Застосування n-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинаміну для лікування раку, рефрактерного до лікування протираковим агентом

Реферат: Даний винахід стосується способів застосування сполуки N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинаміну (AMG 900) або її фармацевтично прийнятної солі для лікування раку, включаючи солідні пухлини, які стали резистентними до UA 107675 C2 (12) UA 107675 C2 лікування хіміотерапевтичними агентами, включаючи антимітотичні агенти, такі як таксани, та/або іншими протираковими агентами, включаючи інгібітори Aurora кінази. UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Споріднені заявки Дана заявка претендує на пріоритет попередньої заявки США № 61/241,527, поданої 11 вересня 2009 року, опис якої включено до даного винаходу в повному об'ємі за посиланням. Галузь техніки Даний винахід стосується застосування N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинаміну для лікування раку, включаючи солідні пухлини, які стали резистентними до лікування антимітотичними агентами та/або іншими хіміотерапевтичними агентами. Рівень техніки Рак є однією з найпоширеніших хвороб, які вражають людство, і провідною причиною смерті у всьому світі. Так, в США рак є другою з провідних причин смерті після хвороб серця. Рак часто характеризується порушеним регулюванням нормальних клітинних процесів або нерегульованою клітинною проліферацією. Клітини, які були трансформовані в канцерозні клітини, мають тенденцію проліферувати неконтрольованим і нерегульованим чином, що в певних випадках призводить до метастазування чи поширення раку. Дерегуляція клітинної проліферації може виникнути як результат модифікації одного чи більше генів, відповідальних за клітинні шляхи, що контролюють прогресування клітинного циклу. Або ж, вона може бути результатом модифікацій ДНК (включаючи, але не обмежуючись ними, мутації, ампліфікації, перебудови, делеції та епігенетичний сайленсинг гену) в одному чи більше регуляторах контрольних точок клітинного циклу, що дозволяє клітині переходити від однієї фази клітинного циклу до іншої без перешкод. Ще одна можливість може полягати в тому, що модифікації в самому клітинному комплексі призводять до мітотичних похибок, які належним чином не виявляються і не виправляються, так що клітина може проходити через клітинний цикл без перешкод. Мітоз - це процес, завдяки якому евкаріотична клітина розділяє свої подвоєні хромосоми між двома ідентичними дочірніми ядрами. Загалом, безпосередньо після мітозу має місце цитокінез, під час якого відбувається поділ ядра, цитоплазми, органел і клітинних мембран на дві дочірні клітини, що мають приблизно рівні частки цих клітинних компонентів. Мітоз и цитокінез разом визначають мітотичну (М) фазу клітинного циклу – поділ материнської клітини на дві дочірні клітини, генетично ідентичні одна одній і своїй батьківській клітині. Процес мітозу є складним і чітко регульованим. Послідовність явищ ділиться на окремі фази, які відповідають завершенню одного комплексу форм активності і початку наступного. Цими стадіями є профаза, прометафаза, метафаза, анафаза і телофаза. Під час процесу мітозу дупліковані хромосоми конденсуються і прикріплюються до волокон, які розводять сестринські хроматиди в протилежні сторони клітини. Клітина потім ділиться в процесі цитокінезу з утворенням двох ідентичних дочірніх клітин. Похибки в процесі мітозу можуть знищити клітину через апоптоз або викликати неправильний розподіл хромосом, що може спричинити до раку. В нормі контрольні точки клітинного циклу активуються тоді, коли виявляються похибки в ДНК (наприклад, пошкодження ДНК). Якщо ці похибки в геномі не можуть бути зафіксовані, то клітина звичайно піддається апоптозу. Однак, коли такій клітині дозволяється проходити через її клітинний цикл і безперешкодно прогресувати, з часом може накопичитись більша кількість мутацій. Такі модифікації генів можуть наростати і в кінцевому рахунку призводити до появи потомства клітини з дораковими чи раковими неопластичними характеристиками (наприклад, неконтрольованою проліферацією) через механізми адаптації. Антимітотичні препарати – це протиракові агенти, які пригнічують функцію мікротрубочок. Мікротрубочки являють собою білкові полімери, утворені гетеродимерами α-тубуліну і βтубуліну, які відіграють важливу роль у формуванні апарату мітотичного веретена і цитокінезі в кінці мітозу. Протиракові агенти, націлені на мікротрубочки, є одним з підтверджених підходів до втручання в проліферацію ракових клітин. В якості протиракових препаратів було розроблено декілька класів антимітотичних агентів. Таксани є найвідомішим класом антимітотичних агентів, який включає паклітаксель (таксол) і доцетаксель (таксотер). Алкалоїди барвінку являють собою клас агентів, дестабілізуючих мікротрубочки, який включає вінкристин, вінбластин, віндезин і вінорелбін. Інший клас, який наразі тільки з'являється, включає епотілони (іксабепілон). Ці антимітотичні агенти призначені для попередження проліферації ракових клітин шляхом стабілізації чи дестабілізації мікротрубочок. Таке пряме пригнічення мікротрубочок приводить до блокування і загибелі клітини через апоптоз або до мітотичної катастрофи. Паклітаксель був першою відкритою сполукою таксанової серії. Доцетаксель, структурний аналог паклітакселя, було відкрито пізніше. Паклітаксель і доцетаксель широко застосовуються для лікування широкого кола злоякісних новоутворень у людини, включаючи рак яєчника, рак молочної залози, рак голови і 1 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 шиї, рак легені, рак шлунку, рак стравоходу, рак передміхурової залози і асоційовану зі СНІДом саркому Капоші. Головним побічним ефектом таксанів є мієлосупресія, головним чином нейтропенія, а інші побічні ефекти включають периферичний набряк і нейротоксичність (периферична невропатія). Резистентність до таксанів є ускладнюючим фактором для успішного лікування раку і часто асоціюється з підвищеною експресією кодованого mdr-1 гену та його продукту, Р-глікопротеїну (P-gp). Іншими документально підтвердженими механізмами вторинної резистентності до таксанів є мутації тубуліну, гіперекспресія, ампліфікація і переключення ізотипу. Мутації в α- чи β-тубуліні пригнічують зв'язування таксанів з правильним місцем на мікротрубочках, що робить ці лікарські препарати неефективними. Крім того, певні резистентні клітини демонструють також підвищений вміст Aurora кінази – ферменту, який сприяє завершенню мітозу. Алкалоїди барвінку (Vincas; відомі також як рослинні алкалоїди) є здатними зв'язуватись з субодиницею β-тубуліну мікротрубочок, блокуючи їх здатність до полімеризації з α-субодиницею тубуліну для утворення повних мікротрубочок. Це викликає зупинку клітинного циклу в метафазі, що призводить до апоптотичної загибелі клітини, оскільки, за відсутності інтактного мітотичного веретена, дупліковані хромосоми не можуть зорієнтуватись відносно метафазної пластинки. Під час досліджень були ідентифіковані димерні асиметричні алкалоїди барвінку: вінбластин, вінкристин, вінорелбін і віндезин, які всі використовуються в лікуванні раку, включаючи рак сечового міхура і рак яєчка, саркому Капоші, нейробластому і хворобу Ходжкіна, а також карциному легені і рак молочної залози. Основними побічними ефектами алкалоїдів барвінку є те, що вони можуть викликати у пацієнтів нейротоксичність і мієлосупресію. Резистентність до алкалоїдів барвінку може швидко з'явитись в експериментальних моделях. Протипухлинні ефекти алкалоїдів барвінку можуть блокуватись в мультирезистентних клітинних лініях, які характеризуються гіперекспресією опосередкованих АТФ-зв'язуючим касетним транспортером (АВС) ефлюксних переносників, таких як P-gp і MRP1. Інші форми резистентності виникають як результат мутацій в β-тубуліні, які перешкоджають зв'язуванню інгібіторів з їх мішенню. Інші хіміотерапевтичні агенти включають інгібітори топоізомерази, такі як іринотекан і топотекан (інгібітори типу I), а також амсакрин, етопозид, етопозиду фосфат і тенопозид (інгібітори типу II). Інгібітори топоізомерази порушують синтез ДНК і, зокрема, діють шляхом запобігання транскрипції і реплікації ДНК. Ще одним класом хіміотерапевтичних агентів є клас антрациклінових антибіотиків, який включає даунорубіцин, доксорубіцин, ідарубіцин, епірубіцин і мітоксантрон. На сьогоднішній день антрацикліни застосовуються для лікування різних видів раку, включаючи лімфоми, лейкози, а також рак матки, яєчника, легені і молочної залози. Антрацикліни працюють шляхом формування вільних радикалів кисню, які розривають нитки ДНК, тим самим пригнічуючи синтез і функцію ДНК. Одним з основних побічних ефектів антрациклінів є те, що вони можуть пошкоджувати клітини серцевого м'язу, призводячи до серцевої токсичності. Резистентність до протиракових агентів, включаючи, але не обмежуючись ними, хіміотерапевтичні агенти і антимітотичні агенти, стала головним їх недоліком в лікуванні раку. Така резистентність призводить до того, що пацієнти стають перехресно-резистентними до дії багатьох різних лікарських препаратів. Таким чином, проблемоює множинна лікарська резистентність. Більше того, така резистентність до протиракової терапії неминуче призводить до смерті пацієнта. Відповідно, розвиток лікарської резистентності залишається проблемою для всіх протиракових терапій і, значить, зберігається потреба у терапії для раку, який більше не є чутливим або тільки незначно піддається лікуванню, включаючи традиційне лікування хіміотерапевтичними агентами, такими як таксани і алкалоїди барвінку, а також лікування протираковими агентами, що проходять клінічне випробування для отримання схвалення регуляторного органу. Короткий опис малюнків Фіг. 1 – це графік, який показує дію AMG 900 і Таксолу на клітинні лінії MES-SA і MES-SA Dx5, значення EC50 для p-гістону H3; Фіг. 2 – це графік, який показує дію AMG 900 і Таксолу на батьківську клітинну лінію NCIH460 і резистентну до Таксолу клітинну лінію NCI-H460, значення EC50 для вмісту ДНК в клітинному циклі; Фіг. 3 – це графік, який показує дію AMG 900 і Таксолу на клітинну лінію MDA-MB-231 і резистентну до Таксолу клітинну лінію MDA-MB-231, значення EC50 для вмісту ДНК в клітинному циклі; Фіг. 4 – це графік, який ілюструє, як AMG 900 пригнічує ріст встановлених пухлинних ксенотрансплантатів MES-SA Dx5; і 2 UA 107675 C2 5 10 Фіг. 5 – це графік, який показує дію лікування AMG 900 і Таксолом на ріст встановлених резистентних до Таксолу ксенотрансплантатів NCI-H460. Фіг. 6 – це графік, який показує дію AMG 900 на батьківську клітинну лінію HCT116, резистентну до AZD1152 клітинну лінію HCT116 і резистентні до Паклітакселю клітинні лінії. Короткий опис винаходу Даний винахід передбачає застосування сполуки N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинамін (яка також називається тут "AMG 900" або "сполука") і її фармацевтично прийнятних солей для лікування раку на