим шляхом репарації в порівнянні з нормальними клітинами. Шлях репарації двониткових розривів ДНК, яка залежить від HR, усуває двониткові розриви (double-strand breaks, DSB) в ДНК за допомогою гомологічного механізму відновлення безперерв ної спіралі ДНК (К.К. Khanna та S.P. Jackson, Nat. Genet. 27(3): 247-254 (2001)). Компоненти шляху репарації двониткових розривів ДНК, яка залежить від HR, включають ATM (NM_000051), RAD51 (NM_002875), RAD51L1 (NM_002877), RAD51C (NM_002876), RAD51L3 (NM_002878), DMC1 (NM_007068), XRCC2 (NM_005431), XRCC3 (NM_005432), RAD52 (NM_002879), RAD54L (NM_003579), RAD54B (NM_012415), Brca1 (NM_007295), Brca2 (NM_000059), RAD50 (NM_005732), MRE11A (NM_005590) та NBS1 (NM_002485). Інші білки, які беруть участь у шляху репарації двониткових розривів ДНК, яка залежить від HR, включають регуляторні чинники, зокрема, EMSY (Hughes-Davies та ін., Клітина, Том 115, сс. 523-535). Шлях ексцизійної репарації основ (base excision repair, BER) усуває однониткові розриви ДНК та ділянки відсутності декількох основ (зазори, gaps), а також видаляє специфічні пошкоджені основи. Зазори в спіралі ДНК заповнюються послідовною дією поліаденозиндифосфорибози-(ADPribose)-полімерази (PARP) та лігази. (К.К. Khanna та S.P. Jackson, Nat. Genet., 27(3): 247-254 (2001); F. Dantzer et al. Biochemistry 39, 7559-69 2000; J. H. Hoeijmakers, Nature 411 366-74 (2001)). Інгібітор ексцизійної репарації основ може інгібувати будьякій з компонентів шляху ексцизійної репарації основ. Компоненти шляху BER включають: UNG (NM_003362), SMUG1 (NM_014311), MBD4 (NM_003925), TDG (NM_003211), OGG1 (NM_002542), MYH (NM_012222), NTHL1 (NM_002528), MPG (NM_002434), NEIL1 (NM_024608), NEIL2 (NM_145043), NEIL3 (NM_018248), APE1 (NM_001641), APE2 (NM_014481), LIG3 (NM_013975), XRCC1 (NM_006297), ADPRT (PARP1) (NM_0016718) та ADPRTL2 (PARP2) (NP_005475). Інгібітори BER можна використовувати в поєднанні з агентом, який ушкоджує ДНК, при лікуванні ракових захворювань, які пов'язані з дефектом репарації двониткових розривів ДНК, яка залежить від HR. Агент, який ушкоджує ДНК, переважно використовують в такому дозуванні або в такому складі, які не є летальними для клітин за відсутності інгібітору BER. Придатні хіміотерапевтичні агенти, які ушкоджують ДНК, описані нижче. В деяких переважних варіантах реалізації можна використовувати інгібітор ферменту ссавців поліаденозиндифосфорибози-полімерази (PARP) (D'Amours et al., (1999) Biochem. J. 342: 249-268). Таким чином, інгібітор PARP можна використовувати для лікування раку, який є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Спосіб лікування рака, клітини якого є дефект 11 ними за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, у індивідуума може включати: введення інгібітору PARP вказаному індивідууму. Інгібітор PARP може бути використаний для отримання медикаменту, який використовують для лікування раку у індивідуума, при цьому вказаний рак є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Інгібітори PARP більш детально описані нижче. Ракове захворювання, яке є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, може містити або включати одну або декілька ракових клітин, які мають знижену здатність до репарації ДНР ДНК цим шляхом або повністю втратили цю здатність в порівнянні з нормальними клітинами, тобто активність шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, може бути зниженою або втраченою у однієї або декількох ракових клітин. Активність одного або декількох компонентів шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, може бути втраченою у однієї або декількох ракових клітин індивідуума, який страждає раковим захворюванням, які є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Компоненти шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, добре описані фахівцями в даній галузі (див., наприклад, Wood et al (2001) Science291 1284-1289) та включають компоненти, які перераховані вище. В деяких переважних варіантах реалізації даного винаходу ракові клітини можуть мати дефектний фенотип Brca1 та/або Brca2, тобто в ракових клітинах активність Brca1 та/або Brca2 може бути зниженою або втраченою. Ракові клітини з таким фенотипом можуть бути дефектними за Brca1 та/або Brca2, тобто експресія та/або активність Brca1 та/або Brca2 в ракових клітинах може бути зниженою або втраченою, наприклад, шляхом мутації або поліморфізму кодувальної нуклеїнової кислоти, або за допомогою мутації або поліморфізму гена, який кодує регуляторний чинник, наприклад, гена EMSY, який кодує регуляторний чинник Brca2 (Hughes-Davies et al., Cell, Vol 115, pp. 523535). Brca1 та Brca2 є відомими супресорами пухлин, алелі дикого типу яких, часто втрачені в пухлинах гетерозиготних носіїв (Jasin М. Oncogene. 2002 Dec 16; 21(58):8981-93; Tutt et al., Trends Моl Med. (2002)8(12):571-6). Зв'язок мутацій Brca1 та/або Brca2 з раком молочної залози детально описаний в літературі (Radice P J Exp Clin Рак Res. 2002 Sep; 21(3 Suppl):9-12). Також відомо, що ампліфікація гена EMSY, який кодує чинник, зв'язуючий Brca2, асоційована з раком молочної залози та раком яєчників. Крім того, носії мутацій в Brca1 та/або Brca2 мають підвищені ризики виникнення раку яєчника, простати та підшлункової залози. В деяких варіантах реалізації ракове захворювання індивідуума може бути заздалегідь ідентифіковано як рак, який є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. В інших варіантах реалізації спосіб згідно даного опису може містити операцію ідентифікації 94209 12 ракового захворювання у індивідуума як дефектного за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Рак можна ідентифікувати як ракове захворювання дефектне за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, наприклад, шляхом визначення активності шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, в одній або декількох ракових клітинах зразка, отриманого від індивідуума, або шляхом визначення активності одного або декількох компонентів вказаного шляху. Активність можна визначити у відношенні до нормальних (тобто неракових) клітин, переважно - з тієї ж самої тканини. Активність шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, можна визначити, шляхом вимірювання утворення фокусів, які містять Rad51 в ядрі, у відповідь на дію агентів, які ушкоджують ДНК, або інгібіторів PARP. В клітинах, дефектних на шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, не такі фокуси не утворюються. Присутність фокусів Rad51 можна визначити за допомогою стандартних імунофлуоресцентних способів. Інші способи визначення активності шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, можуть включати визначення чутливості до інфрачервоного випромінювання, до засобів хіміотерапії, зокрема, реагентів, які сприяють утворенню міжниткових поперечних зв'язків, до агентів, які індукують ДНР (інгібітори топоізомерази І та II), а також застосування вестерн-блотингу, імуногістологічного аналізу, аналізу хромосомних аномалій, аналізу ферментного зв'язування або зв'язування ДНК та аналізу з використанням плазмід. В деяких варіантах реалізації рак можна ідентифікувати як дефектний за шляхом репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, за наявністю в ракових клітинах індивідуума однієї або декількох видозмін, наприклад, поліморфізмів або мутацій в нуклеїновій кислоті, що кодує поліпептид, який є компонентом шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. Видозміни послідовності, зокрема, мутації та поліморфізми, можуть включати делецію, вставку або заміщення одного або декількох нуклеотидів в порівнянні з послідовністю нуклеотидів дикого типу. В деяких варіантах реалізації видозміна може бути ампліфікацією гена, наприклад, ампліфікацією гена EMSY (CAD22881; символ гена C11ORF30). Одна або декілька видозмін може мати місце в кодуючій або некодуючій області послідовності нуклеїнових кислот та може знижувати або усувати експресію або функцію поліпептиду компоненту шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. Іншими словами, видозмінена нуклеїнова кислота може кодувати видозмінений поліпептид, у якого зменшена або втрачена активність, або може кодувати поліпептид дикого типа, який експресується на низькому рівні, або не експресується в клітині, наприклад, через зміну активності регуляторного елемента. Видозмінена нуклеїнова кислота може мати одну, дві, три, чотири або більше мутацій або поліморфізмів в порівнянні з послідовністю дикого типу. Наявність одного або декількох видозмін в нуклеїновій кислоті, яка кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, можна ви 13 значити за наявністю в одній або декількох клітинах контрольного зразка кодуючої послідовності нуклеїнової кислоти, яка містить одну або декілька мутацій або поліморфізмів, або за наявності видозміненого поліпептидного компоненту, який кодується вказаною послідовністю нуклеїнової кислоти. Існують різні способи визначення наявності або відсутності в зразку, який отриманий від індивідуума, конкретної послідовності нуклеїнової кислоти, наприклад, послідовності нуклеїнової кислоти, яка містить мутацію або поліморфізм, що зменшує або пригнічує експресію або активність компоненту шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. Крім того, виконавши секвенування нуклеїнової кислоти індивідуума або зразка, можна зберегти інформацію та проводити подальші дослідження без використовування самої початкової нуклеїнової кислоти. Так, наприклад, при скануванні бази даних за послідовностями нуклеїнових кислот за допомогою програмного забезпечення для аналізу послідовностей, можна визначити наявність зміни або мутації послідовності. Способи згідно деяких аспектів даного винаходу можуть включати визначення зв'язування олігонуклеотидного зонда з нуклеїновою кислотою, яку отримують із зразка, наприклад, з геномної ДНК, PHK