пізній стадії, включаючи солідні пухлини и ракові клітини, які є рефрактерними до стандартного лікування офіційно схваленими антимітотичними агентами, такими як таксани, паклітаксель і доцетаксель включно, та іншими хіміотерапевтичними агентами, включаючи доксорубіцин, а також іншими агентами, які вводяться в клінічних випробуваннях для лікування раку. AMG 900 має наступну хімічну структуру: H2N N N O N S N N N H 15 20 25 30 35 40 45 50 . Даний винахід, крім того, передбачає використання фармацевтичної композиції, яка містить таку сполуку чи її фармацевтично прийнятну сіль для терапевтичного, профілактичного, гострого чи хронічного лікування раку і ракових клітин у пацієнтів, які раніше вже лікувались хіміотерапевтичними агентами, включаючи антимітотичні агенти. В одному варіанті здійснення даний винахід передбачає використання AMG 900 при виготовленні лікарських засобів і фармацевтичних композицій для способів лікування раку у суб'єктів, які раніше вже лікувались антимітотичними агентами, включаючи інгібітори мітотичного веретена і антимікротубулінові агенти, чи іншими лікарськими препаратами, використовуваними в хіміотерапії раку (які називаються тут також хіміотерапевтичними агентами), включаючи доксорубіцин, даунорубіцин, дактиномуцин, колхіцин, вінбластин, вінкристин, еторозид і мітоксантрон. В іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб лікування резистентних до таксанів типів пухлин, включаючи недрібноклітинний рак легені, рак молочної залози і резистентний до лікування гормонами рак передміхурової залози у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту ефективної кількості AMG 900 чи його фармацевтично прийнятної солі для лікування резистентної до таксану пухлини. Докладний опис винаходу В клінічних випробуваннях на людях було встановлено, що AMG 900, інгібітор Aurora кінази, забезпечує разючу і неочікувану перевагу над сучасними стандартними протираковими терапевтичними агентами, які націлені на тубулін (такі як паклітаксель, іксабепілон і алкалоїди барвінку), та іншими хіміотерапевтичними агентами (такими як доксорубіцин), включаючи AZD1152. Зокрема, AMG 900 забезпечує ефективність пригнічення чи уповільнення прогресування чи росту пухлин, що стали перехресно резистентними до антимітотичних агентів, завдяки різним запропонованим механізмам, в тому числі, наприклад, опосередкованому транспортером АТФ-зв'язуючої касети (АВС) виведенню лікарського препарату, ампліфікації чи модифікації гену тубуліну або структурним змінам в білку α- чи β-тубуліну. Крім того, AMG 900 вражає проліферуючі клітини в G2M-фазі клітинного циклу і, відповідно, з малою вірогідністю буде викликати периферичну невропатію, яка спостерігається у випадку антимітотичних агентів, націлених на мікротрубочки. Дефініції Наступні визначення повинні сприяти розумінню об'єму винаходу, описаного тут. Використовувані тут терміни "рак" і "канцерозний" стосуються чи описують фізіологічний стан у суб'єктів, який типово характеризується нерегульованим клітинним ростом. Приклади раку включають, не обмежуючись ними, карциному, лімфому, саркому, бластому і лейкоз. Більш конкретні приклади ракових захворювань включають плоскоклітинну карциному, рак легені, рак передміхурової залози, рак шийки матки, рак сечового міхура, гепатому, рак молочної залози, рак товстої кишки і рак голови та шиї. Оскільки термін "рак", як він тут використовується, не 3 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 обмежується якоюсь конкретною формою захворювання, то вважається, що способи за цим винаходом будуть особливо ефективними для лікування раку у суб'єкта, який став певною мірою резистентним до лікування протираковими агентами, включаючи, але не обмежуючись ними, хіміотерапевтичні агенти, антимітотичні агенти, антрацикліни і т.п., а також раку, який рецидивував після лікування такими протираковими агентами. Термін "хіміотерапевтичний агент", як він тут використовується, стосується лікування раку шляхом знищення канцерозних клітин. Цей термін стосується також антинеопластичних препаратів, використовуваних для лікування раку, або комбінації таких препаратів в стандартизованій схемі лікування. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають, не обмежуючись ними, алкілуючі агенти, такі як цисплатин, карбоплатин, оксаплатин; алкалоїди, включаючи алкалоїди барвінку (приклади включають вінкристин, вінбластин, вінорелбін і віндезин), і таксани (приклади включають паклітаксель (Таксол) і доцетаксель); інгібітори топоізомерази, такі як іринотекан, топотекан, амсакрин, етопозид, етопозиду фосфат і теніпозид; а також різні протипухлинні агенти, такі як дактіноміцин, доксорубіцин, епірубіцин, блеоміцин та інші. Термін "який містить" означає необмеженість, включаючи вказані компоненти, але не виключаючи інших елементів. Використовуваний тут термін "мультирезистентний" стосується ракових клітин, резистентних до багатьох лікарських препаратів різної хімічної структури та/або резистентних до лікарських препаратів, спрямованих на різні мішені. Використовуваний тут термін "рефрактерний" означає такий, що не піддається, є резистентним чи не реагує на лікування, стимули (терапію) чи ліки, включаючи резистентність до багатьох терапевтичних засобів лікування. Термін "рефрактерний", при використанні тут в контексті характеристики раку чи пухлини, стосується раку чи пухлини, яка не відповідає або має резистентну чи зменшену відповідь на лікування одним чи кількома протираковими агентами. Типово, таке лікування є тривалим, пролонгованим та/або періодичним впродовж певного періоду часу, а це призводить до того, що рак чи пухлина розвивають резистентність або стають рефрактерними до саме такого лікування. Термін "суб'єкт", як він тут використовується, стосується будь-якого ссавця, включаючи людину і тварин, таких як корови, коні, собаки і коти. Таким чином, даний винахід може використовуватись для пацієнтів-людей, а також для ветеринарних суб'єктів і пацієнтів. В одному варіанті здійснення цього винаходу суб'єктом є людина. Вираз "терапевтично ефективний" означає визначення кількості сполуки (AMG 900), яка забезпечує зменшення розміру чи тяжкості раку чи пухлини за час лікування раку традиційними антимітотичними препаратами при зменшенні чи відсутності несприятливих побічних ефектів, які типово асоціюються з традиційною антимітотичною терапією раку. Терміни "лікувати" і "лікування", як вони тут використовуються, стосуються терапії, включаючи, але не обмежуючись ними, радикальну терапію, профілактичну терапію і превентивну терапію. Профілактичне лікування загалом полягає в попередженні початку розладів взагалі або у відстроченні початку доклінічно очевидної стадії розладів у індивідів. Термін "фармацевтично прийнятні солі" охоплює солі, звичайно використовувані для утворення солей лужних металів і для утворення солей приєднання вільних кислот чи вільних основ. Природа солі не має вирішального значення за тієї умови, що сіль є фармацевтично прийнятною. Придатні фармацевтично прийнятні солі приєднання кислоти можуть бути приготовлені з даної сполуки і неорганічної чи органічної кислоти. Приклади таких неорганічних кислот включають, не обмежуючись ними, хлористоводневу, бромисто-водневу, йодистоводневу, азотну, вугільну, сірчану і фосфорну кислоту. Приклади органічних кислот включають, не обмежуючись ними, аліфатичний, циклоаліфатичний, ароматичний, арилаліфатичний, гетероциклічний, карбоновий і сульфоновий класи органічних кислот, прикладами яких є мурашина, оцтова, адипінова, масляна, пропіонова, бурштинова, гліколева, глюконова, молочна, яблучна, винна, лимонна, аскорбінова, глюкуронова, малеїнова, фумарова, піровиноградна, аспарагінова, глютамінова, бензойна, амінобензойна, месилікова, 4гідроксибензойна, фенілоцтова, мигдалева, ембонова (памоєва), метансульфонова, етансульфонова, етандисульфонова, бензолсульфонова, пантотенова, 2-гідроксиетансульфонова, толуолсульфонова, сульфанілова, циклогексиламіносульфонова, камфорна, камфорсульфонова, диглюконова, циклопентанпропіонова, додецил-сульфонова, глюкогептанова, гліцерофосфорна, гептанова, гексанова, 2-гідрокси-етансульфонова, нікотинова, 2-нафталінсульфонова, щавлева, пальмітинова, пектинова, надсірчана, 2фенілпропіонова, пікриновая, півалінова, пропіонова, бурштинова, винна, тіоціанова, месілікова, 4 UA 107675 C2 5 10 15 ундеканова, стеаринова, альгінова, β-гідроксимасляна, саліцилова, галактарова і галактуронова кислота. Придатні фармацевтично прийнятні солі приєднання основи даної сполуки включають, не обмежуючись ними, солі металів, такі як солі, отримані з алюмінієм, кальцієм, літієм, магнієм, калієм, натрієм і цинком, або солі, отримані з органічними основами, включаючи первинні, вторинні, третинні аміни і заміщені аміни, включаючи циклічні аміни, такі як кофеїн, аргінін, діетиламін, N-етилпіперидин, гістидин, глюкамін, ізопропиламін, лізин, морфолін, Nетилморфолін, піперазин, піперидин, триетиламін, триметиламін. Всі солі, вказані тут, можуть бути приготовлені традиційними способами з відповідної сполуки шляхом проведення реакції, наприклад, відповідної кислоти чи основи з цією сполукою. AMG 900, N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)оксо)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1фталазинамін, може бути приготовлений способом, аналогічним способу, описаному в публікації РСТ WO2007087276, Ілюстративні способи А1 чи А2 на сторінці 70, але з використанням 1-хлор-4-(4-метил-2-тієніл)фталазину в якості вихідного матеріалу, в поєднанні з Прикладами 15 (сторінка 50), 25 (сторінка 55) і 30 (сторінка 59). Ці способи є описаними також в патенті США № 7,560,551, опис якого є включеним сюди за посиланням у всій його повноті. Зокрема, AMG 900 можна приготувати так, як описано в Прикладі 1 далі. Приклад 1 H2N H2N N H2N N N N N O O Cl N N N Cl NH2 N N N NH N N S S AMG 900 20 25 30 35 40 45 Синтез N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1фталазинаміну (AMG 900) Етап 1: 4-(2-хлорпіридин-3-іл)піримідин-2-амін В продуту аргоном 500-мл колбу с круглим дном, встановлену у ванну з ізопропанолом, повільно добавляли металічний натрій (3,40 г; 148 ммоль) в метиловий спирт (180 мл). Суміш перемішували при кімнатній температурі (КТ) впродовж приблизно 30 хвилин. До цього додали гуанідину гідрохлорид (12,0 мл; 182 ммоль) і перемішували при КТ впродовж 30 хвилин, після чого додали (Е)-1-(2-хлорпіридин-3-іл)-3-(диметиламіно)проп-2-ен-1-он (12,0 г; 57,0 ммоль), приєднали конденсатор з повітряним охолодженням, перенесли реакційну суміш в масляну ванну, де її нагрівали при температурі біля 50ºС впродовж 24 годин. Приблизно половину метилового спирту випарили під зниженим тиском, а тверду речовину відфільтрували у вакуумі, після чого промили насиченим розчином бікарбонату натрію (NaHCO 3) і H2O, висушили на повітрі, щоб отримати 4-(2-хлорпіридин-3-іл)піримидин-2-амін у вигляді майже білої твердої + речовини. MS m/z=207 [M+1] . Обчислено для C9H7ClN4: 206,63. Етап 2: 4-(2-(4-амінофенокси)піридин-3-іл)піримідин-2-амін В пробірку для багаторазового використання додали 4-амінофенол (1,3 г; 12 ммоль), карбонат цезію (7,8 г; 24 ммоль) і ДМСО (16 мл, 0,75 М). Суміш нагріли до 100ºС впродовж 5 хвилин, після чого додали 4-(2-хлорпіридин-3-іл)піримідин-2-амін (2,5 г; 12 ммоль). Отриману реакційну суміш нагрівали до 130ºС впродовж ночі. Після завершення реакції за результатами РХМС реакційній суміші дали охолонути до КТ і розвели водою. Отриманий преципітат відфільтрували, і тверду фазу промили водою і діетиловим ефіром. Потім тверду речовину взяли у співвідношенні 9:1 CH2Cl2:MeOH і пропустили через шар силікагелю з використанням в якості елюенту суміші 9:1 CH2Cl2:MeOH. Розчинник концентрували у вакуумі для отримання + бажаного продукту, 4-(2-(4-амінофенокси)піридин-3-іл)піримідин-2-аміну. MS m/z=280 [M+1] . Обчислено для C15H13N5O: 279,30. Етап 3: 1-Хлор-4-(4-метилтіофен-2-іл)фталазин 1,4-Дихлорфталазин (1,40 г; 7,03 ммоль), 4-метилтіофен-2-ілборинову кислоту (999 мг; 7,03 ммоль) і PdCl2 (DPPF) (721 мг, 985 мкмоль) додали в герметичну пробірку. Пробірку продули аргоном. Потім додали карбонат натрію (2,0 М у воді) (7,74 мл; 15,5 ммоль) і 1,4-діоксан (35,2 мл; 7,03 ммоль). Пробірку герметично закрили, перемішували при КТ впродовж 5 хвилин і 5 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 помістили в попередньо нагріту масляну ванну при 110ºС. Через 1 годину аналіз методом РХМС показав продукт і побічний продукт (подвійне сполучення), а також вихідний матеріал дихлорфталазин. Реакційну суміш охолодили до КТ, профільтрували через шар целіту з використанням етилацетату (EtOAc), концентрували і завантажили в колонку. Продукт очистили за допомогою колонкової хроматографії з використанням Hex для видалення верхньої плями, потім сумішшю 80:20 гексани:EtOAc для отримання продукту. Продукт, 1-хлор-4-(4метилтіофен-2-іл)фталазин отримали у вигляді жовтої твердої речовини. Аналіз методом РХМС показав, що продукт був засмічений невеликою кількістю дихлорфталазину і побічного + продукту подвійного сполучення. MS m/z=261 [M+1] . Обчислено для C13H9ClN2S: 260,12. Етап 4: N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1фталазинамін До 4-(2-(4-амінофенокси)піридин-3-іл)піримідин-2-аміну і 1-хлор-4-(4-метил-2тієніл)фталазину додали tBuOH. Отриману суміш нагрівали при 100ºС в герметично закритій пробірці впродовж 16 годин. Реакційну суміш розвели діетиловим ефіром і насиченим розчином карбонату натрію і енергійно перемішали. Отримані тверді речовини відфільтрували, промили водою, діетиловим ефіром і висушили на повітрі, щоб мати N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинамін у вигляді майже білої твердої + речовини. MS m/z=504 [M+H] . Обчислено для C28H21N7OS: 503,58. Метод РХ-МС Зразки прогнали на системі Agilent моделі-1100 LC-MSD з колонкою зі зверненою фазою Agilent Technologies XDB-C8 (3,5 мкм) (4,6 × 75 мм) при 30ºС. Швидкість потоку була постійною і коливалась в межах від приблизно 0,75 мл/хв. до приблизно 1,0 мл/хв. В якості мобільної фази використовували суміш розчинника А (H2O/0,1 % HOAc) і розчинника В (AcCN/0,1 % HOAc) з 9-хвилинним періодом часу для градієнту від 10 % до 90 % розчинника В. За цим градієнтом слідував 0,5-хвилинний період для повернення до 10 % розчинника В і 2,5-хвилинний період для повторного врівноважування (промивання) 10 % розчинником В колонки. Інші методи також можуть використовуватись для синтезування AMG 900. В цій галузі відомо багато перетворень синтетичної хімії, а також методологій з використанням захисних груп, які можуть бути застосовані для синтезування AMG 900. Література, що описує перетворення органічної хімії, включає, наприклад, R. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene & P.G.M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3-є видання, John Wiley & Sons (1999); L. Fieser & M. Fieser, Fieser & Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley & Sons (1994); A. Katritzky & A. Pozharski, Handbook of Heterocyclic Chemistry, 2-е видання (2001); M. Bodanszky, A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg (1984); J. Seyden-Penne, Reductions by the Aluminoand Borohydrides in Organic Synthesis, 2-е видання, Wiley-VCH, (1997); та L. Paquette, editor, Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley & Sons (1995). AMG 900 тестували на його здатність зменшувати чи пригнічувати прогресування пухлини в різних клітинних лініях (in-vitro) і багатьох типів солідних пухлин (in-vivo), певні з яких раніше вже піддавались лікуванню і розвинули резистентність до стандартних антимітотичних агентів, включаючи таксани і алкалоїди барвінку, а також до інших хіміотерапевтичних агентів. Наступні Приклади і отримані дані будуть ілюструвати здатність AMG 900 лікувати рак, включаючи рак, резистентний до сучасних стандартних видів терапії, включаючи антимітотичні агенти, такі як паклітаксель, та інші лікарські препарати, використовувані в комбінації з хіміотерапією, такі як доксорубіцин. Коли не вказується інше, в описаних далі Прикладах AMG 900 було використано у формі вільної основи. Приклад 2 Для дослідження того, чи індукована AMG 900 супресія активності Aurora кінази A і В пригнічує проліферацію клітин, антипроліферативну дію AMG 900 оцінювали in vitro з використанням 32 пухлинних клітинних ліній людини. Як показано в Таблиці 1 і Таблиці 2, AMG 900 продемонстрував антипроліферативну активність як в солідних, так і в гематологічних пухлинних клітинних лініях. Ця антипроліферативна активність спостерігалась при концентраціях AMG 900 в низькому наномолярному діапазоні (значення ЕС50 від 1 до 5 нМ). Важливо, що чотири з цих чутливих до AMG 900 солідних пухлинних клітинних ліній (HCT15, MES-SA Dx5, 769P і SNU449) є резистентними до паклітакселю та інших хіміотерапевтичних агентів. Ракові клітини, резистентні до багатьох лікарських препаратів різної хімічної структури та/або резистентні до лікарських препаратів, націлених на різні мішені, називають "мультирезистентними". Головним механізмом множинної лікарської стійкості (MDR), використовуваним раковими клітинами, є виведення лікарського препарату, опосередковане 6 UA 107675 C2 5 10 15 родиною АТФ-зв'язуючих касетних транспортерів (АВС), таких як продукт гену mdr-1 Рглікопротеїн (P-gp). Наприклад, резистентна до доксорубіцину клітинна лінія людської матки MES-SA Dx5 експресує P-gp і є резистентною (30-1200-кратно порівняно з батьківською лінією) до низки хіміотерапевтичних агентів, включаючи даунорубіцин, дактиноміцин, колхіцин, вінбластин, вінкристин, паклітаксель, етопозид і мітоксантрон. Для подальшого дослідження активності AMG 900 в MDR-експресуючих клітинах, було проведене тестування трьох резистентних до таксолу пухлинних клітинних ліній з порівнянням з відповідними батьківськими клітинними лініями. Як показано на Фіг. 1-3 і в Таблиці 3, AMG 900 демонстрував активність у всіх трьох вказаних резистентних і чутливих до таксолу пухлинних клітинних лініях при значеннях ЕС50 < 2 нМ. Таксол показав значну втрату активності (10-100-кратно) в пухлинних сублініях, що експресують P-gp, у порівнянні з батьківськими клітинними лініями. Взяті разом, ці дані засвідчують, що AMG 900 пригнічує гістон Н3 фосфорилювання (проксимальний субстрат Aurora кінази B) і блокує поділ клітин пухлинних клітинних ліній, резистентних до паклітакселю та інших хіміотерапевтичних агентів. Матеріали і способи Матеріали, що тестуються Продукт, що тестується: Склад: Джерело: 20 AMG 900 ДМСО Amgen Inc. Основні реагенти Розчини для промивання і фіксації Розчин фосфатного буферу Дульбекко, Кат. № 14090-144, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Дистильована вода (d) H20 Кат. № 2F7115, Baxter Health care Corp., Deerfield, IL 60015 Метиловий спирт, Кат. № 3041-10, Mallinckrodt Chemicals, 90 % Метиловий спирт в dH20 Phillipsburg, NJ 08865 Буфер для відмивання (в 1X PBS) – FACS аналіз Кат. № 810111, Кількість 50 мл, ICN Biomedicals Inc. Aurora, OH 1 % BSA 44202 0,2 % Triton X-100 Кат. № 9284, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Буфер для відмивання – Cellomics Розчин фосфатного буферу Дульбекко, Кат. № 14090-144, 1X PBS Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 1 % нормальна козяча Кат. № G-9023-10 мл, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 сироватка Кат. № P-1379, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 1 % Твин-20 1X PBS Кислотний буфер (в dH20) 2N HCL 0,5 % Triton X-100 2X Фіксація формальдегідом (в 1X PBS) – Cellomics 20 % формальдегід, 0,024 % глутаральдегід Соляна кислота 37 %, Кат.№ JT953000, Номер партії відсутній, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Кат. № 9284, Номер партії відсутній, 500 мл, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178VWR Intern. Inc., West Chester, PA 19380 Кат. № F1635-500 мл, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Кат. № 85191, Fluka/Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Реагенти Йодид пропідію/буфер для забарвлення РНКази ДМСО, диметилсульфоксид Антитіло анти-фосфо-Гістон H3 (Ser10) (p-гістон H3), маркер мітозу PI/RNAse, Кат. № 550825, 100 мл, Becton Dickinson, San Jose, CA 95131 Кат. № D2650, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Кат. № 06-570, Upstate Cell Signaling Solutions, Lake Placid, NY 12946 25 7 UA 107675 C2 Антикроляче козяче IgG антитіло, кон'юговане з флуоресцентним барвником Alexa Flour 488 Hoechst 33342 тригідрохлорид, тригідрат Анти-бромдеоксиуридин, мишачий IgG1, моноклональний PRB-1, Alexa Fluor 647 кон'югат (анти-BrdU, Alexa-647) Кроляче моноклональне антиактивне Caspase-3 антитілі, кон'юговане з FITC (антиКаспаза-FITC) BrdU- реагент для мічення (базова концентрація не вказана) 1X Трипсин–EDTA, 0,5 % 1X Versene Середовище McCoys 5A з LГлутаміном Середовище RPMI 1640 з LГлутаміном DMEM з високим вмістом глюкози, 4,5 г/л D-глюкози, з LГлутаміном FBS, фетальна бичача сироватка, походження Австралія Таксол (Паклітаксель) Вінбластин Кат. № A11001, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Ка. № H3570, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № A21305, Lot#54656A, Invitrogen Corp. Carlsbad, CA 92008 100 тестів, Кат. № 559341, Lot# 60509, BD Pharmingen, San Diego, CA 92121 Кат. № 00-0103, Zymed Laboratories, Carlsbad, CA 92008 Кат. № 25300-054, Invirtogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № 15040-066, Invirtogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № 16600-082 Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № 11875-093, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № 11965-092 Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № 10099-141, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA 92008 Кат. № T7402, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Кат. № V1377, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 