або кДНК. Зонд може містити послідовність нуклеотидів, яка специфічно зв'язується з послідовністю нуклеїнової кислоти, яка містить одну або декілька мутацій або поліморфізмів, та не зв'язується специфічно з послідовністю нуклеїнових кислот, яка не містить однієї або декількох мутацій або поліморфізмів, або навпаки. Олігонуклеотидний зонд може містити мітку, при цьому зв'язування зонда можна визначити за наявністю вказаної мітки. Спосіб може включати гібридизацію одного або декількох (наприклад, двох) олігонуклеотидних зондів або праймерів, щоб визначити нуклеїнову кислоту. Якщо нуклеїнова кислота є двонитковою ДНК, гібридизації звичайно передує денатурація, що забезпечує отримання однониткової ДНК. Гібридизація може бути частиною процедури полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР) або частиною процедури зондування без застосування ПЛР. Прикладом процедури є комбінація ПЛР та гібридизація в умовах зниженої специфічності. Зв'язування зонда з цільовою нуклеїновою кислотою (наприклад, з ДНК) можна визначити за допомогою безлічі способів, які знаходяться у розпорядженні фахівців в даній галузі техніки. Так, наприклад, зонди можуть мати радіоактивну, флуоресцентну або ферментну мітку. Інші способи, які не використовують мічення зонда, включають дослідження поліморфізму довжини рестрикційних фрагментів, ампліфікацію за допомогою ПЛР, розщеплювання РНК-азою та алель-специфічне олігонуклеотидне зондування. При зондуванні може використовуватися стандартний спосіб саузернблотингу. Так, наприклад, ДНК можна екстрагувати з клітини та розщепити з різними рестрикційними ферментами. Потім можна розділити рестрикційні фрагменти за допомогою електрофореза на агарозовому гелі, провести їх денатурацію та перенести на фільтр з нітроцелюлози. Мічений зонд 94209 14 можна гібридизувати з фрагментами ДНК на фільтрі та визначити зв'язування. Фахівці в даній галузі техніки можуть використовувати придатні умови бажаної специфічності реакції для селективної гібридизації з урахуванням таких чинників, як довжина олігонуклеїдів, склад основ, температура та т.п. Придатні умови для селективної гібридизації олігонуклеотидів, які містять 17-30 основ, включають гібридизацію протягом ночі при 42°С в 6Х SSC та відмивання в 6Х SSC при послідовному підвищенні температури від 42°С до 65°С. Інші придатні умови та протоколи описані в роботах Molecular Cloning: а Laboratory Manual: 3rd edition, Sambrook & Russell (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press NY та Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons (1992). Нуклеїнова кислота, яка може бути геномною ДНК, РНК, кДНК або їх ампліфікованою областю, може бути секвенована для ідентифікації або визначення наявності поліморфізму або мутації. Поліморфізм або мутація можуть бути ідентифіковані шляхом порівняння секвенованої послідовності з послідовністю компоненту (шляхи репарації), яка отримана з бази даних як описано вище. Зокрема, можна визначити присутність одного або декількох поліморфізмів або мутацій, які викликають зміну або втрату функції поліпептидного компоненту і, отже, шляхи репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, в цілому. Секвенування може бути виконане одним із стандартних способів. Секвенування ампліфікованого продукту може включати, наприклад, осадження ізопропанолом, ресуспендування та секвенування за допомогою набору для секвенування TaqFS+ Dye terminator. Додаткові продукти можуть бути піддані електрофорезу в секвенаторі ДНК ABI 377, а дані - проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Sequence Navigator. Для ампліфікації області, яка представляє інтерес, в послідовності нуклеїнових кислот, наприклад, частини послідовності, в якій передбачається наявність мутацій або поліморфізмів, можна використовувати специфічну реакцію ампліфікації, зокрема, ПЛР з використанням однієї або декількох пар праймерів. Потім можна секвенувати ампліфіковану нуклеїнову кислоту, як описано вище, та/або проаналізувати її яким-небудь іншим способом, щоб визначити наявність або відсутність мутації або поліморфізму, які зменшують або повністю пригнічують експресію або активність компоненту шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. Придатні реакції ампліфікації включають полімеразно-ланцюгову реакцію (ПЛР) (див. наприклад, в "PCR protocols; A Guide to Methods and Applications", Eds. Innis et al., 1990, Academic Press, New York, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR technology, Stockton Press, NY, 1989, та Ehrlich et al., Science, 252:1643-1650, (1991)). В деяких варіантах реалізації рак може бути ідентифікований як дефектний за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, шляхом визначення рів 15 ня експресії або активності позитивного або негативного регулятора компоненту шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, зокрема, EMSY. Рівні експресії можна визначити, наприклад, за допомогою вестерн-блотингу, ELISA (твердофазного імуноферментного аналізу), RT-PCR (ревертазо-полімеразноланцюгової реакції), гібридизації нуклеїнової кислоти або каріотипічного аналізу. В деяких переважних варіантах реалізації індивідуум є гетерозиготним за однією або декількома видозмінами, зокрема, мутаціями та поліморфізмами, у Brca1 та/або Brca2 або у їх регуляторі. Спосіб виявлення видозміни у Brca1 та Brca2 добре відомий фахівцям в даній галузі техніки та описаний, наприклад, в ЕР699754, ЕР705903, Neuhausen S.L. and Ostrander Е.А. Genet. Test (1992) 1, 75-83; Chappnis, P.O. and Foulkes, W.D. Cancer Treat Res (2002) 107, 29-59; Janatova M et al Neoplasma. 2003: 50(4):246-50; Jancarkova N Ceska Gynekol. 2003 68(1): 11-6). Визначення ампліфікації зв'язуючого фактора Brca2 EMSY описали Hughes-Davies et al., Cell, 115 523-535. Мутації та поліморфізми, пов'язані з раком, також можуть бути знайдені на рівні білка за присутністю варіантного (наприклад, мутантного або алельного варіанту) поліпептиду. Спосіб ідентифікації ракової клітини в зразку, який отримали від індивідуума, як дефектної за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, може включати контакт зразка із специфічним зв'язувальним агентом, направленим проти варіантної форми (наприклад, варіанта мутанту) поліпептидного компоненту шляху, та визначення зв'язування специфічного зв'язувального агента із зразком. Зв'язування специфічного зв'язувального агента із зразком може бути показником присутності видозміненого поліпептидного компоненту шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, в клітині зразка. Переважні специфічні зв'язувальні молекули для застосування в аспектах даного винаходу включають антитіла та їх фрагменти або їх похідні ("молекули, подібні до антитіл"). Реакційну здатність зв'язувального агента, зокрема, антитіла по відношенню до нормальних та досліджуваних зразків можна визначити будьякими придатними засобами. Одна з можливостей полягає в міченні індивідуальними репортерними групами. Репортерні групи можуть прямо або побічно генерувати сигнали, які можуть бути визначені та переважно виміряються. Зв'язок репортерних груп може бути прямим або непрямим, ковалентним, наприклад, за допомогою пептидного зв'язку, або нековалентним. З'єднання за допомогою пептидного зв'язку може бути результатом експресії рекомбінантного гена, який спільно кодує зв'язувальну молекулу (наприклад, антитіло) та репортерну групу. Спосіб визначення зв'язування не є предметом даного винаходу, та фахівці в даній галузі техніки можуть вибрати придатний спосіб згідно їх перевагам та загальним знанням. Ракові клітини в загальному випадку відрізняються від нормальних клітин аномальною пролі 94209 16 ферацією та звичайно утворюють в організмі індивідуума, який страждає раковим захворюванням, кластери або пухлини. Ракове захворювання, яке є дефектним за шляхом репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, згідно даного опису, може включати будь-який тип щільного раку або злоякісної лімфоми, зокрема, лейкемію, саркому, рак шкіри, рак сечового міхура, рак молочної залози, рак матки, рак яєчника, рак простати, рак легені, рак ободової та прямої кишки, рак шийки матки, рак печінки, рак голови та шиї, рак стравоходу, рак підшлункової залози, рак нирки, рак шлунку та рак головного мозку. В деяких переважних варіантах реалізації ракове захворювання може бути раком молочної залози, яєчника, підшлункової залози або простати. Ракові захворювання можуть бути сімейними або спорадичними. Зразок, який отримали у індивідуума, може бути зразком тканини, яка містить одну або декілька клітин, наприклад, біопсію з ракової тканини, як описано вище, або неракову тканину, наприклад, для застосування як контрольного зразка. Способи згідно винаходу можуть бути використані для обстеження індивідуума, який страждає раковим захворюванням, наприклад, для визначення терапевтичного лікування. Спосіб обстеження індивідуума, який страждає раковим захворюванням, може включати: ідентифікацію ракової клітини, яку отримали від індивідуума, як дефектної за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, в порівнянні з нормальними клітинами, і вибір інгібітору шляху BER, який придатний для введення вказаному індивідууму. В деяких переважних варіантах реалізації інгібітор шляху BER є інгібітором PARP. Інгібітори PARP більш детально описані нижче. Спосіб дослідження ракового захворювання може включати: ідентифікацію ракової клітини, яку отримали у індивідуума, як дефектної за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, в порівнянні з нормальними клітинами, і вибір інгібітору PARP, який придатний для введення вказаному індивідууму. В деяких переважних варіантах реалізації, ракова клітина, яка ідентифікована як дефектна за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR, може мати дефектний фенотип Brca1 або Brca2. Індивідуум