Лабораторне устаткування, поставки, програмне забезпечення Настільна центрифуга з Allegra X-15R Centrifuge, Beckman Coulter, Fullerton, CA 92834 охолодженням Програмне забезпечення GraFit Erithacus Software, Horley Surrey, RH6 9YJ, UK v5 Програмне забезпечення XLfit Excel, Microsoft Inc., USA 4.2 GraphPad Software, Inc. 2236 Avenida de la Playa, La Jolla, CA GraphPad Prism v5 92037 Becton Dickinson LSRII Flow Cytometer, BD Biosciences, San Проточний цитометр Jose, CA 95131 96-лунковий планшет для тканинної культури, плоске дно Кат. № 3595, Номер партії відсутній, Corning Incorp. Life з кришкою для низького Sciences, Lowell MA 01851 випаровування, стерильний 12-лунковий планшет для тканинної культури, плоске дно Кат. № 353043, Номер партії відсутній, BD Labware, Franklin з кришкою для низького Lakes, NJ 07417 випаровування, стерильний 6-лунковий планшет для тканинної культури, плоске дно Ка. № 353046, Номер партії відсутній, BD Labware, Franklin з кришкою для низького Lakes, NJ 07417 випаровування, стерильний 5 8 UA 107675 C2 Штрипси пробірок для ПЛР, використовувані для FACS забарвлення 1,5-мл пробірки Еппендорфа Планшети Packard View-96 Пристрій для відмивання планшетів ELX405 Multidrop DW (глибока лунка) Cellomics Array Scan VTi 5 10 15 Кат. № 20170-004, № партії 711C7-7074, 0,2-мл пробірка для ПЛР, VWR Intl., West Chester, PA 19380. Кат. № 20901-551, Номер партії відсутній, VWR Intl., West Chester, PA 19380 Кат. №6005182, Номер партії відсутній, PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA 02451 Кат. № ELX405HT, BioTek, Winooski, VT 05404 Кат. № 5840177, Thermo Fisher Scientific Inc, Waltham, MA 02454 Cellomics-Thermo Fisher Inc, Waltham, MA 02454 Способи Активність AMG 900 оцінювали in vitro на батьківських і резистентних до лікарських препаратів пухлинних клітинних лініях, отриманих з тканин матки, молочної залози і легені. Кінцеві показники клітинного циклу і р-гістону Н3 визначали за допомогою проточної цитометрії і багатопараметричної візуалізації клітини, відповідно. Людська клітина і клітинна культура Людські пухлинні клітинні лінії були отримані від American Type Culture Collection (Manassas, VA), коли не вказується інше. Всі клітини утримувались при 37ºС в атмосфері з 5 % CO2. Клітинну лінію пухлини молочної залози CAL51 (ACC 302) було отримано від компанії DSMZ (GmbH). Клітинні лінії пухлини товстої кишки HCT-116_JH (генотип p21+/+) і HCT-116_JH (генотип p21-/-) були отримані по ліцензії від компанії John Hopkins University Genetics Resources Core Facility. Людські пухлинні клітинні лінії з відповідним культуральним середовищем Пухлинна клітинна лінія HCT-116_JH (генотип p21 +/+) HCT-116_JH (генотип p21 -/-) HCT-15 HT29 SW-620 SW480 HOP-92 HOP-62 NCI-H460 A549 Походження BT-549 BT-474 MDA-MB-231 T47D MCF-7 p53(+) MCF-7 p53(-) CAL51 SK-OV-3 MES-SA/Dx5 MES-SA Товста кишка Товста кишка Товста кишка Товста кишка Товста кишка Товста кишка Легеня Легеня Легеня Легеня Передміхурова залоза Передміхурова залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Яєчник Матка Матка SK-MEL-2 Шкіра A498 769P CAKI-1 Нирки Нирки Нирки PC-3 DU-145 9 Умови росту тканинної культури (всі середовища містять 1x глютамін) McCoy's 5A, 10 % FBS+L-глютамін McCoy's 5A, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін McCoy's 5A, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін Ham's F12K+10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін DMEM+ +10 % FBS+1XNEAA+L-глютамін McCoy's 5A, 10 % FBS+L-глютамін McCoy's 5A, 10 % FBS+L-глютамін McCoy's 5A, 10 % FBS MEM, 10 % FBS, 1 мМ Na піруват, 0,1 мМ NEAA+L-глютамін MEM, 10 % FBS, 1x NEAA+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін McCoy's 5A, 10 % FBS+L-глютамін UA 107675 C2 SK-HEP-1 SNU449 K562 MOLT-4 HL-60 Jurkat U266-B1 RPMI-8226 NCI-H460 таксол-r MDA-MB-231(F11)-luc MDA-MB-231(F11)-luc таксол-r 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Печінка MEM, 10 % FBS, 1x NEAA+L-глютамін RPMI 1640, 10 % FBS, 10 мМ HEPES, 1 мМ Печінка Na піруват + L-глютамін Лейкемія RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін Лейкемія RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін Лейкемія RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін Лейкемія RPMI 1640, 10 % FBS+L-глютамін Мієлома RPMI 1640, 15 % FBS+L-глютамін Мієлома RPMI 1640, 20 % FBS+L-глютамін Легеня RPMI 1640, 10 % FBS, 75 нМ Таксол Молочна залоза DMEM, 10 % FBS Молочна залоза DMEM, 10 % FBS, 50 нМ Таксол Панель клітинної лінії солідної пухлини, обробленої AMG 900: Антипроліферативний аналіз (ArrayScan VTi) Пухлинні клітини засівали в 96-лунковий планшет Packard View в 100 мкл відповідного повного середовища зі щільністю 3000 чи 5000 клітин на лунку в залежності від кінетики росту клітинної лінії (в широкому визначенні - повільна vs швидкої). Всі розведення здійснювали з використанням робочої станції Biomek FX. Наступного дня клітини обробляли AMG 900 (11точковий діапазон доз від 0,156 до 0,0003 мкМ) з кінцевою концентрацією ДМСО в середовищі 0,12 %. Через 24 години середовище, яке містило сполуку, видаляли і відмивали клітини повним середовищем. Потім клітини інкубували в 100 мкл свіжого повного середовища (без сполуки) впродовж 48 годин. Через 48 годин клітини фіксували шляхом додавання 100 мкл буферу для фіксації на 100 мкл повного середовища. Клітини інкубували при кімнатній температурі 10 хвилин. Фіксуючий буфер аспірували, після чого клітини робили проникними в 100 мкл буферу для відмивання впродовж 30 хвилин при кімнатній температурі з наступним додаванням 100 мкл буферу, що зафарбовує ДНК, і інкубували при кімнатній температурі впродовж 30 хвилин в темряві. Потім клітини відмивали з використанням 100 мкл буферу для відмивання і зберігали в 100 мкл 1 х PBS при 4 градусах Цельсія до проведення аналізу. Клітинні характеристики отримували шляхом сканування 96-лункових планшетів на системі Cellomics "ArrayScan VTi". Кількісне визначення площі ядра і інтенсивності індивідуальної клітини здійснювали на основі забарвлення флуоресцентним барвником для ДНК Hoechst 33342. Граничне значення площі ядра було встановлене на основі контрольних лунок, оброблених ДМСО, для підрахунку кількості ядер з нормальним розміром серед ядерного дебрису і поліплоїдних клітин. Цю граничну величину було використано для підрахунку кількості нормальних ядер в шести полях зображення на лунку із застосуванням збільшення 10х. Криві доза-концентрація и значення ЕС50 були обчислені з використанням 4-параметричного рівняння. Панель гематологічної клітинної лінії, обробленої AMG 900: Мультипараметричний аналіз вмісту ДНК в клітинному циклі (Проточна цитометрія) Пухлинні клітини засівали в 300-мкл глибокий 96-лунковий планшет в 150 мкл відповідного повного середовища зі щільністю 100000 клітин на лунку. Клітини обробляли AMG 900 (10точкових доз в діапазоні від 0,156 до 0,0003 мкМ) з кінцевою концентрацією ДМСО в середовищі 0,2 %. За дві години до збирання клітини імпульсно мітили BrdU до кінцевої концентрації 1:100 в середовищі. Через 48 годин 100 мкл середовища видаляли з кожної лунки за допомогою піпеткового дозатору для мультилункових планшетів. Потім клітини переносили в штрипси пробірок для ПЛР в 200 мкл середовища. Клітини центрифугували при 2000 об/хв. при 18ºС впродовж 4 хвилин, після чого аспірували супернатант. Клітини ж фіксували в 200 мкл льодяного 90 % метилового спирту і зберігали при -20ºС щонайменше 24 години перед забарвленням антитіла і ДНК. Фіксовані клітини центрифугували при 2000 об/хв. впродовж 4 хвилин для видалення 90 % метилового спирту. Клітини промивали 200 мкл буферу для відмивання, після чого обробляли 100 мкл кислотного буферу при кімнатній температурі впродовж 1 години в темряві. Клітини двічі промивали 200 мкл буферу для відмивання (до досягнення рН 7.0, підтвердженого індикаторним папером). Клітини інкубували з коктейлем антитіл анти-BrdU-Alexa 647 (3 мкг/мл) і анти-Каспаза 3-FITC (20 мкл/лунку) в буфері для відмивання впродовж 2 годин при кімнатній температурі в темряві. Забарвлені клітини центрифугували і промивали 200 мкл буферу для відмивання. Клітини контрзабарвлювали 200 мкл йодиду пропідію (PI) впродовж ночі при 4ºС в темряві. Дані отримували і аналізували з використанням проточного цитометру (LSRII). Граничний інтервал застосовували у відповідності до вмісту ДНК, BrdU і позитивних/негативних у відношенні каспазе-3 популяцій на основі 10 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контролю ДМСО і з урахуванням обробки груп лікарським засобом низької/високої концентрації. Дані представлені як відсоток вмісту SubG1 ДНК, вмісту 4N+ ДНК, BrdU і популяцій, позитивних щодо розщеплення каспазою-3. Криві концентрація-ефект і значення ЕС50 були обчислені з використанням 4-параметричного рівняння. Клітинні лінії MES-SA Dx5 і MES-SA, оброблені AMG 900 або Паклітакселем (таксолом): Аналіз р-Гістону Н3 (ArrayScan VTi) Клітини MES-SA Dx5 і MES-SA наносили з щільністю 10000 клітин на лунку на 96-лунковий планшет в повне середовище і культивували впродовж 24 годин. Наступного дня клітини обробляли AMG 900 або таксолом в 10-точковому діапазоні концентрацій (від 1,25 мкМ до 0,0024 мкМ) впродовж 24 годин до кінцевої концентрації ДМСО в середовищі 0,1 %. Клітини відмивали і фіксували шляхом додавання 100 мкл 2х формальдегідного фіксуючого буферу впродовж 10 хвилин при кімнатній температурі. Клітини промивали і робили проникними з використанням 100 мкл буферу для відмивання впродовж 15 хвилин. Клітини імунофлуоресцентно забарвлювали антитілом до р-гістону Н3 (5 мкг/мл) і інкубували при кімнатній температурі впродовж 2 годин. Далі клітини промивали в 100 мкл буферу для відмивання. Після цього клітини інкубували з козячим антикролячим антитілом, кон'югованим з флуоресцентним барвником Alexa-488 (1,5 мкг/мл) в буфері для відмивання, доповненому барвником для ДНК Hoechest (1 мкг/мл), і інкубували при кімнатній температурі в темряві впродовж 30 хвилин. Клітини двічі промивали з використанням 100 мкл буферу для відмивання. 96-Лункові планшети аналізували на системі Cellomics "ArrayScan VTi" з використанням BioApplication Algorithm (TargetActivation.V2). Відсоток об'єктів р-гістону Н3+ (підсумовування 6 ділянок зображення на лунку об'єктивом 10х) використовували для побудови кривих концентрація-ефект і отримання значень ЕС50 з використанням 4-параметричного рівняння. Батьківська і резистентні до Таксолу клітинні лінії NCI-H460, оброблені AMG 900 або Паклітакселем (таксолом): Аналіз вмісту ДНК в клітинному циклі (проточна цитометрія) Батьківські клітини NCI-H460 і резистентні до таксолу клітини NCI-H460 засіяли з щільністю 500000 клітин на лунку в 6-лунковий планшет в 2 мл відповідного повного середовища. Наступного дня клітини обробили AMG 900 чи таксолом в 6-точковому діапазоні концентрацій з кінцевою концентрацією ДМСО в середовищі 0,05 %. Через 24 години клітини імпульсно помітили BrdU (розведення 1:100) і зібрали. Клітини центрифугували при 1600 об/хв. впродовж 4 хвилин, після чого аспірували супернатант. Клітини відмили в 1х PBS, зафіксували в 900 мкл льодяного 90 % метилового спирту і зберігали при -20ºС. Фіксовані клітини центрифугували при 2000 об/хв. впродовж 4 хвилин для видалення 90 % метилового спирту. Клітини промили 200 мкл буферу для відмивання і піддали забарвлюванню з використанням 200 мкл йодиду пропідію (PI) впродовж ночі при 4ºС в темряві. Дані отримували і аналізували за допомогою проточного цитометру (LSRII). Граничний інтервал застосовували у відповідності до вмісту +4N (аналогічно ≥ 4N) ДНК і позитивних у відношенні SubG1 популяцій на основі обробленої ДМСО контрольної групи і груп, оброблених лікарським засобом низької/високої концентрації. Дані представлені як відсоток субпопуляцій, позитивних у відношенні +4N ДНК і SubG1. Вміст +4N (аналогічно ≥ 4N) ДНК або значення клітинної ЕС50 для SubG1 були обчислені з використанням 4-параметричного рівняння. Батьківська клітинна лінія MDA-MB-231 (F11)-luc і резистентна до Таксолу клітинна лінія, оброблені AMG 900 або Паклітакселем (таксолом): Аналіз вмісту ДНК в клітинному циклі (проточна цитометрія) Батьківські MDA-MB-231(F11)-luc і резистентні до таксолу клітини засіяли з щільністю 250000 клітин на лунку в 12-лунковий планшет в 1 мл відповідного середовища в дублікаті. Наступного дня клітини обробили AMG 900 чи таксолом в 10-точковому діапазоні концентрацій з кінцевою концентрацією ДМСО в середовищі 0,1 %. Через 24 години клітини зібрали за допомогою 1х трипсин-EDTA і перенесли в пробірки для ПЛР. Клітини центрифугували при 2000 об/хв. впродовж 4 хвилин, після чого аспірували супернатант. Клітини зафіксували в 200 мкл льодяного 90 % метилового спирту і зберігали при -20ºС щонайменше впродовж 24 годин. Фіксовані клітини центрифугували при 2000 об/хв. впродовж 4 хвилин, щоб видалити 90 % метилового спирту. Клітини промили буфером для відмивання і піддали фарбуванню з використанням 200 мкл йодиду пропідію (PI) впродовж 30 хвилин при 4ºС в темряві. Перед зняттям даних додатково додали 400 мкл PI. Дані отримували і аналізували за допомогою проточного цитометру (LSRII). Граничний інтервал застосовували у відповідності до вмісту +4N (аналогічно ≥ 4N) ДНК на основі контрольної групи ДМСО і груп, оброблених лікарським засобом низької/високої концентрації. Дані представлені як відсоток від контролю для популяцій, позитивних у відношенні вмісту +4N ДНК. Значення ЕС 50 залежно від клітинного вмісту +4N ДНК приписувались з використанням 4-параметричного рівняння. 11 UA 107675 C2 Таблиця 1 AMG 900 пригнічує in vitro клітинну проліферацію багатьох типів солідних пухлин Пухлинна клітинна лінія HCT 116_JH_p21-/HCT 116_JH_p21+/+ HCT15* HT29 SW620 SW480 HOP-92 HOP-62 NCI-H460 A549 PC3 DU145 BT549 MDA-MB-231 T47D MCF7-p53+ MCF7-p53CAL51 SK-OV-3 MES-SA Dx5* SK-MEL-2 A498 769P* CAKI-1 SK-HEP-1 SNU449* Походження Товста кишка Товста кишка Товста кишка Товста кишка Товста кишка Товста кишка Легеня Легеня Легеня Легеня Передміхурова залоза Передміхурова залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Молочна залоза Яєчник Матка Шкіра Нирка Нирка Нирка Печінка Печінка AMG 900 EC50 (мкМ) 0,001 0,001 0,002 0,005 0,002 0,002 0,002 0,002 0,001 0,001 0,002 0,002 0,004 0,002 0,005 0,001 0,003 0,002 0,002 0,001 0,002 0,001 0,002 0,001 0,001 0,002 *Резистентні до Паклітакселю пухлинні клітинні лінії (Gyorffy et al, 2006; Harker, G.A. et al. Multidrug (Pleiotropic) Resistance in Doxorubicin-selected Variants of Human Sarcoma Cell Line MES-SA. Cancer Research 1985: 45: 4091-4096; Szakacs, G. et al. Predicting drug sensitivity and resistance: Profiling ABC transporter genes in cancer cells, Cancer Cell 2004: 6: 129-137; Szakacs, G. et al. Targeting multi-drug resistance in cancer. Nat. Rev. Drug Discovery 2006: 5: 219-234. Таблиця 2 AMG 900 блокує in vitro клітинний поділ в певних типах гематологічних пухлин Пухлинна клітинна лінія HL-60 K562 MOLT-4 Jurkat RPMI-8226 U266-B1 5 Гематологічний тип Промієлоцитарний лейкоз Хронічний мієлолейкоз Т-клітинний лейкоз Т-клітинний лейкоз Множинна мієлома Множинна мієлома AMG 900 EC50 (мкМ) 0,002 0,001 0,002 0,001 0,002 0,002 Клітини оброблялись AMG 900 впродовж 48 годин (без видалення сполуки). Проточна цитометрія – основний аналіз виконувався з використанням кількох кінцевих показників (розщеплення каспазою-3, BrdU, SubG1 і вміст +4N ДНК (вміст ≥4N ДНК). Значення ЕС 50 отримували з використанням кінцевого показника вміст +4N ДНК. Наведені значення ЕС 50 представляють собою одну 10-точкову криву доза–реакція. 12 UA 107675 C2 Таблиця 3 AMG 900 зберігає активність in vitro в пухлинних клітинних лініях, резистентних до Паклітакселю Походження a Матка Молочна b залоза Легеня c Пухлинна клітинна лінія MES-SA 1 MES-SA Dx5 MDA-MB-231 2 MDA-MB-231-Taxol-r NCI-H460 2 NCI-H460-Taxol-r Батьківська лінія Доксорубіцин Батьківська лінія Паклітаксель Батьківська лінія Паклітаксель AMG 900 EC50 (мкМ) @ 24 год. 0,1 Резистентність (r), визначена як ≥10-кратна втрата активності (значення ЕС50) в сублінії у порівнянні з батьківською лінією. *Аналіз р-гістону Н3 на основі целоміки. Наведені значення ЕС 50 представляють один експеримент з використанням 10-точкової кривої доза-реакція. b Аналіз вмісту ДНК методом проточної цитометрії. Значення ЕС50 отримували за допомогою відповідного кінцевого показника вміст ДНК (вміст ≥4N ДНК (AMG 900) і Sub G 1 (паклітаксель)). Значення ЕС50 представляють один експеримент, здійснений в дублікаті з використанням 10-точкової кривої доза-реакція. Клітинні лінії MDA-MB-231 містять трансген, який експресує зелений флуоресцентний білок і білок люциферазу. с Аналіз вмісту ДНК методом проточної цитометрії. Значення ЕС50 отримували за допомогою відповідного кінцевого показника вміст ДНК (вміст ≥4N ДНК (AMG 900) і Sub G1 (паклітаксель)). Значення ЕС50 представляють один експеримент, здійснений в дублікаті з використанням 6-точкової кривої доза-реакція. 1 Сублінія, резистентна до кількох лікарських препаратів, MES-SA Dx5, була встановлена з батьківської клітинної лінії MES-SA шляхом вирощування клітин в присутності зростаючих концентрацій доксорубіцину. Клітинна лінія MES-SA Dx5 гіперекспресує P-gp (Harker et al., 1985). 2 Паклітаксель-резистентні сублінії MDA-MB-231-Таксол-r і NCI-H460-Таксол-r були отримані з відповідних батьківських ліній шляхом вирощування клітин в присутності зростаючих концентрацій паклітакселю. Обидві сублінії є позитивними у відношенні P-gp за даними проточної цитометрії. 5 10 15 20 Фіг. 1: Дія AMG 900 і Таксолу на клітинні лінії MES-SA и MES-SA Dx5, значення ЕС50 для рГістону Н3 Клітинні лінії з пухлини матки обробляли контрольною сполукою (ДМСО), AMG 900 або паклітакселем (таксолом) в 10-точковому діапазоні доз (від 0,0024 до 1,25 мкМ) впродовж 24 годин. Потім клітини фіксували і забарвлювали антитілом до р-гістону Н3 і контрзабарвлювали з використанням барвника для ДНК (Hoechest). Аналіз на основі зображень (ArrayScan VTi) було виконано для визначення відсотку клітин, позитивних у відношенні р-гістону Н3. Криві дозареакція представляють концентрації AMG 900 чи таксолу, нанесені проти клітин, позитивних у відношенні р-гістону Н3, у вигляді відсотку обробленого ДМСО контролю (РОС). Значення ЕС 50 були обчислені за допомогою моделі з підбором 4 параметрів. Фіг. 2: Дія AMG 900 і Таксолу на батьківську клітинну лінію NCI-H460 і резистентну до Таксолу клітинну лінію NCI-H460, значення ЕС50 для вмісту ДНК в клітинному циклі Клітинні лінії пухлини легені обробляли контрольною сполукою (ДМСО), AMG 900 або таксолом в 6-точковому діапазоні доз впродовж 24 годин. Аналіз клітинного циклу методом проточної цитометрії було виконано для визначення відсотку клітин, позитивних у відношенні вмісту ≥4N ДНК чи вмісту SubG1 ДНК. Криві доза-реакція для AMG 900 представляють концентрацію лікарського засобу, нанесену проти відсотку клітин, позитивних у відношенні вмісту ≥4N ДНК. Криві доза-реакція для таксолу представляють концентрацію лікарського засобу, нанесену проти відсотку клітин, позитивних у відношенні вмісту SubG1 ДНК. Значення ЕС50 були обчислені за допомогою моделі з підбором 4 параметрів. Фіг. 3: Дія AMG 900 і Таксолу на клітинну лінію MDA-MB-231 і резистентну до Таксолу клітинну лінію MDA-MB-231, значення ЕС50 для вмісту ДНК в клітинному циклі 13 UA 107675 C2 5 10 15 20 Клітинні лінії пухлини молочної залози обробляли контрольною сполукою (ДМСО), AMG 900 чи таксолом в 10-точковому діапазоні доз впродовж 24 годин. Аналіз клітинного циклу методом проточної цитометрії здійснювали для визначення відсотку клітин, позитивних у відношенні вмісту ≥4N ДНК чи вмісту SubG1 ДНК. Криві доза-реакція для AMG 900 представляють концентрацію лікарського засобу, нанесену проти відсотку клітин, позитивних у відношенні вмісту ≥4N ДНК. Криві доза-реакція для таксолу представляють концентрацію лікарського засобу, нанесену проти відсотку клітин, позитивних у відношенні вмісту SubG1 ДНК. Значення ЕС50 були обчислені за допомогою моделі з підбором 4 параметрів. Приклад 3 Для дослідження того, чи пригнічує індукована AMG 900 супресія активності Aurora кінази клітинну проліферацію, антипроліферативну ефективність AMG 900 оцінювали in vivo на кількох моделях ксенотрансплантатів від людини, включаючи моделі раку молочної залози, товстої кишки, лейкозу, легені, підшлункової залози і матки, вирощених у безтимусних голих мишей. Мишам вводили орально AMG 900 в дозі 3,75, 7,5 чи 15 мг/кг BID (два рази на добу) впродовж 2 днів підряд на тиждень або 3 мг/кг BID щоденно на протязі всього дослідження, починаючи з моменту встановлення пухлини. Реагенти, розчини, устаткування, препарат AMG 900, визначення об'єму пухлини і обчислення були загалом такими, як описано в Прикладі 4 далі. Було встановлено, що AMG 900 достовірно пригнічує ріст пухлин у всіх тестованих моделях ксенотрансплантатів у порівнянні з контрольною групою, якій вводили тільки розчинник (Таблиця 4). Таблиця 4 AMG 900 пригнічує ріст багатьох ксенотрансплантатів пухлин в моделях на мишах Чутливість до Паклітакселю in vitro так ні так так ні ні так так так ND Походження пухлини Товста кишка Товста кишка Товста кишка Легеня Легеня Матка Матка Лейкоз Молочна залоза Підшлункова залоза Клітинна лінія HCT 116 HCT15 Colo 205 NCI-H460 NCI-H460-Taxol-r MES-SA Dx5 MES-SA HL60 MDA-MB-231 MiaPaCa2 AMG 900 %TGI* 83 51 58 85 66 73 86 68 82 62 (TGI) пригнічення росту пухлини, *%TGI, вибраний з періодичного чи безперервного режиму введення на основі найефективнішої реакції. (ND) не визначалась, Резистентність (r), визначена як ≥10-кратная втрата активності (значення ЕС50) у порівнянні з чутливими до таксану пухлинними клітинними лініями. 