може мати схильність до рака, який є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Способи та засоби даного винаходу особливо корисні для таких індивідуумів. Індивідуум може бути, наприклад, гетерозиготним за мутацією або поліморфізмом нуклеїнової кислоти, яка кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, наприклад, нуклеїнової кислоти, яка кодує компоненти описані вище. Спосіб лікування раку у індивідуума може включати: введення інгібітору шляху BER вказаному індивідууму, при цьому вказаний індивідуум є гетерозиготним за мутацією або поліморфізмом в гені, який кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, яка 17 залежить від HR. Інгібітор BER може бути використаний для отримання медикаменту, який використовують для лікування раку у індивідуума, який є гетерозиготним за мутацією в гені, що кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. В деяких переважних варіантах реалізації, індивідуум, який є гетерозиготним за мутацією або поліморфізмом в гені, який кодує компонент шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, може бути гетерозиготним за мутацією або поліморфізмом в Brca1 та/або Brca2. Інгібітор BER, придатний для застосування в описаному тут способі, може бути будь-якою сполукою або об'єктом, зокрема, малою органічною молекулою, пептидом або нуклеїновою кислотою, які інгібують, зменшують або блокують активність одного або декількох компонентів шляху BER. В деяких переважних варіантах реалізації інгібітор BER може зменшувати або блокувати активність ферменту поліаденозиндифосфорибозаполімерази (PARP). Термін PARP, який використовується в даному описі, відноситься до PARP1 (ЄC 2.4.2.30, Genbank No: М32721) та/або PARP2 (Ame et al., J. Biol. Chem. (1999) 274 15504-15511; Genbank No: AJ236912), якщо з контексту не випливає іншого. Приклади сполук, які є відомими інгібіторами PARP та які можуть бути використані відповідно до даного винаходу, включають: 1. Нікотинаміди, зокрема, 5-метилнікотинамід та амідоксим O-(2-гідрокси-3-піперидинопропіл)-3карбонової кислоти, а також їх аналоги та похідні. 2. Бензаміди, включаючи 3-заміщені бензаміди, зокрема, 3-амінобензамід, 3-гідроксибензамід, 3-нітрозобензамід, 3-метоксибензамід та 3хлорпрокаїнамід, 4-амінобензамід, 1, 5-ди[(3карбамоїлфеніл)амінкарбонілокси]-пентан, а також їх аналоги та похідні. 3. Ізохіноліни та дигідроізохіноліни, включаючи 2Н-ізохінолін-1-они, 3H-хіназолін-4-они, 5-заміщені дигідроізохіноліни, зокрема, 5-гідроксидигідроізохінолінон, 5-метилдигідроізохінолінон та 5-гідроксіізохінолінон, 5-аміноізохінолін-1-он, 5дигідроксіізохінолінон, 3,4-дигідроізохінолін-1(2Н)они, зокрема, 3,4-дигідро-5-метоксіізохінолін1(2Н)-он та 3,4-дигідро-5-метил-1(2Н)ізохінолінон, ізохінолін-1(2Н)-они, 4,5-дигідроімідазо[4,5,1і,j]хінолін-6-они, 1,6,-нафтиридин-5(6Н)-они, 1,8нафталіміди, зокрема, 4-аміно-1,8-нафталімід, ізохінолінон, 3,4-дигідро-5-[4-1(1піперидиніл)бутокси]-1(2Н)-ізохінолінон, 2,3дигідробензо[де]ізохінолін-1-он, 1-11b-дигідро[2Н]бензопірано[4,32-де]ізохінолін-3-он та тетрациклічні лактами, які включають бензопіраноізохіноліни, зокрема, бензопірано[4,3,2-де]ізохінолінон, а також їх аналоги та похідні. 4. Бензоімідазоли та індоли, включаючи бензоксазол-4-карбоксаміди, бензоімідазол-4карбоксаміди, зокрема, 2-заміщені бензоксазол-4карбоксаміди та 2-заміщені бензоімідазол-4карбоксаміди, зокрема, 2-арилбензоімідазол-4карбоксаміди та 2-циклоалкілбензоімідазол-4карбоксаміди, включаючи 2-(4-гідроксифеніл)бензоімідазол-4-карбоксамід, хіноксалінкарбокса 94209 18 міди, імідазопіридинкарбоксаміди, 2-феніліндоли, 2-заміщені бензоксазоли, зокрема, 2фенілбензоксазол та 2-(3-метоксифеніл)бензоксазол, 2-заміщені бензоімідазоли, зокрема, 2-фенілбензоімідазол та 2-(3-метоксифеніл)бензоімідазол, 1,3,4,5-тетрагідроазепіно[5,4,3сd]індол-6-он, азепініндоли та азепініндолони, зокрема, 1,5-дигідроазепін[4,5,6-сd]індолін-6-он та дигідродіазепініндолінон, 3-заміщені дигідродіазепініндолінони, зокрема, 3-(4-трифторметилфеніл)дигідродіазепініндолінон, тетрагідродіазепініндолінон та 5,6,-дигідроімідазо[4,5,1-j,k] [ 1,4]бензодіазепін-7(4Н)-он, 2-феніл-5,6-дигідроімідазо[4,5,1-j,k] [1,4]бензо-діазепін-7(4Н)-он та 2,3дигідроізоіндол-1-он, а також їх аналоги та похідні. 5. Фталазин-1(2Н)-они та хіназолінони, зокрема, 4-гідроксихіназолін, фталазинон, 5-метокси-4метил-1(2) фталазинони, 4-заміщені фталазинони, 4-(1-піперазиніл)-1(2Н)-фталазинон, тетрациклічні бензопірано[4,3,2-де]-фталазинони та тетрациклічні інден-[1,2,3-де]фталазинони та 2-заміщені хіназоліни, зокрема, 8-гідрокси-2-метилхіназолін-4(3Н)-он, трициклічні фталазинони та 2амінофталгідразид, а також їх аналоги та похідні. 6. Ізоіндолінони а також їх аналоги та похідні. 7. Фенантридини та фенантридинони, зокрема, 5[Н]фенантридин-6-он, заміщені 5[Н]фенантридин-6-они, зокрема, 2-,3-заміщені 5[Н]фенантридин-6-они та сульфонамідні/карбамідні похідні 6(5Н)фенантридинонів, тієн-[2,3-с]ізохінолони зокрема, 9-амінтієн-[2,3-з]-ізохінолон та 9-гідрокситієн-[2,3-з]-ізохінолон, 9-метокситієн[2,3-с]-ізохінолон та N-(6-оксо-5,6дигідрофенантридин-2-іл)-2-(N,N-диметиламін)ацетамід, заміщені 4,9-дигідроциклопента[lmn]фенантридин-5-они, а також їх аналоги та похідні. 8. Бензопірони, зокрема, 1,2-бензопірон, 6нітрозобензопірон, 6-нітрозо-1,2-бензопірон та 5йодо-6-амінобензопірон, а також їх аналоги та похідні. 9. Похідні ненасичених гідроксамових кислот, зокрема, O-(3-піперидино-2-гідрокси-1-пропіл)нікотиновий амідоксим, а також їх аналоги та похідні. 10. Піридазини, які включають конденсовані піридазини, а також їх аналоги та похідні. 11. Інші сполуки, зокрема, кофеїн, амінофілін та тимідин, а також їх аналоги та похідні. Додаткові інгібітори PARP описані, наприклад, у US6,635,642, US5,587,384, WO2003080581, WO2003070707, WO2003055865, WO2003057145, WO2003051879, US6514983, WO2003007959, US6426415, WO2003007959, WO2002094790, WO2002068407, US6476048, WO2001090077, WO2001085687, WO2001085686, WO2001079184, WO2001057038, WO2001023390, WO2001021615, WO2001016136, WO2001012199, W09524379, Banasik et al. J. Biol. Chem., 267:3, 1569-75 (1992), Banasik et al., Molec. Cell. Biochem. 138:185-97 (1994)), Cosi (2002) Expert Opin. Ther. Patents 12 (7), Southan & Szabo (2003) Curr Med Chem 10 321340 та в наведених там посиланнях. Один з переважних класів придатних інгібіторів PARP включає фталазинони, зокрема, 1(2Н)фталазинон, та їх похідні, як описано у 19 WO02/36576. Зокрема, сполуки формули: а також їх ізомери, солі, сольвати, хімічно захищені форми та проліки можуть бути використані для інгібування PARP, де: А та В спільно являють собою необов'язково заміщене конденсоване ароматичне ядро, RC являє собою -L-RL, де L має формулу: (CH2)n1-Qn2-(CH2)n3-, де n1, n2 та n3 вибирають з групи, яка містить числа 0, 1, 2 та 3, так, щоб сума n1, n2 та n3 дорівнювала 1, 2 або 3, a Q вибирають з групи, яка включає О, S, NH, С(=O) або -CR1R2-, де R1 та R2 незалежно вибирають з групи, яка включає водень, галоген, або необов'язково заміщений C1-7 алкіл, або можуть спільно з атомом вуглецю, до якого вони приєднані, утворювати С3-7 циклічну алкільну групу, яка може бути насиченою (С3-7 циклоалкільна група) або ненасиченою (С3-7 циклоалкенільна група), або один з R1 та R2 може бути приєднаний до атома R1 з утворенням ненасиченої С3-7 циклоалкенільної групи, яка містить атоми вуглецю, до яких приєднані R1 та R2 у Q, -(СН2)n3(якщо присутній) та частину RL; a RL являє собою С5-20 арил, який необов'язково заміщений, а RN вибирають з групи, яка включає водень, необов'язково заміщений С1-7 алкіл, С3-20 гетероцикліл, та С5-20 арил, гідроксил, простий ефір, нітро, амін, амід, тіол, тіоефір, сульфоксид та сульфон. Переважно сполуку формули: або її ізомер, сіль, сольват, хімічно захищену форму або проліку можна використовувати для інгібування PARP, де: А та В спільно являють собою необов'язково заміщене конденсоване ароматичне ядро, RC являє собою -CH2-RL; RL являє собою необов'язково заміщений феніл, а RN Є воднем. В деяких переважних варіантах реалізації для інгібування PARP можна використовувати сполуку, яка має структуру KU-0058684 або KU-0058948, показану на фігурі 2, або її ізомер, сіль, сольват, хімічно захищену форму або проліку. Придатні інгібітори PARP є комерційно досту 94209 20 пними або можуть бути синтезовані відомими способами з вихідних матеріалів, які є відомими (див., наприклад, Suto et al. Anticancer Drug Des. 6:10717 (1991)). Інший клас інгібіторів ексцизійної репарації основ включає пептидні фрагменти компонентів шляху BER. Наприклад, пептидні фрагменти послідовності PARP можна використовувати для інгібування PARP та тим самим знизити або подавити активність шляху BER. Пептидні фрагменти можна генерувати повністю або частково за допомогою хімічного синтезу, використовуючи опубліковані послідовності компонентів, наприклад, опубліковану послідовність PARP (обліковий номер: NM_001618). Пептидні фрагменти можна легко отримати завдяки відомим стандартним способам рідинного або, переважно твердофазного пептидного синтезу, загальні описи яких широко доступні (див., наприклад, J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, Practice Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984); та Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California), або їх можна отримати в розчині рідіннофазним способом або комбінацією твердофазного способу, рідиннофазного способу та хімії розчинів, наприклад, отримавши спочатку відповідну пептидну частину, а потім, якщо бажано та необхідно, після видалення присутніх захисних груп ввести залишок X шляхом реакції з відповідною карбоновою або сульфоновою кислотою або її реактивним похідним. Інші сполуки-кандидати для інгібування компоненту шляху BER, зокрема, PARP, можуть бути отримані на основі моделювання тривимірної структури вказаного компоненту з використанням раціональної будови препарату, щоб забезпечити відповідні характеристики форми, розміру та заряду молекул сполук-кандидатів. Інгібітор-кандидат може бути, наприклад, "функціональним аналогом" пептидного фрагмента або іншої сполуки, яка інгібує вказаний компонент. Функціональний аналог має таку ж функціональну активність, що й пептид або інша відповідна сполука, тобто може перешкоджати взаємодії або пригнічувати активність компоненту шляху репарації ДНК. Приклади таких аналогів включають хімічні сполуки, які моделюють так, щоб забезпечити схожість з тривимірною структурою компоненту в зоні, яка контактує з іншим компонентом, та особливо з розташуванням залишків ключових амінокислот відповідно до їх вигляду. Наступний клас придатних інгібіторів шляху BER включає кодувальну частину нуклеїнових кислот або всю послідовність амінокислот компоненту шляху BER, зокрема, PARP (обліковий номер: NM_001618), або їх комплемент, які інгібують активність або функцію шляхом негативної (знижувальної) регуляції виробництва активного поліпептиду. Інгібування активності PARP можна визначити за допомогою звичайних способів, включаючи, наприклад, дот-блотинг (Affar EB et al., Anal Biochem. 1998;259(2):280-3), та аналізи BER, які 21 виміряють пряму активність PARP для формування ланцюгів поліаденозиндифосфорибози, наприклад, за допомогою радіоактивних аналізів із застосуванням субстрату NAD, міченого тритієм, або антитіл, специфічних для полімерних ланцюгів, які сформовані активністю PARP (K.J. Dillon et al., Journal Biomolecular Screening, 8(3): 347-352 (2003). Так, наприклад, експресія компоненту шляху BER може бути інгібованою за допомогою антисмислового методу або інтерференції PHK (RNAi). Застосування таких підходів до знижувальної регуляції генної експресії на даний час добре відоме в даній галузі техніки. Антисмислові олігонуклеотиди можуть бути сформовані для гібридизації з комплементарною послідовністю нуклеїнової кислоти, перед-мРНК або зрілою мРНК, щоб чинити вплив на виробництво компоненту шляху ексцизійної репарації основ так, щоб зменшити його експресію або запобігти їй повністю або практично повністю. Окрім забезпечення кодувальної послідовності антисмислові способи можуть бути направлені на дію на контрольні послідовності гена, наприклад, у фланкуючий послідовності 5', при цьому антисмислові олігонуклеотиди можуть блокувати функцію послідовностей, які контролюють експресію. Конструкція антисмислових послідовностей та їх застосування описано, наприклад, в роботах Peyman and Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990) та Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:329-376 (1992). Олігонуклеотиди можна отримати in vitro або ex vivo для подальшого введення, або антисмислову PHK можна отримати in vivo в клітинах, в яких бажана знижувальна регуляція. Так, наприклад, двониткову ДНК можна помістити під контролем промотору у "зворотній орієнтації" так, щоб транскрипція антисмислової нитки ДНК утворювала РНК, яка є компліментарною до нормальної мРНК, яка транскрибована із смислової нитки цільового гена. Припускають, що потім комплементарна антисмислова послідовність PHK зв'язується з мРНК, утворюючи дуплекс, який інгібує трансляцію ендогенної мРНК, яка транскрибована з цільового гена в білок. До теперішнього часу не встановлено, як реально діє цей механізм. Проте функціонування такого механізму є підтвердженим фактом. Немає необхідності використовувати повну послідовність, яка відповідає кодувальній послідовності, в зворотній орієнтації. Наприклад, можна використовувати фрагменти достатньої довжини. Відбір фрагментів різних розмірів та з різних частин кодувальних або фланкуючих послідовностей гена для оптимізації рівня антисмислового інгібування є стандартною задачею для фахівця в даній галузі техніки. При цьому може виявитися переважним включення ініціюючого метионінового кодону ATG, і, можливо, одного або декількох нуклеотидів, які розташовані за ініціюючим кодоном. Придатний фрагмент може містити близько 14-23 нуклеотидів, наприклад, близько 15,16 або 17. Альтернативою антисмисловому способу є використовування повної або часткової копії цільового гена, інсертованої у «смисловому положенні», 94209 22 тобто, який має таку ж орієнтацію, як цільовий ген, щоб досягти зменшення експресії цільового гена шляхом ко-супресії; Angell & Baulcombe (1997) EMBO Journal 16,12:3675-3684; та Voinnet & Baulcombe (1997) Nature 389: pg 553). Виявилося, що двониткова PHK (днРНК) є ще більш ефективною для пригнічення генів, ніж смислова та антисмислова нитки по окремості (Fire A. et al., Nature 391 (1998)). Пригнічення за допомогою днРНК є ген-специфічним та часто називається інтерференцією PHK (РНКі). Інтерференція PHK є двохетапним процесом. Спочатку днРНК розщеплюють в клітині, щоб отримати короткі інтерферуючі PHK (кіРНК) завдовжки приблизно 21-23 nt з кінцевим фосфатом 5' та короткими виступами 3' (~2 nt). кіРНК специфічно направлені на руйнування відповідної послідовності мРНК (Zamore P.D. Nature Structural Biology, 8, 9, 746-750 (2001). PHKi можна також ефективно індукувати за допомогою хімічно синтезованих дуплексів кіРНК тієї ж самої структури з виступаючими кінцями 3' (Zamore PD et al., Cell, 101, 25-33 (2000)). Показано, що синтетичні дуплекси кіРНК специфічно пригнічують експресію ендогенних та гетерогенних генів в широкому спектрі клітинних ліній ссавців (Elbashir SM. et al. Nature, 411, 494-498 (2001)). Інша можливість полягає в застосуванні нуклеїнової кислоти, яка при транскрипції виробляє рибозим, здатний розрізати нуклеїнову кислоту в специфічному сайті, що також чинить корисний вплив на експресію гена. Посилання на рибозими приведені в роботах Kashani-Sabet and Scanlon, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(3): 213-223, та Mercola and Cohen, 1995, Cancer Gene Therapy, 2(1), 47-59. Способи згідно винаходу можуть включати введення індивідууму інгібітору BER, зокрема, інгібітору PARP. Це можна проводити після ідентифікації індивідуума як страждаючого раковим захворюванням, клітини котрого дефектні за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Активну сполуку можна вводити окремо, проте, переважно представляти її у формі фармацевтичного складу (наприклад, препарату), який містить щонайменше одну активну сполуку, як описано вище, разом з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, ад'ювантами, зв'язувальними агентами, розріджувачами, наповнювачами, буферами, стабілізаторами, консервантами, змащувальними агентами або іншими матеріалами, добре відомими фахівцям, а також, можливо, з іншими терапевтичними або профілактичними агентами. Фармацевтичні склади, інгібітори ексцизійної репарації основ, які містять, як визначено вище, наприклад, інгібітор, змішаний з одним або декількома фармацевтично прийнятними носіями, зв'язувальними агентами, буферами, ад'ювантами, стабілізаторами або іншими матеріалами, вказаними в даному описі, можуть бути використані в способах згідно із даним винаходом. Термін "фармацевтично прийнятні", який використовується в даному описі, відноситься до сполук, матеріалів, складів та/або лікарських 23 форм, які згідно ретельної медичної оцінки є придатними для застосування у контакті з тканинами суб'єкта (наприклад, людини) без надмірної токсичності, роздратування, алергічної реакції або інших проблем або ускладнень відповідно до розумного співвідношення між вигодою та ризиком. Крім того, всі носії, зв'язувальні агенти та т.і. повинні бути "прийнятними" з погляду сумісності з іншими інгредієнтами складу. Прийнятні носії, зв'язувальні агенти та т.і. можна знайти в стандартній фармацевтичній літературі, наприклад у Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990. Склади можна зручно представити в одинарній дозованій формі та одержувати будь-якими способами, добре відомими фахівцям в галузі фармацевтики. Такі способи включають операцію об'єднання активної сполуки з носієм, який може містити один або декілька допоміжних інгредієнтів. В загальному випадку препарати одержують шляхом рівномірного та ретельного перемішування активної сполуки з рідкими носіями, з тонко подрібненими твердими носіями або з тими та іншими, а потім, якщо необхідно, формують продукт. Препарати можуть мати форму рідин, розчинів суспензій, емульсій, еліксирів, сиропів, таблеток, коржиків, гранул, порошків, капсул, облаток, пілюль, ампул, свічок, вагінальних супозиторіїв, мазей, гелів, паст, кремів, спреїв, пін, лосьйонів, масел, болюсів, електуаріїв або аерозолів. Інгібітор BER або фармацевтичний склад, який містить вказаний інгібітор, можна вводити суб'єкту будь-яким зручним способом, системно/периферично або в область бажаної дії, включаючи, зокрема, але без обмеження, пероральний, (наприклад, шляхом ковтання), топічно (у тому числі, трансдермально, інтраназально, окулярний, трансбукально та сублінгвально), пульмонально (наприклад, шляхом інгаляційної або інсуфляційної терапії, зокрема, за допомогою введення аерозоля, наприклад, через рот або ніс), ректально, вагінально, парентерально, наприклад, шляхом ін'єкції, у тому числі підшкірно, внутрішньошкірно, внутрішньом'язево, внутрішньовенно, внутрішньоартеріально, внутрішньосерцево, інтратекально, інтраспінально, інтракапсулярно, субкапсулярно, інтраорбітально, інтраперітонеально, інтратрахеально, субкутикулярно, інтраартикулярно, субарахноїдально та інтрастернально, а також шляхом імплантації депо, наприклад, підшкірно або внутрішньом'язево. Препарати, придатні для перорального введення (наприклад, шляхом ковтання) можуть бути представлені як дискретні дозовані форми, зокрема, капсули, облатки або таблетки, які містять певну дозу активної сполуки, а також у формі гранул, розчину або суспензії у водній або неводній рідині, рідкої емульсія типу "масло у воді" або "вода в