25 30 35 Дію AMG 900 тестували на мультирезистентній клітинній лінії MES-SA Dx5, вирощеній in vivo як ксенотрансплантат пухлини. Мишам вводили перорально AMG 900 в дозі 15 мг/кг BID (двічі на добу) впродовж 2 днів підряд на тиждень або 3 мг/кг BID щоденно на протязі всього дослідження, починаючи з моменту встановлення пухлини (через 10 днів після імплантації пухлини). Терапія препаратом AMG 900 мала своїм результатом статистично достовірне пригнічення росту пухлини при використанні обох доз і схем введення AMG 900 у порівнянні з контрольною групою, якій вводили тільки розчинник (Фіг. 4; p < 0,0001, тест Даннетта за отриманими результатами). Порівнянне пригнічення росту пухлини було неочікувано досягнуто також в 2-х інших резистентних до лікарських препаратів моделях (НСТ15 і NCI-H460-Таксол-r [резистентний]) при застосуванні подібних схем лікування (дивись Таблицю 4). Фіг. 4 AMG 900 пригнічує ріст встановлених пухлин, викликаних ксенотрансплантатами MESSA Dx5 6 Мультирезистентні клітини MES-SA Dx5, (2 × 10 ) ін'єктували підшкірно у правий бік самок безтимусних голих мишей. Пухлини оцінювали двічі на тиждень. Лікування починали на 10 день, 3 коли об'єм пухлини становив ~100 мм . AMG 900 вводили мишам перорально двічі на добу, періодично чи безперервно. Всі групи отримували корм на щоденній основі впродовж всього 14 UA 107675 C2 5 10 15 дослідження для підтримання маси тіла. Дані представляють середнє значення ± стандартна похибка середнього значення для кожної групи (n=10 на групу). Р-величини відповідають статистичній різниці між групами, обробленими тільки розчинником і AMG 900, визначеній за допомогою RMANOVA з наступним тестом Даннетта за отриманими результатами. Стрілка означає початок введення. Приклад 4 Для дослідження того, чи пригнічує індукована AMG 900 супресія активності Aurora кінази клітинну проліферацію, антипроліферативну ефективність AMG 900 оцінювали in vivo проти резистентних до таксолу пухлинних ксенотрансплантатів NCI-H460 у безтимусних голих мишей. AMG 900 мишам вводили перорально (РО) BID (двічі на добу) періодично чи безперервно. Паклітаксель (таксол) вводили мишам інтраперитонеально (IP) 5 днів на тиждень. Власну сполуку компанії Amgen використовували в цьому дослідженні в якості позитивного контролю (дані не показані). Пухлини оцінювали двічі на тиждень. Лікування починали на 12 день після встановлення пухлини. Всі групи отримували корм на щоденній основі впродовж всього дослідження для підтримання маси тіла. Тварини і тканини Вид/Лінія: Кількість/Стать: Безтимусні голі 125/самки 20 – 30 грамів на день рандомізації NCI-H460, резистентна до таксолу Amgen Cancer Pharmacology Cell Bank Миша, що несе пухлину Устаткування AMALAR Середня вага: Тип тканини: Джерело: Статус суб'єкта хвороби: Утримання тварин: Тестові матеріали 20 Продукт, що тестується: Виробник: Продукт, що тестується: Виробник: AMG 900 Amgen Inc. Таксол Bristol-Myers Squibb Склад основних реагентів Сполука, що тестується: Вихідна концентрація: Приготування: Розчинник: Доза (10 мл/кг при індивідуальній масі тіла): Шлях введення: Сполука, що тестується: Вихідна концентрація: Приготування: AMG 900 1,5; 0,3 мг/мл Щотижневе, використовувалась в межах 7 днів 2 % HPMC/1 % TW80 pH2,2 Діапазон доз: 0,20 – 0,30 мл Перорально (PO) Таксол 6 мг/мл Придбано у компанії Burt's Pharmacy Manufacturer: Bristol-Meyer's Squibb Фізіологічний розчин Розчинник: Доза (10 мл/кг при індивідуальній масі Діапазон доз: 0,20 – 0,30 мл тіла): Шлях введення: Інтраперитонеально (IP) 25 15 UA 107675 C2 5 Приготування AMG 900 (вільна основа) готували у вигляді суспензії з концентрацією 1,5 і 0,3 мг/мл. Об'єм, що вводився, був еквівалентним 10 мл/кг. Таксол (Bristol Meyers Squibb) було придбано у компанії Burt's Pharmacy (Newbury Park, CA); його щоденно розводили з базової концентрації 6 мг/мл до концентрації робочого розчину 1,25 мг/мл. Протокол лікування Група 1 2 PO PO Розчинник AMG 900 10 PO Шлях Лікування 10 IP Доза (мг/кг) 3 AMG 900 4 15 10 10 3 10 n Таксол 15 12.5 Схема BID 7 днів/ тиждень x 3 тижні BID 7 днів/ тиждень x 3 тижні BID 2 дні вводили/5 днів не вводили/ тиждень x 3 тижні Щоденно 5 днів/ тиждень x 2 тижні Тривалість фази введення для AMG 900 становила три тижні, для групи таксолу два тижні. Пухлини оцінювали за допомогою цифрового кронциркуля, мишей зважували двічі на тиждень. 3 2 Об'єм пухлини обчислювали наступним чином: Об'єм пухлини (мм ) = [(W X L)/2], де ширина (W) визначається як менше з 2-х вимірювань, а довжина (L) як більше з 2-х вимірювань. Пригнічення пухлини обчислювали наступним чином: Спочатку брали [Початковий об'єм пухлини мінус кінцевий об'єм пухлини] для контрольної і всіх лікувальних груп; далі брали зміну об'єму лікованої пухлини, поділену на об'єм контрольної пухлини, мінус одиниця, а потім множили на 100. Таблиця 5 і Фіг.5 далі представляють об’єм пухлин і результати щодо пригнічення росту пухлин. Таблиця 5 Підсумкові дані щодо об'єму пухлин Група Розчинник (HPMC) PO BID 7 днів AMG 900 3mpk PO BID 7 днів AMG 900 15mpk PO BID 2 дні Таксол 12.5mpk IP QD 5 днів 20 25 30 35 40 Середній 1680 771 689 1383 SE 215 104 107 283 % Пригнічення 0,0 60,4 65,7 19,7 Медіана 1749,7 715,6 612,5 1072,0 Фіг. 5 Вплив лікування AMG 900 і Таксолом на ріст встановлених резистентних до таксолу ксенотрансплантатів Н460 Фіг. 5 ілюструє вплив лікування сполуками AMG 900 і Таксол на ріст встановлених 6 резистентних до таксолу пухлин Н460. Клітини (2×10 на одну тварину) ін'єктували підшкірно в правий бік самок безтимусних голих мишей (n=10 на групу). Пухлини оцінювали двічі на тиждень. Введення сполук починали через 12 днів після імплантації пухлини (стрілка), коли 3 об'єм пухлини становив приблизно 170 мм . Сполуки вводили мишам РО чи PI один чи два рази на добу впродовж 3 тижнів. Дані представлені як середнє значення ± стандартна похибка середнього значення для кожної групи. Значення *Р (не показані) відповідають статистичній різниці між групами, яким вводили розчинник і AMG 900 чи Таксол, яка аналізувалась з використанням дисперсійного аналізу ANOVA з повторними вимірюваннями Шефе за певний час за допомогою програми STATview. Дні, передбачені схемою і наведені в позначеннях, представляють дні/ тиждень. Всі групи отримували корм на щоденній основі впродовж всього дослідження. Як показано на Фіг. 5 вище, лікування мишей з пухлинами препаратом AMG 900 достовірно пригнічувало ріст пухлини при безперервному введенні (3 мг/кг BID впродовж 7 днів (60 % пригнічення, р = 0,0003)) і при періодичному введенні (15 мг/кг BID впродовж 2 днів на тиждень (66 % пригнічення, p 500 468 >1250 2 16 43 49 + 3 >500 277 >1250 3 51 51 113 + 2 >500 >1250 >1250 Статус BCRP + Аналіз вмісту ≥4N ДНК, значення ЕС50 (нмоль/л) AMG 900 AZD1152 MK-0457 PHA-739358 2 12 46 67 3 865 162 >1250 Примітка: Місцем походження клітинної лінії NCI-H460-PTX є легені; клітинної лінії MDA-MB231-PTX – молочна залоза, клітинної лінії MES-SA Dx5 – матка, а клітини RPMI-8226 походять від клітин множинної мієломи. 18 UA 107675 C2 Подібні експерименти були проведені з іншими клітинними лініями, як показано в Таблиці 6В далі. Таблиця 6-В Клітинна EC50 (нМ) Клітинна лінія Походження AMG 900 AZD1152HQPA PHA739358 MK-0457 MCF-7 Молочна залоза 1 11 68 27 NCI-H460-PTX* Легеня 3 >500 >1250 468 HCT15* Товста кишка 2 >625 >1250 908 MES-SA Dx5* Матка 2 >500 >1250 >1250 MDA-MB-231-PTX* Молочна залоза 3 >500 >1250 277 SNU499* Печінка 2 >1250 >1250 ND 769P* Нирка 4 703 >1250 ND RPMI-8226** Множинна мієлома 3 865 >1250 162 Примітка: Статус переносника АВС (* = P-gp+; ** = P-gp- та/або BCRP+) ND = не визначалось 5 10 15 20 25 30 Приклад 6 Крім того, AMG 900 оцінювали in vivo проти клітин HCT-116, адаптованих до росту в присутності AZD1152, селективного інгібітору Aurora В кінази. Цей експеримент також дещо прояснив можливі альтернативні механізми резистентності до інгібіторів Aurora кінази. Так, клітини HCT116 адаптувались до росту в присутності AZD1152. Активність AMG 900 потім оцінювали в батьківській HCT116 і резистентній до AZD1152 клітинних лініях. Неочікувано було встановлено, що AMG 900 індукує поліплоїдність і пригнічує утворення колоній в сублінії HCT116, адаптованій до росту в присутності AZD1152. Клітинні значення ЕС 50 для вмісту ≥ 4N ДНК для AMG 900 становили 2 і 5 нмоль/л порівняно з 34 і 672 нмоль/л для AZD1152, відповідно (Фіг. 6-А). AMG 900 пригнічував утворення колоній в обох клітинних лініях HCT116 при концентраціях ≥5 нмоль/л, в той час як інша сублінія була нечутливою до AZD1152 при 50 нмоль/л (Фіг. 6-В). Обидві клітинні лінії HCT116 були однаково чутливими до паклітакселю і були негативними у відношенні експресії P-gp і BCRP (Фіг. 6-С). Примітно, що варіантна сублінія HCT116 містить міссенс-мутацію в алелі гену aurora-B (TGG  TTG; W221L), тоді як в генах aurora-A і -C не було виявлено жодних мутацій. Ці результати дозволяють припустити, що AMG 900 зберігає активність в пухлинних клітинах, що є резистентними до AZD1152, і більш конкретно, в пухлинних клітинах, які несуть гетерозиготну мутацію в aurora-B, яка може відповідати за резистентність до AZD1152. Таким чином, ці неочікувано позитивні результати засвідчують разючу здатність AMG 900 зберігати ефективність при лікуванні пухлинних клітин, що стали резистентними до AZD1152. Фіг. 6: Дія AMG 900 на батьківську клітинну лінію HCT116, резистентну до AZD1152 клітинну лінію HCT116 (Фіг. 6-А) і резистентні до паклітакселю клітинні лінії (Фіг. 6-В) Методи: Фіг. 6-А: Клітинні лінії НСТ116 оброблялись зростаючими концентраціями AMG 900 чи AZD1152 впродовж 24 годин. Для оцінки накопичення клітин з вмістом ≥ 4N ДНК, вираженим як відсоток від обробленого ДМСО контролю (РОС), використовували проточну цитометрію. Криві концентрація-реакція і обчислені значення ЕС 50 були визначені на основі двох незалежних експериментів (стовбці, ±SD). Фіг. 6-В. Аналіз утворення колоній здійснювали з клітинними лініями НСТ116 (батьківською і резистентною до AZD1152). Клітини оброблялись ДМСО, AMG 900, AZD1152 або паклітакселем 19 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 у вказаних концентраціях впродовж 48 годин і заново засівались в повне середовище, яке не містило інгібітору. Після того, як оброблені ДМСО клітини досягали злиття, клітини фарбували кристалічним фіолетовим і отримували зображення (дублікатні лунки). Фіг. 6-С: Ступінь експресії P-gp і BCRP на клітинній поверхні клітинних ліній НСТ116 (батьківської і резистентної до AZD1152), спільно зафарбованих антитілами до кон'югованого до фікоеритрину (РЕ) P-gp і кон'югованого до алофікоціаніну (АРС) BCRP, оцінювались і аналізувались з використанням проточної цитометрії. Ізотипний контроль застосовувався для кожної клітинної лінії для встановлення фонової флуоресценції. Клітинні лінії MES-SA-Dx5 і RPMI 8226 використовувались в якості позитивного контролю для експресії P-gp і BCRP, відповідно. Тварини: Самок безтимусних голих мишей (Harlan Sprague Dawley) віком 5-6 тижнів отримували і розміщували в стерилізованих клітках. Воду, очищену зворотним осмосом, і оброблений