маслі", болюса, електуарію або пасти. Таблетку можна виготовити звичайними способами, наприклад, пресуванням або литвом, можливо, з додаванням одного або декількох додаткових інгредієнтів. Пресовані таблетки можна отримати шляхом пресування у відповідному уста 94209 24 ткуванні активної сполуки в сипкій формі, зокрема, у формі порошку або гранул, можливо, змішаної з одним або декількома зв'язувальними (наприклад, з повідоном, желатином, гуміарабіком, сорбітом, трагакантом, гідроксипропілметилцелюлозою), з наповнювачами або розріджувачами (наприклад, з лактозою, мікрокристалічною целюлозою, гідрофосфатом кальцію), із змащувальними агентами (наприклад, із стеаратом магнію, тальком, кремнеземом), з дезінтегрантами (наприклад, з крохмалем гліколята натрію, зшитим повідоном, зшитою карбоксиметилцелюлозою), з поверхневоактивними, диспергувальними або змащувальними агентами (наприклад, з лаурилсульфатом натрію) та з консервантами (наприклад, метил-ргідроксибензоатом, пропіл-р-гідроксибензоатом, сорбіновою кислотою). Литі таблетки можна отримати за допомогою відповідного устаткування шляхом литва порошкоподібної сполуки, зволоженої інертним рідким розріджувачем. Таблетки можуть мати покриття або рифлення, а їх рецептура може забезпечувати сповільнене або регульоване виділення активної сполуки за рахунок використовування, наприклад, гідроксипропілметилцелюлози в пропорціях, які змінюються, щоб забезпечити бажаний профіль виділення. На таблетки можна нанести ентеросолюбільне покриття, щоб забезпечити часткове виділення в кишечнику, а не в шлунку. Препарати, придатні для парентерального введення (наприклад, шляхом ін'єкції, у тому числі шкірної, підшкірної, внутрішньом'язевої, внутрішньовенної та внутрішньошкірної ін'єкції), включають водні та неводні ізотонічні, непірогенні стерильні розчини для ін'єкцій, які можуть містити антиоксиданти, буфери, консерванти, стабілізатори, бактеріостати та розчинені речовини, які роблять препарат ізотонічним з кров'ю потенційного реципієнта, а також водні та неводні стерильні суспензії, які можуть включати суспендувальні агенти та загусники, ліпосоми або інші системи мікрочастинок, які забезпечують введення сполуки в компоненти крові або в один або декілька органів. Приклади придатних ізотонічних носіїв, призначених для застосування в таких препаратах, включають фізіологічний розчин для ін'єкцій, розчин Рінгера або лактат Рінгера для ін'єкцій. Звичайно концентрація вищезгаданої сполуки в розчині складає приблизно від 1 нг/мл до приблизно 10 мкг/мл, зокрема, приблизно від 10 нг/мл до приблизно 1 мкг/мл. Препарати можуть бути представлені в герметичних контейнерах, наприклад, в ампулах та флаконах, та можуть зберігатися в сублімованому (ліофілізованому) стані, який вимагає безпосередньо перед застосуванням додавання тільки стерильного рідкого носія, наприклад, води для ін'єкцій. Розчини та суспензії для ін'єкцій, які готуються безпосередньо перед введенням, можна отримати із стерильних порошків, гранул та таблеток. Препарати можуть мати форму ліпосом або систем мікрочастинок, які забезпечують введення сполуки в компоненти крові або в один або декілька органів. Слід розуміти, що відповідні дози активних сполук та склади, які містять активні сполуки, мо 25 жуть змінюватися для різних пацієнтів. Визначення оптимального дозування в загальному випадку включає знаходження балансу між рівнем терапевтичної користі та ризику або шкідливих побічних ефектів від лікування згідно із даним винаходом. Вибір рівня дозування залежить від безлічі чинників, включаючи, зокрема, але без обмеження, активність конкретної сполуки, спосіб введення, час введення, швидкість виділення сполуки, тривалість лікування, інші ліки, сполуки та/або матеріали, які приймають в комбінації, а також вік, стать та вагу пацієнта, його стан, загальне здоров'я та історію хвороби. Доза сполуки та спосіб введення кінець кінцем визначаються на розсуд лікаря, який проводить лікування, проте, в загальному випадку дозування повинне забезпечити отримання локальних концентрацій в області дії, які створюють бажаний ефект, не викликаючи істотних шкідливих або небезпечних побічних ефектів. Склади, які містять інгібітори шляху BER, можна використовувати в описаних тут способах в поєднанні із стандартними хіміотерапевтичними режимами, які ушкоджують ДНК ракової клітини. Придатні агенти можуть включати інгібітори активності топоізомерази І та II, зокрема, камптотецин, лікарські препарати, зокрема, іринотекан, топотекан та рубітекан, алкілювальні агенти, зокрема, темозоломід та DTIC (дакарбазин), а також платинові агенти, наприклад, цисплатин, цисплатиндоксорубіцин-циклофосфамід, карбоплатин та карбоплатин-паклітаксел. Інші придатні хіміотерапевтичні агенти включають доксорубіцин-циклофосфамід, капецитабін, циклофосфамід-метотрексат-5-фторурацил, доцетаксел, 5-фторурацил-епірубіцин-циклофосфамід, паклітаксел, вінорелбін, етопосид, пегильований ліпосомний доксорубіцин та топотекан. Лікування індивідуумів за допомогою таких агентів добре відоме фахівцям в даній галузі медицини. В рамках курсу лікування введення препарату in vivo можна проводити у формі однієї дози, безперервно або періодично (наприклад, роздільними дозами через відповідні інтервали часу). Способи визначення найефективніших засобів та доз для введення добре відомі фахівцям в даній галузі медицини та залежать від препарату, який використовують для лікування, мети лікування, цільової клітини, на яку направлена дія, та суб'єкта, який підлягає лікуванню. Однократні або багатократні введення можуть проводитися при рівні дози та схемі лікування, яка обирається лікарем, який проводить лікування. В загальному випадку придатна доза активної сполуки знаходиться у межах приблизно від 100 мкг до приблизно 250 мг на кілограм маси тіла суб'єкта на добу. Якщо активна сполука є сіллю, складним ефіром, пролікою та т.і., дозу, яка вводиться, розраховують на основі родоначальної сполуки, тому дозу, яку фактично вводять, пропорційно збільшують. Способи згідно із винаходом можна також використовувати для дослідження та оцінки ракового захворювання у індивідуума. Спосіб визначення активності шляху репарації 94209 26 ДНР ДНК, яка залежить від HR, при раковому захворюванні може включати: контакт інгібітору ексцизійної репарації основ із зразком ракових клітин, які отримали від індивідуума, який страждає захворюванням, і визначення рівня смертності клітин у вказаному зразку в порівнянні з контрольним зразком. Підвищення рівня смертності клітин в зразку по відношенню до контрольних клітин, які мають нормальні рівні активності репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, вказує на те, що рак є дефектним за репарацією ДНР ДНК, яка залежна від HR. Індивідуум може мати ракове захворювання, а зразок може бути зразком ракових клітин, який отримали, наприклад, за допомогою біопсії пухлини. В переважних варіантах реалізації інгібітор ексцизійної репарації основ є інгібітором PARP. При цьому спосіб оцінки репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, при раковому захворюванні може включати: контакт інгібітору PARP із зразком ракових клітин, які отримали у індивідуума, страждаючого раковим захворюванням, і визначення рівня клітинної смертності у вказаному зразку по відношенню до контрольного зразка. Підвищена чутливість інгібітору PARP в клітинах зразка в порівнянні з контрольними клітинами вказує на те, що рак є наслідком недостатньої активності репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. Підвищена чутливість до інгібіторів PARP може вказувати на те, що ракові клітини мають дефектний фенотип за Brca1 або Brca2, наприклад, зменшення або пригнічення експресії або активності Brca1 або Brca2. Ракове захворювання, ідентифіковане як дефект активності репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, наприклад, захворювання, пов'язане з дефектним фенотипом Brca1 або Brca2, може бути піддано терапії, спеціально направленої на такі захворювання. Придатна терапія може включати застосування агентів, які зшивають ДНК, зокрема, мітоміцину С, цисплатину або карбоплатину. Певні способи можна використовувати для прогнозування реакції ракового захворювання у індивідуума на лікування, направлене на HR, наприклад, на лікування, специфічне для ракових захворювань, які мають дефектний фенотип Brca1 або Brca2. Спосіб прогнозування реакції ракового захворювання у індивідуума на лікування раку, пов'язаного з дефектом репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, може включати: контакт інгібітору BER, наприклад, інгібітору PARP, із зразком ракових клітин, який отримали у пацієнта, який страждає раковим захворюванням, і визначення рівня клітинної смертності у вказаному зразку в порівнянні з контрольним зразком. Збільшення клітинної смертності в зразку в порівнянні з контрольними клітинами, які мають нормальні рівні активності репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, (тобто підвищена чутливість до інгібіторів PARP) вказує на те, що рак може бути сприйнятливим до вказаного лікування. 