в автоклаві корм постачали без обмеження. Всі дослідження на тваринах проводились згідно з внутрішнім протоколом LACUC і з дотриманням всіх вимог AAALAC. Фармакодинамічні аналізи (Виявлення фосфо-Гістону Н3): Мишам з встановленими після ксенотрансплантації людськими пухлинами НСТ 116 чи Colo 205 вводили одну оральну дозу контрольної речовини (тільки розчинник) або AMG 900 у вказаній дозі (n=3 тварини на групу). Через 3 або 6 годин брали зразки пухлини, кісткового мозку чи шкірних тканин для фармакодинамічної оцінки (рівні р-гістону Н3). Брали також зразки плазми для фармакокінетичного аналізу. Проточна цитометрія (FCM): Пухлини дисоціювали до одноклітинної суспензії і фіксували в 90 % метиловому спирті при -20ºС впродовж щонайменше 24 годин. Потім клітини фарбували анти-р-гістоновими Н3 (ser-10) і анти-цитокератиновими антитілами і контрфарбували йодидом пропідію. Показники отримували на проточному цитометрі LSRII c використанням програмного забезпечення FACSDiva. Кістковий мозок і пухлинні клітини, позитивні у відношенні цитокератину, у G2M-фазі клітинного циклу оцінювали щодо р-гістону Н3. Клітини пухлини і кісткового мозку, взяті від мишей, оброблених розчинником, слугували вихідним контролем щодо р-гістону Н3. Статистичну значимість визначали з використанням аналізу ANOVA. Скануюча лазерна цитометрія (LSC): Зрізи в триплікаті із зразків тканини FFPE (шкіра і пухлина) фарбували послідовно анти-р-гістоновим Н3 антитілом і козячим антикролячим IgG, кон'югованим з Alexa-633. Зрізи монтували з використанням середовища Prolong Gold antifade, яке включало барвник для ДНК Hoechst33342. Зображення вводили в LSC з використанням об'єктиву 40х (з розрізнювальною здатністю 0,5 мкм). Число р-гістонових Н3 явищ визначали на основі встановленого граничного значення червоного флуоресцентного. Підраховували тільки 2 явища, які перевищували 20 мкм . Контурні явища переносились в галерею зображень для верифікації точності сегментування. Дані аналізували з використанням SAS V9.3 із застосуванням регулювання Даннетта. Всі статистичні тести оцінювались при рівні значимості альфа = 0,05. Тонкоголкові пунктати (FNA): Пухлинні аспірати брали за допомогою голки 25 калібру через маленький надріз в шкірі, що оточує пухлину, за попередньо встановленою і постійною схемою (3х), а потім вичавлювали в 2 % параформальдегід. Клітини наносили на предметне скельце мікроскопу, фарбували антитілами, специфічними до EpCAM (епітеліальний пухлинний маркер, Alexa Fluor 488) і pHH3 (маркер мітозу, Alexa 647), і контрфарбували DAPI (вміст ДНК). iCyte LSC (лазери 405 нм, 488 нм, 633 нм, РМТ фільтри: 450/40, 530/30, 650/LP) було використано для отримання зображень зі збільшенням 40х і кількісного визначення вмісту EpCAM, pHH3 і ДНК. Цілісність популяції перевіряли шляхом переміщення зображень клітин в галереї. Представлені дані щодо кількості клітин в G2M, позитивних у відношенні EpCAM, pHH3. Дані представлені як середнє значення +/- стандартна похибка середнього значення (SEM). Статистичну значимість визначали з використанням ANOVA і наступного аналізу за отриманими результатами Бонферроні-Даннетта. Концентрація AMG 900 в плазмі (фармакокінетичний аналіз): Зразки плазми (50 мкл) екстрагували шляхом додавання суміші розчинників (90 % метилового спирту, 10 % води з 0.01 % трифтороцтової кислоти), щоб виділити матеріал, що аналізується, і осадити білки плазми. Концентрацію AMG 900 в екстрагованих зразках визначали методом РХ-МС/МС (LC-MS/MS) з використанням обернено-фазової хроматографії на аналітичній колонці Varian Pursuit PFP (2,0 × 30 мм, 5 мікрон) за допомогою 0,1 % мурашиної кислоти у воді (мобільна фаза А) і ацетонітрилу з 0,1 % мурашиної кислоти (мобільна фаза В). Моделі ксенотрансплантатів: 6 Мишам ін'єктували підшкірно 2 × 10 клітин пухлини товстої кишки людини НСТ 116. Після 3 встановлення пухлини (приблизно 200 мм ) мишей рандомізували в експериментальні 20 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 лікувальні групи (n=10) і вводили їм орально AMG 900 в дозі 1,5; 2,25 чи 3 мг/кг щоденно, або 3,75; 7,5 чи 15 мг/кг с інтервалами впродовж всього експерименту. Миші отримували корм на щоденній основі. Об'єм пухлини і масу тіла записували двічі на тиждень, використовуючи кронциркуль і аналітичні цифрові ваги, відповідно. Дані щодо пухлин представлені як середній об'єм пухлини +/- SEM. Статистичну значимість для пригнічення росту пухлини визначали за допомогою ANOVA з повторними вимірюваннями (RMANOVA) и наступного аналізу Шефе за отриманими результатами. Приклад 7 Додатково, оцінювали дію AMG 900 in-vivo на ріст пухлини на панелі ксенотрансплантатів п'яти різних типів пухлин людини (молочна залоза, товста кишка, легеня, підшлункова залоза і матка), включаючи три моделі з ксенотрансплантатами MDR. Мишам, що несуть встановлені пухлини, AMG 900 вводили орально в дозі 15 мг/кг двічі на день впродовж 2 послідовних днів на тиждень протягом 3 тижнів або в дозі 3 мг/кг двічі на день щоденно протягом 3 тижнів. Максимальний відсоток пригнічення росту пухлини (TGI) представлений в Таблиці 7 далі для кожної моделі з ксенотрансплантатом. Відсоток TGI обчислювали як різницю між зміною об'єму пухлин за весь період дослідження в контрольній групі тварин, які отримували тільки розчинник, і в експериментальних групах тварин, яким водили AMG 900. Статистичну значимість пригнічення росту пухлин у порівнянні з контрольними тваринами визначали за допомогою RMANOVA і наступних тестів за отриманими результатами Шефе чи Даннетта і позначали зірочками (*P < 0,005, **P < 0,0005). AMG 900 демонстрував значну протипухлинну активність у всіх 9 моделях ксенотрансплантатів: пригнічення росту пухлин (TGI) від 50 до 97 % порівняно з контрольною групою. Примітно, що AMG 900 був активним в моделях ксенотрансплантатів MES-SA-Dx5 (84 % TGI, P < 0,0001) і NCI-H460-PTX (66 % TGI, P < 0,0001), які були резистентними до доцетакселю чи паклітакселю, введеним у відповідних максимально переносимих дозах. Таким чином, AMG 900 пригнічує in vivo ріст ксенотрансплантатів багатьох пухлин людини, включаючи мультирезистентні моделі і стандартні антимітотичні лікарські агенти. Зокрема, ці дані показують, що AMG 900 разюче пригнічує активність aurora-В в пухлинах HCT 116 і стримує ріст багатьох ксенотрансплантатів, які представляють різні типи пухлин. 30 Таблиця 7 Максимальне TGI (%) Модель пухлини Походження MDA-MB-231 Молочна залоза 82** COLO 205 Товста кишка 73* HCT-15 (MDR) Товста кишка 50* HCT116 Товста кишка 85** NCI-H460 Легеня 85** NCI-H460-PTX (MDR) Легеня 65** MiaPaCa2 Підшлункова залоза 60** MES-SA Матка 87** MES-SA-Dx5 (MDR) Матка 84** Посилання: Payton M, Chung G, Yakowec P, et al. Discovery and evaluation of dual CDK1 and CDK2 inhibitors. Cancer Res 2006;66:4299-4308. 35 Показання Механізм розвитку пухлинами резистентності до інгібіторів Aurora кінази, очевидно, відрізняється для різних агентів. Хоча більш чітке розуміння молекулярних сил, що управляють фенотипами раку, буде забезпечувати основу для створення молекулярно націлених лікарських препаратів чи терапій, які уможливлять використання ідентифікованої генетичної чи 21 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 епігенетичної чутливості до призначеного лікування, важливо розуміти також генетичну основу резистентності до терапії. Таке розуміння генетичної схильності може стати додатковим фільтром для стратифікації перспективної популяції пацієнтів. Наприклад, опубліковані генетичні дані дозволяють припускати, що інгібітор Aurora кінази, AZD1152, який наразі проходить клінічну оцінку, і потенційно ще одна клінічна сполука, VX-680, можуть бути відносно неефективними в пухлинних клітинах, які гіперекспресують MDR1 чи BCRP. Мутації в домені Aurora кінази В, які з'являються під час відбору дефектної у відношенні репарації ДНК клітинної лінії карциноми товстої кишки НСТ116, можуть призводити до резистентності. Було показано, що ці мутації в каталітичному домені є достатніми також для того, щоб зробити клітини резистентними до AZD1152 і VX-680, а це засвідчує, що резистентність до цих агентів може виникати незалежно від MDR. The Pharmacogenomics Journal, (2009) 9, pgs 90-102. Даний винахід пропонує сполуку AMG 900, інгібітор Aurora кінази, яка володіє здатністю лікувати рак, що став рефрактерним до традиційних стандартних хіміотерапевтичних агентів, включаючи антимітотичні агенти, такі як таксани (паклітаксель і доцетаксель), і алкалоїди барвінку. Крім того, AMG 900 володіє здатністю лікувати рак, що є резистентним до інших агентів, які інгібують Aurora кіназу, включаючи, але не обмежуючись ними, AZD 1152, VX-680 і PHA-739358. Загалом, такі пухлини розвивають резистентність як результат попереднього та/або пролонгованого лікування протираковими агентами. Відповідно, в одному варіанті здійснення даного винаходу пропонується спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту ефективної кількості сполуки N-(4-((3-(2аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинамін, коли рак у цього суб'єкта раніше вже лікувався протираковими агентами. В іншому варіанті здійснення протираковим агентом є хіміотерапевтичний агент. В іншому варіанті здійснення цим хіміотерапевтичним агентом є антимітотичний агент чи антрациклін. В ще іншому варіанті здійснення цей хіміотерапевтичний агент є агентом, вибраним з групи, що складається з таксолу, доцетакселю, вінкристину, вінбластину, віндезину, а також вінорелбіну, даунорубіцину, доксорубіцину, ідарубіцину, епірубіцину і мітоксантрону. В ще іншому варіанті здійснення протираковим агентом є AZD1152, PHA-739358, MK-0457 або їх комбінація. Відповідно, AMG 900 може застосовуватись для лікування розладів клітинної проліферації, включаючи неконтрольований клітинний ріст і аномальну регуляцію клітинного циклу, лікування яких раніше здійснювалось стандартними методами з використанням таксанів. В зв'язку з цим, AMG 900 є корисним, але без обмеження, для попередження чи лікування раку, включаючи, наприклад, різні солідні і гематологічні пухлини, такі як карциноми, включаючи, але не обмежуючись ними, рак сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, нирки, печінки, легені (включаючи дрібноклітинний рак легені), стравоходу, жовчного міхура, яєчнику, підшлункової залози, шлунку, шийки матки, щитоподібної залози, передміхурової залози, матки і шкіри (включаючи плоскоклітинну карциному); гематопоетичні пухлини лімфоїдної лінії (включаючи лейкоз, гострий лімфоїдний лейкоз, гострий лімфобластний лейкоз, В-клітинну лімфому, Т-клітинну лімфому, лімфому Ходжкіна, не-ходжкінську лімфому, волосатоклітинну лімфому і лімфому Буркетта); гематопоетичні пухлини мієлоїдної лінії (включаючи гострі і хронічні мієлогенні лейкози (AML і CML), мієлодиспластичний синдром і промієлоцитарний лейкоз); пухлини мезенхімального походження (включаючи фібросаркому і рабдоміосаркому та інші саркоми, наприклад м'яких тканин