27 Засоби для лікування ракових захворювань, клітини яких мають дефект репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, наприклад, ракових захворювань, пов'язаних з дефектом Brca1 або Brca2, можуть включати, наприклад, агенти, які зшивають ДНК, зокрема, мітоміцин С, цисплатин або карбоплатин. Інші аспекти винаходу відносяться до застосування інгібітору репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, для лікування рака, який є дефектним за ексцизійною репарацією основ. Спосіб лікування ракового дефекту ексцизійної репарації основ у індивідуума може включати: введення вказаному індивідууму інгібітору шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR. Інгібітор шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, можна використовувати для отримання медикаменту, призначеного для лікування раку у індивідуума, при цьому вказаний рак є дефектним за ексцизійною репарацією основ. Інгібітор шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, може включати інгібітор одного або декількох компонентів шляху, як вказано вище. Придатні інгібітори включають інгібітори ATM. Інгібітор ATM може являти собою, наприклад, сполуку формули І: або її ізомер, сіль, сольват, хімічно захищену форму або проліку, де: Y являє собою O або S, R1 та R2 являє собою незалежно водень, необов'язково заміщену C1-7 алкільну групу, С3-20 гетероциклільну групу або С5-20 арильну групу, або можуть спільно з атомом азоту, до якого вони приєднані, утворювати необов'язково заміщене гетероциклічне ядро, яке містить від 4 до 8 атомів в ядрі, а R3 являє собою фенільну групу, яка приєднана до необов'язково заміщеної С5-20 карбоарильної групи за допомогою ефірного або тіоефірного містка, при цьому фенільна група і, необов'язково заміщена С5-20 карбоарильна група можуть бути зв'язані іншою містковою групою, яка зв'язана сусіднім ефірним або тіоефірним містком з обома групами таким чином, щоб утворювати С5-7 гетероцикл необов'язково заміщений киснем або сіркою, який злитий з фенільною групою та С5-20 карбоарильною групою, а фенільна група може також бути необов'язково заміщеною. Більш детально такі інгібітори описані в патентній заявці WO 03/070726. Інші інгібітори включають пептидильні фрагменти компонентів репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, та кодувальні нуклеїнові кислоти, як описано вище. 94209 28 Ракове захворювання може бути ідентифіковано за допомогою вищеописаного способу як дефектне за активністю BER. Далі аспекти даного винаходу ілюструються за допомогою посилань на прикладені фігури, описані нижче, та експериментальних прикладів, які не є обмежуючими. Інші аспекти та варіанти реалізації будуть очевидними для фахівців в даній галузі техніки. Різні параметри та характеристики винаходу описані вище. Щоб уникнути невизначеності заявляється, що всі комбінації та суб-комбінації цих параметрів та характеристик включені в об'єм даного винаходу. Всі документи, згадані в даному описі, включені в нього як посилання. Фігура 1 показує, що зниження рівня Parp1 зменшує життєздатність клітин мутантів за Brca1 та Brca2 в порівнянні з клітинами дикого типу. Фігура 2 показує інгібітори PARP KU0058684, KU0058948 та KU0051529 та значення їх IC50 по відношенню до ферментної активності PARP-1. Фігури 3 та 4 показують криві клоногенного виживання клітин під дією інгібіторів PARP. Фігура 3 показує Brca1 дикого типа (11СО:), гетерозиготні (Cre6:▲) та дефектні (Cre10:) клітини ES при безперервній дії інгібіторів PARP (KU0058684, верх; KU0058948, середина; KU0051529, низ). Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. Фігура 4 показує Brca2 дикого типа (D3:), гетерозиготні (Cre6:▲) та дефектні (Cre24:) клітини ES при безперервній дії інгібіторів PARP (KU0058684, верх; KU0058948, середина; KU0051529, низ). Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. Фігури 5 та 6 показують криві клоногенного виживання після дії KU0058684 протягом 1, 4 та 24 годин. Фігура 5 показує Brca1 дикого типа (11СО:), гетерозиготні (Cre6:▲) та дефектні (Cre10:) клітини ES після дії KU0058684 протягом 1 (верх), 4 (середина) та 24 годин (низ). Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. Фігура 6 показує Brca2 дикого типа (D3:), гетерозиготні (Cre6:▲) та дефектні (Cre24:) клітини ES після дії KU0058684 протягом 1 (верх), 4 (середина) та 24 годин (низ). Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. Фігури 7 та 8 показують, що інгібування PARP в мутантних клітинах BRCA-1 та BRCA-2, оброблених інгібітором PARP, призводить до збільшення затримки на етапі G2/M. Фігура 7 показує Brca1 дикого типа (11СО:верх) та мутантні клітини (Cre10:низ), які обробляли протягом 24 годин KU0058684 з концентрацією 0 нМ (зліва), 10 нМ (середина) або 1 мкМ (справа), та проаналізовані за допомогою FACS (fluorescent-activated cell sorter, клітинний сортер із збудженням флуоресценції). Фігура 8 показує Brca2 дикого типа (D3) та мутантні клітини (Cre24), які обробляли протягом 24 годин KU0058684 з концентрацією 0 нМ (зліва), 10 нМ (середина) або 1 мкМ (справа), та проаналізовані за допомогою FACS. 29 Фігура 9 показує результати кількісного аналізу фокусів Rad51, індукованих інгібуванням PARP в клітинах дикого типу, але не в дефектних клітинах Brca1 або Brca2. Фігура 10 показує результати нейтрального гельелектрофорезу поодиноких клітин (comet analysis) Brca2-/- VC8 та Brca2, комплементарних VC8-BAC. Обробка KU0058684 (1 мкМ) протягом 30 годин індукує значне збільшення ДНР ДНК, яке оцінюється за збільшенням хвостового моменту в клітинах Brca2-/-, тоді як у комплементарній клітинній лінії Brca2 істотного збільшення хвостового моменту не спостерігається. Усереднені дані 3 незалежних дослідів показані з +/- SEM (Standard Error Mean, стандартна помилка середнього значення) при підрахунку хвостового моменту для 50 поодиноких клітин в кожному досліді. Фігура 11 показує можливу модель селективного впливу інгібування PARP на мутантні клітини Brca1 та Brca2. Фігури 12 та 13 показують результати аналізу FACS фосфогістону Н3 для клітин ES. Фігура 12 показує результати аналізу FACS фосфогістону Н3 для Brca1 дикого типу (11СО:верх) та мутантних клітин (Cre10:) ES, а також для Brca2 дикого типу (D3) та мутантних клітин (Cre24), які обробляли протягом 24 годин KU0058684 з концентрацією 0 нМ (зліва), 10 нМ (середина) або 1 мкМ (справа) та проаналізованих за допомогою FACS. Фігура 13 показує результати аналізу FACS фосфогістону Н3 для клітин VC 8 та VC8BAC, які обробляли протягом 24 годин KU0058684 з концентрацією 0 мкМ, 100 нМ, 1 мкМ та 10 мкМ (зліва направо, відповідно). Фігури 14 та 15 показують аналіз впливу інгібування PARP в інших клітинах з недостатністю функції Brca1 та Brca2. Фігура 14 показує криві клоногенного виживання Brca2 дефектних (V-C 8:) та комплементарних (V-C8 ВАС+:▲) клітин при безперервній дії інгібіторів PARP (KU0058684: верх, KU0058948: середина та KU0051529: низ). Фігура 15 показує криві клоногенного виживання Brca2 дефектних (V-C8:) та комплементарних (V-C8 ВАС+: ▲) клітин після дії KU0058684 протягом 1 години (верх), 4 годин (середина) та 24 годин (низ). Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. Фігура 16 показує утворення пухлини в ксенотрансплантатах ES та вплив обробки KU0058684; пунктирна лінія - дикий тип з наповнювачем, товста суцільна лінія - дикий тип з препаратом KU0058684, суцільна лінія - дефектна Brca2 з наповнювачем, штрихова лінія - дефектні за Brca2 з KU0058684. Фігура 17 показує клональні криві виживання клітин з Brca1 дикого типу (МСР7-скрембльовані) і клітинз пригніченою експресією Brca1 (MCF7-3.23) при безперервній дії різних концентрацій інгібітору PARP KU0058684 протягом 12-14 днів. Показана залежність логарифма частки виживання клітин від логарифма концентрації інгібітору. Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. 94209 30 Фігура 18 показує клональні криві виживання клітин Brca1 дикого типа (MCF7- скрембльовані) та клітин з пригніченою експресією Brca1 (MCF7-3.23) при безперервній дії різних концентрацій інгібітору PARP KU0051529 протягом 12-14 днів. Показана залежність логарифма частки виживання клітин від логарифма концентрації інгібітору. Відрізки прямої показують стандартну помилку середнього значення. Приклади Матеріали та методики Інтерференція PHK Генно-специфічні конструкції pSUPER (Т. R. Brummelkamp et al., Science 296, 550-3 (2002)) генерували шляхом експресії наступних цільових послідовностей мРНК: (1) мишача Parp1 5'GCGGAGUACGCCAAGUCCA-3' (2) скрембльована контрольна 5'-CAUGCCUGAUCCGCUAGUC-S'. Фрагмент 1,6 т.п.н., який містить промотор CMV IE та eCFP (enhanced cyan fluorescent protein, вдосконалений ціан-флуоресцентний білок) субклонували з pECFP-Mito (Invitrogen) у сайт Sapl генерованих конструкцій pSUPER, з отриманням pSUPER-eCFP-PARP1 та pSUPER-eCFP-control. Клітини ES D3 трансфекували цими плазмідами за допомогою ліпофектаміну 2000 (Invitrogen) згідно інструкціям виробника. Через сорок вісім годин після трансфекції отримали сумарні лізати клітин за допомогою буфера, який містить 20 мМ трисбуфера, з рН 8, 200 мМ NaCl, 1 мМ EDTA (етилендіамінтетраоцтова кислота), 0,5% (за об'ємом) NP40, 10 % (за об'ємом) гліцерину та інгібіторів протеази. 30 мкг кожного лізату піддали електрофорезу на біс-трис ацетатакриламідних готових гелях (Novex) та блотували на транс-блотнітроцелюлозу (Biorad). Блоти зондували з поліклональним анти-РARP-1 антитілом кролика (Cell Signalling, Cat No. 9542) або анти-GFP/CFP антисироваткою кролика (Invitrogen, Cat. No. R970-01), потім провели вторинну гібридизацію з антикролячим IgG-HRP з подальшим хемілюмінесцентним аналізом за допомогою ECL™ (Amersham, UK). Синтетичні інгібітори PARP: Інгібітори PARP синтезували згідно із патентною заявкою WO 02/36576. Хімічні інгібітори розчинили у DMSO (диметилсульфоксид) з концентрацією 10 мМ та зберігали при -20C в темноті. Клітинні лінії Клітини VC 8 та їх похідні, доповнені мишачим ВАС Brca2 відповідали опису в роботі М. Kraakman-van der Zwet et al., Моl Cell Biol 22, 66979 (2002)). Клітини ES з дефектною функцією Brca2 були описані раніше (Tutt et al. (2002) EMBO Rep 3, 255-60). Конструкція клітин ES з дефектом Brca1 буде описана у іншому місці, однак, вона була підтверджена раніше (Foray et al. (2003) Embo J 22 2860-71). Клітини HBL100 трансфекували плазмідою PHK та Brca1 pSUPER та відбирали за допомогою генетицину протягом 3 тижнів. Клони відбирали на основі їх експресії Brca1 відповідно до аналізу назерн-блотингу. Клоногенні аналізи Для визначення чутливості до руйнування PHK Parp1 клітини ES, які культивували в кюветах 31 з тканинною культурою, покриті 0,1% желатином, трансфекували, як описано вище, pSUPER-eCFPPARP1 або pSUPER-eCFP-control спільно з вектором, який експресує резистентність до антибіотика бластицидіну (pEF-Bsd, Invitrogen). Через двадцять чотири години після трансфекції клітини обробили трипсином та посіяли в планшети з 6 лунками. Через сорок вісім годин після трансфекції почали обробку бластицидіном, та проводили живлення клітин один раз в три дні. Через 10-14 днів клітини промили PBS (забуферений фосфатом фізіологічний розчин), фіксували метанолом та фарбували кристалвіолетом. Зробили підрахунок колоній, які містять більше, ніж приблизно 50 клітин. Для визначення чутливості до хімічних інгібіторів клітинні культури у стадії експоненціального росту обробили трипсином та посіяли з різною густиною у планшети з 6 лунками, які містять фібробласти мишачих ембріонів, дезактивовані мітоміцином С, та у міру необхідності обробили інгібіторами через 18 годин. Для безперервної дії в клітини один раз в 4 дні додавали свіже живильне середовище та інгібітор. Для періодичної дії інгібітор додавали через певний період часу, а потім клітини промивали та додавали свіже живильне середовище. Через 10-14 днів клітини промили PBS, фіксували метанолом та фарбували кристалвіолетом. Зробили підрахунок колоній, які містять більше, ніж приблизно 50 клітин. Досліди проводили щонайменше три рази по три серії. Аналіз FACS Для визначення вмісту ДНК клітини фіксували у 70% етанолі, інкубували з рибонуклеазою та йодидом пропідію (PI) та проаналізували за допомогою FACS Calibur (Becton Dickinson). Для аналізу фосфогістону Н3 клітини фіксували 70% етанолом, пермеабілізували 0,25% Тритоном Х-100, інкубували з антитілом проти фосфорильованої форми гістону Н3 (Upstate Biotechnology) протягом 3 годин, а потім - з FITC (флуоресцинізотіоціанатом)-антикролячим IgG (Serotec) протягом 30 хвилин. Аналіз FACS проводили, як описано вище. Аналіз апоптозу Клітини обробили трипсином, таким чином, щоб, зберегти надосадковий шар культури та промивальне середовище. Їх об'єднали, клітини промили в холодному PBS-A, а потім ресуспендували при концентрації 1x106 клітин/мл в буфері для зв'язування (10 мМ HEPES (N-2гідроксіетилпіперазин-N-2-етансульфонова кислота), 140 мМ NaCl, 2.5 мМ CaCl2 (рН 7,4)). 100 мкл суспензії інкубували в темноті з 5 мкл Annexin VFITC (BD Biosciences)/ 0,1 мкг йодиду пропідію протягом 15 хвилин при кімнатній температурі, додали 400 мкл буфера для зв'язування та негайно провели аналіз на FACS Calibur (BD Biosciences). Утворення фокусів Rad 51 Клітини ES культивували протягом 48 годин при різних концентраціях інгібітору PARP, фіксували 4% розчином параформальдегіду в PBS та пермеабілізували 0,2% Тритоном Х100 в PBS. Клітини фарбували розведенням 1:100 кролячого антиRad51 поліклонального антитіла (Ab 551922, BD 94209 32 Pharmingen, Oxford, UK). Після промивання первинне антитіло візуалізували за допомогою Alexa Fluor-555 IgG кози проти кролячого (Аlеха) та ядер з TO-PRO-3 йодидом (Molecular Probes). Фокуси Rad51 візуалізували та визначили їх кількість за допомогою конфокального мікроскопа Leica TCSSP2. Гельелектрофорез поодиноких клітин (Commet assay) Клітини VC8 та VC8-BAC культивували протягом 24 годин перед обробкою 1 мкМ KU0058684 протягом 30 годин. Всі подальші операції виконували в темноті. Клітини промили та зіскоблили у PBS перед проведенням гельелектрофорезу поодиноких клітин, як описано в літературі (Lemay and Wood, 1999). Клітини, які суспендовані у LMP агарозі (0,5% у PBS), нанесли на предметні скельця Comet (Trevigen, Gaithersburg) та витримували при 4°С до осадження, а потім провели лізис протягом 45 хвилин у складі, який містить 2,5 M NaCl, 100 мМ EDTA, 10 мМ Тріс основи, 1% натрію лаурил саркозинату, 0,01% Тритон X-100. Предметні скельця перенесли на 5 хвилин у TBE (трихлородіетан-метоксихлор), а потім провели електрофорез при 18 В протягом 15 хвилин. Після цього предметні скельця фіксували 100% етанолом протягом 5 хвилин та висушили на повітрі, додали зелений фарбник SYBR та візуалізували за допомогою епіфлуоресценції, з використанням флуоресцентних фільтрів (Nikon). Аналіз поодиноких клітин проводили за допомогою програмного модуля Comet пакету візуалізації Lucia G, який поставляється компанією Nikon. Для кожного з трьох незалежних експериментів контролювали по 50 окремих клітин на одну точку та розраховували середній хвостовий момент. Мітотичний хромосомний аналіз Клітини ES посіяли на желатин, обробили хімічними індикаторами протягом 24 годин, а потім обробили колхаміном протягом 1 години. Потім клітини відібрали, фіксували, перенесли на предметні скельця, висушили, пофарбували DAPI (4,6діамідино-2-феніліндолдигідрохлоридом) та провели хромосомний аналіз під мікроскопом. Ксенотрансплантати клітин ES та обробка KU0058684 Пухлини (тератоми) з клітин ES отримали шляхом підшкірної ін'єкції 2х108 клітин ES безтимусним мишам породи BALB (Bagg Albino)/c з мутацією за геном nude (nu/nu) у віці 6-8 тижнів. Двадцяти мишам ввели ін'єкцію клітин ES з дефектом Brca2, а ідентичній групі - ізогенні клітини дикого типу. Через два дні після ін'єкції клітин почали лікування KU0058684 або наповнювачем. Протягом трьох послідовних днів вводили інтраперитонеально дві дози KU0058684 (або наповнювача) з інтервалом у шість годин при дозуванні 15 мг/кг маси тварини. Потім це лікування припинили на п'ять днів та відновили (як раніше) протягом трьох подальших днів. Зростання пухлин контролювали від мінімального об'єму 0,3 см3. Дані на фігурі 16 представляють два окремі експерименти з участю в цілому 40 тварин. Отримання клітинних ліній дефектних за Brca1 Скрембльовану клітинну лінію MCF7 та клітин 33 ну лінію MCF7-3.23 отримали шляхом стабільної трансфекції клітин аденокарциноми молочної залози MCF7 генно-специфічними конструкціями pSUPER. Генно-специфічні конструкції pSUPER отримали шляхом експресії наступних цільових послідовностей мРНК: (1) послідовності Brca1 людини 5'-GGAACCTGTCTCCACAAAG-3' та (2) скрембльованої контрольної послідовності 5'CATGCCTGATCCGCTAGTC-3'. Фрагмент 1,8 т.п.н., який містить промотор людини EF1a та ген стійкості до бластицидину (bsd) субклонували з pEFBsd (Invitrogen) у сайт Sapl конструкцій pSUPER, з отриманням pSUPER-Bsd-Brca1 та pSUPER-Bsd-скрембльовану. Клітини MCF7 трансфекували цими плазмідами за допомогою FuGene6 (Roche) згідно із інструкціями виробника. Після селекції на бластицидині пригнічення мРНК Brca1 визначали в резистентних клонах з використанням полімеразно-ланцюгової реакції в режимі реального часу (Egawa et al., Oncology. 2001; 61(4): 293-8; Egawa et al., Int J Cancer. 2001 Jul 20;95(4):255-9). Клони із зниженим рівнем Brca1 мРНК культивували (при селекції в бластицидині) протягом 8 пасажів та повторили аналіз в режимі реального часу. Клітинна лінія MCF7-3.23 показала тільки 30% експресії Brca1 в порівнянні з клонами MCF7, які містять конструкцію pSUPER-B sdскрембльовану. Результати Зниження рівнів білка Parp1 при дії кіРНК Плазміду (pSUPER-eCFP-PARP1), яка експресує кіРНК, специфічну для Parp1, під контролем промотора H1 (Т. R. Brummelkamp et al., Science 296, 550-3 (2002)) та вдосконалений ціанфлуоресцентний білок (Enhanced Cyan Fluorescent Protein, eCFP) під контролем промотора CMV IЕ трансфекували в мишачі ембріональні стовбурні клітини D3. Як контроль окремо трансфекували плазміду pSUPER-eCFP-control, яка експресує незв'язану скрембльовану кіРНК. Через сорок вісім годин після трансфекції приготували клітинні лизати та провели їх аналіз способом вестернблотингу. Блоти зондували з поліклональним антиРARP-1 антитілом або з анти-GFP/CFP антисироваткою. Рівні PARP1, які спостерігали в клітинах, які експресують кіРНК, специфічну для Parp1, були набагато нижчими, ніж рівні PARP1 в контрольних клітинах. Рівні eCFP були аналогічними в клітинах, які експресують кіРНК Parp1, та в контрольних клітинах. Зниження життєздатності клітин дефектних за Brca1 та Brca2 після нок-дауна з використанням кіРНК, яка специфічна для Parp1 Мишачі ембріональні стовбурові клітини (ES) дикого типу Brca1-/- та Brca2-/- трансфекували pSUPER-eCFP-PARP1 або pSUPER-eCFP-control спільно з плазмідою pEF-Bsd, яка кодує резистентність бластицидину, у співвідношенні 10:1. Відібрали клони стійкі до бластицидину та визначили їх кількість. Результати представлені на фігурі 1, де показана залежність кількості колоній pSUPEReCFP-PARP1 залежно від кількості pSUPER-eCFPcontrol після трансфекції. Відрізки прямої вказують стандартне відхилення від середнього значення. 94209 34 Після коректування ефективності трансфекції за допомогою контрольної кіРНК виявилося, що виживання клітин ES дефектних за Brca1 та Brca2 істотно зменшилося при інгібуванні експресії Parp1. Зниження життєздатності клітин, дефектних за Brca1 та Brca2 після застосування хімічних інгібіторів PARP Хімічні інгібітори активності Parp застосували для підтвердження селективного інгібування клітин, дефектних за Brca1 та Brca2, яке спостерігалося вище. Використовували два різні інгібітори PARP - KU0058684 та KU0058948, а також слабо активну, але хімічно споріднену сполуку KU0051529 (фіг. 2). Ці нові інгібітори PARP мають в основі фталазин-1-онове ядро та є конкурентними інгібіторами у відношенні до субстрату NAD+ PARP. KU0058684 та KU0058948 є сильнодіючими специфічними інгібіторами активності поліаденозинди-фосфорибози-полімерази (PARP) білків PARP-1 та PARP-2 та не інгібують PARP зведення, танкиразу або PARP-3 при концентрації до 1 мкМ. На відміну від цього сполука KU0051529, не дивлячись на хімічну спорідненість, приблизно у 250 разів менш ефективна для інгібування цих ферментів. KU0058684, KU0058948 та KU0051529 використовували для визначення чутливості клітин, дефектних за Brca1 або Brca2, до інгібування активності PARP. Клоногенні аналізи показали, що клітинні лінії, дефектні за Brca1 та Brca2 надзвичайно чутливі до KU0058684 та KU0058948 в порівнянні з іншими ізогенними клітинами (фіг. 3, 4). Величина SF50 (доза, при якій виживають 50 % клітин) для KU0058684 становила 3,5х10-8 M для Brca1 та 1,5х10-8 M для Brca2, а для клітин дикого типу - близько 3,5х10-8 М. Це відповідає підвищенню чутливості в 57 та 133 разу для мутантних клітин за Brca1 та Brca2, відповідно, в порівнянні з клітинами дикого типу. Аналогічні результати отримали з клітинами яєчників китайського хом'яка, дефектними за Brca2, які показали підвищення чутливості більш, ніж в 1000 разів в порівнянні з комплементарними похідними Brca2 (фіг. 14 та 15). Чутливість мутантних клітин за Brca1 та Brca2 до KU0058948 була навіть більшою, ніж до KU0058684. На відміну від цього сполука KU0051529 не чинила селективного впливу на клітини з недостатністю Brca1 або Brca2 дикого типу в порівнянні з клітинами дикого типу. Це в поєднанні з даними для кіРНК показує, що механізм чутливості діє специфічно за допомогою інгібування PARP. Примітно, що жоден з інгібіторів не чинив впливу на клітини, гетерозиготні за мутацією Brca1 або Brca2. Вплив часу дії KU0058684 на клоногенне виживання клітин, дефектних за Brca1 та Brca2 Клітини піддали дії різних концентрацій KU0058684 протягом певних періодів часу. Потім інгібітор видалили та визначили результат дії за допомогою клоногенного аналізу. Інгібувальний вплив KU0058684 на клоногенне зростання, виявлявся після відносно короткого часу дії - 4 години та практично закінчувався через 24 години (фігури 5 та 6). Вплив інгібування PARP виявився необо 35 ротним, оскільки короткочасна дія запобігає зростанню в наступні 10-14 днів за відсутності інгібітору. Вплив інгібування PARP на зупинку клітинного циклу Аналіз FACS використовували для визначення впливу інгібування PARP на зупинку клітинного циклу. Клітини піддали дії KU0058684 протягом різних періодів часу, а потім помітили BrdU та визначили частку клітин в кожній фазі клітинного циклу. Результати показані на фігурах 7 та 8. Згідно спостереженням, KU0058684 забезпечує повну зупинку зростання клітин, які містять тетраплоїдну ДНК, що вказує на зупинку клітинного циклу у фазі G2 або М. Для того, щоб додатково охарактеризувати цю зупинку, в клітинах за допомогою маркера фази M аналізували вміст ДНК та фосфорильованого гістону Н3 (фігури 12 та 13). Більшість зупинених клітин не були міченими антитілами антифосфогістону Н3. Це означає, що більшість клітин була зупинена у фазі G2. Утворення фокусів Rad51 Однією з ознак репарації двониткового розриву, залежної від Brca, є утворення в ядрі фокусів, які містять Rad51. Досліджували здатність KU0058684 створювати фокуси Rad51 в клітинах дикого типу, а також в дефектних клітинах Brca1 та Brca2. Клітини ES дикого типа та дефектні клітини Brca1 та Brca2 піддали дії різних концентрацій KU0058684 протягом 48 годин. Потім клітини фіксували та фарбували для визначення фокусів RAD51, як описано у Tarsounas (Tarsounas М. et al., Oncogene. 2003 22(8): 1115-23). В клітинах ES дикого типу KU0058684 викликав утворення фокусів Rad51, залежних від дози (фігура 9). На відміну від цього в клітинах дефектних за Brca1 або Brca2 не було індукції фокусів. Цей останній результат узгоджується з попередніми спостереженнями, згідно яких агенти, які ушкоджують ДНК, не можуть викликати утворення фокусів Rad51 в клітинах дефектних за Brca1 або Brca2. Таким чином, показано, що KU0058684 викликає пошкодження, зокрема, двониткові розриви ДНК або пошкодження, що переростають в двониткові розриви ДНК, які репарує комплекс, який включає Rad51, та вимагається наявність Brca1 та Brca2. Важливо відзначити, що KU0051529 не викликав утворення фокусів Rad51 при порівнянних дозах, що підкреслює специфічність механізму сенсибілізації. Гельелектрофорез поодиноких клітин (Commet assay) Щоб визначити, чи призводить інгібування активності PARP до утворення двониткових розривів ДНК, провели нейтральний гельелектрофорез поодиноких клітин на Brca2-мутантних клітинах та їх ізогенних аналогах. Результати показані на фігурі 10. Після 30-годинної дії 1 мкМ KU0058684 мало місце 4,7-кратне збільшення хвостового моменту Brca2-дефектних клітин VC8 та було відсутнє істотне збільшення хвостового моменту комплементованої лінії VC8-BAC. Цей результат показує, що двониткові розриви ДНК, індуковані 94209 36 PARP і, залишаються нерепарованими в лінії дефектній за Brca2. Аналіз мітотичних хромосом Контроль мітотичних хромосом клітин, дефектних Brca1 та Brca2 показав, що обробка KU0058684 призводить до частих крупних аберацій. Вони включають розриви хроматид, а також трьох- та чотирьохрадіальних хромосом. Ці фенотипи вказують на неможливість репарації двониткових розривів шляхом конверсії генів сестринських хромосом та розширене застосування альтернативних, схильних до помилок шляхів. Ксенотрансплантати клітин ES та обробка KU0058684 Пухлини (тератоми) отримали з ізогенних та клітин ES дефектних за Brca2 безтимусних мишей породи BALB/c з мутацією по гену nude (nu/nu), як описано вище. Визначили вплив KU0058684 на зростання пухлин дикого типу та ксенотрансплантатів дефектних за Brca2. Результати показані на фігурі 16. Згідно спостереженням, KU0058684 різко зменшує зростання пухлин дефектних за Brca2 в порівнянні з пухлинами дикого типу. Ефект інгібування PARP y Brca1-дефектних клітинних лініях Клітинні лінії MCF7-скрембльовану та MCF73.23 отримали, як описано вище. MCF7-3.23 забезпечувала 30% експресії Brca1 в порівнянні з MCF7-скрембльованною. Клітини ліній MCF7-скрембльованної та MCF73.23 обробили KU0058684 та KU0051529 та визначили виживання клітин (фігури 17 та 18). KU0058684 є сильним інгібітором PARP, тоді як KU0051529 менш ефективний. Клітини ліній МСF7-скрембльованної та MCF73.23 не проявили істотної чутливості до KU0051529 (фігура 18). Проте обидві клітинні лінії були чутливі до KU0058684. Клітини лінії MCF7-3.23 набагато більш чутливі до KU0058684, ніж клітини лінії MCF7скрембльованної. Взаємодія PARP та шляхи репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR Без якого-небудь обмеження області розповсюдження винаходу одна з можливих моделей взаємодії PARP та шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, показана на фігурі 11. Однониткові розриви (single-strand breaks, SSB) ДНК утворюються внаслідок окислювального пошкодження та його репарації. Інгібування активності полімерази PAR Parp-1 перешкоджає рекрутуванню каркасного білка XRCC1 та подальшому заповненню SSB ділянки ДНК-полімеразами (фігура 11А). SSB зберігаються у великій кількості та стикаються з реплікативними вилками ДНК. Відсутністьматричної нитки в SSB призводить до утворення ДНР та залежно від позиції може викликати руйнування реплікативної вилки (фігура 11В). Близькість непошкодженої сестринської хроматидної матриці забезпечує інвазію сестринської хроматиди за допомогою одинарної нитки ДНК, покритої RAD51, та дозволяє ініціювати рекомбінаційну репарацію сестринської хроматиди. Цей 37 процес залежить від BRCA1 та Brca2 і є пов'язаним з утворенням в ядрі безлічі фокусів RAD51. Зруйновані реплікативні вилки можна відновити за допомогою аналогічного механізму (фігура 11С). Якщо структури Холлідея, які утворюються в проміжних стадіях рекомбінації руйнуються, може відбуватися обмін сестринськими хроматидами (sister chromatid exchange, SCE). Надмірна кількість SSB, які стикаються з реплікативними вилками при інгібуванні Parp-1, призводить до збільшення SCE (фігура 11D). За відсутності функціональних BRCA1 або Brca2 утворення фокусів RAD51 та рекомбінація сестринських хроматид різко пригнічуються. Під час реплікації ДНК надлишок нерепарованих SSB утворює ДНР, проте, сестринської рекомбінації не відбувається. Вони залишаються нерепарованими, оскільки хроматиди руйнуються, або репаруються за допомогою механізмів, незалежних від RAD51, які схильні до помилок, та які викликають складні перебудови хромосом. Такі клітини зупиняються в циклі, коли вони стикаються з контрольною точкою пошкодження ДНК в G2/M, що призводить до повної зупинки циклу або апоптозу (фігура 11Е). Приведені тут дані про PHKi (інтерференції PHK) разом із спостережуваною неефективністю KU0051529 показують, що інгібування PARP відповідально за спостережувані ефекти сенсибілізації. Інгібування PARP викликає пошкодження, які 94209 38 звичайно репаруються обміном сестринських хроматид (sister chromatid exchange, SCE) (Wang ZQ, et al., (1997) Genes Dev. Vol. 11(18):2347-58 та 'From DNA damage and stress signalling to cell death' G. de Murcia та S. Shall eds. Oxford University Press (2000)). Відомо, що інгібування PARP збільшує SCE, не викликаючи супутнього збільшення генної конверсії ДНР і, отже, глобального збільшення шляху рекомбінації, залежного від Rad51 (Schultz N et al., 2003, Nucleic Acids Research; vol.31 (17): 4959-4964). Описаний тут синтетичній підхід забезпечення клітинної летальності може бути використаний для лікування а) пухлин в носіях раку молочної залози, б) пухлин, в яких інші компоненти репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, є дефектними. Не дивлячись на те, що існують описи відмінностей в часі початку симптомів та патології пухлин в носіях мутацій раку молочної залози, в даний час їх лікування є точно таким же, як й для пацієнтів із спорадичним захворюванням. Даний винахід забезпечує новий підхід до цих пухлин, викладений в цьому описі. Важливо відзначити відсутність спостережень гетерозиготного ефекту. Це є істотним чинником для терапевтичного застосування описаних способів для гетерозиготних носіїв мутацій на шляху репарації ДНР ДНК, яка залежить від HR, включаючи, наприклад, мутації BRCА1/2. 39 94209 40 41 94209 42 43 94209 44 45 94209 46 47 94209 48 49 94209 50 51 94209 52 53 94209 54 55 94209 56 57 94209 58 59 94209 60