і кісток); пухлини центральної і периферичної нервової системи (включаючи астроцитому, нейробластому, гліому і невриному); та інші пухлини (включаючи меланому, семиному, тератокарциному, остеосаркому, пігментну ксеродерму, фіброкератому, фолікулярний рак щитоподібної залози і саркому Капоші), коли такий рак рецидивував чи ставав рефрактерним. Рак, такий як рак передміхурової залози, рак яєчнику, рак легені, рак молочної залози, холангіокарцинома, чи інші типи раку, які стали рефрактерними до протиракової терапії, такої як гормони, також можна лікувати за допомогою AMG 900. В одному варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб лікування одного чи більше видів раку, вибраних з групи, яка складається з раку матки, раку молочної залози, раку легені, включаючи недрібноклітинний рак легені, раку товстої кишки, раку передміхурової залози, раку шкіри, раку нирки, раку печінки, лейкозу, включаючи промієлоцитарний лейкоз, хронічний мієлоїдний лейкоз і Т-клітинний лейкоз, множинної мієломи, раку яєчника і раку кісткового мозку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту ефективної дозованої кількості AMG 900, коли рак цього суб'єкта раніше вже лікувався і став рефрактерним до одного чи більше хіміотерапевтичних агентів, вибраних з групи, яка складається з доксорубіцину, даунорубіцину, дактиноміцину, колхіцину, вінбластину, вінкристину, паклітакселю, доцетакселю, етопозиду і мітоксантрону. В іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб лікування одного чи 22 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більше видів раку, вибраних з групи, яка складається з раку сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, нирки, печінки, легені, недрібноклітинного раку легені, голови і шиї, стравоходу, ШКТ, яєчника, підшлункової залози, шлунку, шийки матки, щитоподібної залози і передміхурової залози або лімфоми чи лейкозу. AMG 900 є також корисним для лікування солідних пухлин на пізній стадії, включаючи, але не обмежуючись ними, пухлини сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, нирки, печінки, легені, недрібноклітинного раку легені, голови і шиї, стравоходу, ШКТ, яєчника, підшлункової залози, шлунку, шийки матки, щитоподібної залози і передміхурової залози. Цей винахід пропонує також спосіб лікування солідних пухлин, сарком (зокрема, саркоми Юінга і остеосаркоми), ретинобластоми, рабдоміосаркоми, нейробластоми, гематопоетичних злоякісних станів, включаючи лейкоз і лімфому, індуковані пухлиною плевральний чи перикардіальний випоти і злоякісний асцит. Крім ефективності в лікуванні людини, запропонована тут сполука є ефективною також для ветеринарного лікування домашніх тварин, екзотичних тварин і сільськогосподарських тварин, включаючи ссавців, гризунів і т.п. Наприклад, за допомогою AMG 900 можна подібним чином лікувати рак, рефрактерний до стандартного лікування хіміотерапевтичними препаратами, у тварин, включаючи коней, собак і котів. Препарати AMG 900 може вводитись суб'єкту з раком у вигляді фармацевтичної композиції, яка містить сполуку (що є активним фармацевтичним інгредієнтом або API за цим винаходом), N-(4-((3-(2аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2-тієніл)-1-фталазинамін, в сполученні з одним чи більше нетоксичними, фармацевтично прийнятними носіями, розріджувачами та/або ад'ювантами (сукупно вони називаються тут допоміжними матеріалами). AMG 900 чи його фармацевтично прийнятна сіль можуть оброблятись звичайними у фармацевтиці методами для отримання лікарських і фармацевтичних композицій для введення пацієнтам, включаючи людину та інших ссавців. Фармацевтичну композицію можна вводити суб'єкту будь-яким доцільним шляхом, адаптованою до такого шляху введення, і в дозі, що є ефективною для наміченого лікування рефрактерного раку. Композицію чи API можна вводити, наприклад, перорально, мукозально, місцево, ректально, пульмонально, наприклад інгаляційно, або парентерально, включаючи інтраваскулярне, внутрішньовенне, інтраперитонеальне, підшкірне, внутрішньом'язове, інтрастернальне введення, а також інфузійними методами, у вигляді дозованих лікарських форм, які містять традиційні, фармацевтично прийнятні носії, ад'юванти і розчинники. Для орального введення фармацевтична композиція може бути у формі, наприклад, таблетки, капсули, суспензії чи рідини. Фармацевтичну композицію переважно готують у вигляді стандартної лікарської форми, яка містить конкретну кількість активного інгредієнту. Прикладами таких стандартних лікарських форм є таблетки чи капсули. Наприклад, вони можуть містити кількість активного інгредієнту від приблизно 1 до 2000 мг, а типово від приблизно 1 до 500 мг. Доцільна добова доза для людини чи іншого ссавця може коливатись в широких межах в залежності від стану пацієнта та інших чинників, і може визначатись звичайними методами і практикою. Кількість API (AMG 900), що вводиться, і схема введення для лікування рефрактерного раку залежать від низки чинників, включаючи вік, масу тіла, стать, а також стан здоров'я суб'єкта, вид захворювання, тяжкість раку, шлях і частоту введення, з урахуванням фізичних і хімічних властивостей AMG 900 чи його конкретної форми, включаючи конкретну форму солі. Таким чином, схема введення може бути різною. Відповідною може бути добова доза від 0,01 до 500 мг/кг, переважно від 0,01 до 50 мг/кг, краще від приблизно 0,1 до 30 мг/кг, а ще краще від приблизно 0,1 до 25 мг/кг маси тіла. В одному варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту AMG 900 чи його фармацевтично прийнятної солі в ефективній кількості в межах від приблизно 0,5 мг/кг до приблизно 25 мг/кг, коли рак у суб'єкта є рефрактерним до лікування антимітотичним агентом. В іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту AMG 900 чи його фармацевтично прийнятної солі в ефективній кількості в межах від приблизно 1,0 мг/кг до приблизно 20 мг/кг, коли рак у суб'єкта є рефрактерним до лікування стандартним хіміотерапевтичним агентом, включаючи антимітотичний агент. В ще іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб лікування раку у суб'єкта, який включає введення цьому суб'єкту AMG 900 чи його фармацевтично прийнятної солі в ефективній кількості в межах від приблизно 3,0 мг/кг до приблизно 15 мг/кг, коли рак у суб'єкта є рефрактерним до лікування антимітотичним агентом. Добова доза може вводитись за 1-4 рази. 23 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для терапевтичних цілей AMG 900 може комбінуватись з одним чи більше ад'ювантами чи "допоміжними речовинами", які відповідають показаному шляху введення. При введенні на основі разової дози AMG 900 може змішуватись з лактозою, сахарозою, крохмальним порошком, складними ефірами целюлози і алканових кислот, алкілефірами целюлози, тальком, стеариновою кислотою, стеаратом магнію, оксидом магнію, солями натрію і кальцію з фосфорною і сірчаною кислотами, желатином, аравійською камеддю, альгінатом натрію, полівінілпіролідоном та/або полівініловим спиртом для отримання кінцевого складу. Наприклад, AMG 900 і допоміжні речовини можуть бути таблетованими чи інкапсульованими відомими і акцептованими методами для зручного введення. Приклади придатних препаратів включають, не обмежуючись ними, пігулки, таблетки, м'які і тверді желатинові капсули, пластинки, оральнорозчинні форми і препарати з уповільненим чи контрольованим вивільненням. Зокрема, препарати у формі таблеток чи капсул можуть містити один чи більше агентів з контрольованим вивільненням, таких як гідроксипропилметилцелюлоза, у вигляді дисперсії з API. У випадку псоріазу та інших шкірних захворювань перевага може віддаватись нанесенню місцевого препарату AMG 900 на уражену ділянку від двох до чотирьох разів на добу. Препарати, придатні для місцевого введення, включають рідкі чи напіврідкі засоби, які можуть проникати через шкіру (наприклад, рідкі мазі, лосьйони, мазі, креми, пасти, суспензії і т.п.), а також краплі для введення в очі, вуха чи ніс. Придатні дози активного інгредієнту для місцевого введення становлять від 0,1 мг до 150 мг і вводяться від одного до чотирьох, переважно один чи два, разів на добу. Для місцевого введення API може складати від 0,001 до 10 ваг. %, наприклад від 1 до 2 ваг. % від всього складу, хоча може складати і цілих 10 ваг. %, але переважно не більше ніж 5 ваг. %, а ще краще від 0,1 до 1 % від ваги всього складу. В складі мазі AMG 900 може використовуватись з парафіновою або зі змішуваною з водою мазевою основою. Як варіант, AMG 900 може вводитись в крем з кремовою основою олія-у-воді. Коли це бажано, водна фаза кремової основи може включати, наприклад, щонайменше 30 % в/в багатоатомного спирту, такого як пропілен гліколь, бутан-1,3-діол, маніт, сорбіт, гліцерин, поліетилен гліколь та їх суміші. Препарати для місцевого застосування при бажанні можуть включати сполуку, яка посилює абсорбцію чи проникання активного інгредієнту через шкіру чи інші вражені ділянки. Приклади таких посилювачів проникнення через шкіру включають ДМСО і споріднені аналоги. AMG 900 може вводитись також з використанням трансдермального засобу. Переважно, місцеве введення буде здійснюватись з використанням пластиру типу резервуару і пористої мембрани або типу твердої матриці. В обох випадках AMG 900 безперервно вивільнюється з резервуару чи мікрокапсули через мембрану в проникний для активного агента адгезив, який знаходиться в контакті зі шкірою чи слизовою оболонкою реципієнта. Коли AMG 900 абсорбується через шкіру, реципієнту вводиться контрольована і попередньо визначена кількість AMG 900. У випадку мікрокапсул використаний для інкапсулювання матеріал може функціонувати також як мембрана. Олійна фаза емульсій може бути складеною з відомих інгредієнтів відомим способом. Хоча ця фаза може являти собою просто емульгатор, вона може бути також сумішшю щонайменше одного емульгатора з жиром чи олією або і з жиром, і з олією. Переважно гідрофільний емульгатор вводиться разом з ліпофільним емульгатором, який діє як стабілізатор. Також, краще включати і олію, і жир. Сукупно, емульгатор(и) зі стабілізатором(ами) чи без них, утворюють так званий емульгуючий віск, а цей віск разом з олією і жиром складає так звану емульгуючу мазеву основу, яка утворює олійну дисперговану фазу кремових препаратів. Емульгатори і стабілізатори емульсій, придатні для застосування в такому препараті, включають, наприклад, Твін 60, Спан 80, цетостеариловий спирт, мірістиловий спирт, гліцерилмоностеарат, лаурил сульфат натрію, гліцерил дистеарат, окремо чи з воском, або інші матеріали, добре відомі в цій галузі. Вибір придатних олій чи жирів для такого препарату базується на досягненні бажаних косметичних властивостей, оскільки розчинність API в більшості олій, які можуть бути використані в фармацевтичних емульсійних препаратах, є дуже низькою. Таким чином, крем переважно має бути продуктом, який не є сальним, не забарвлює і змивається, з такою консистенцією, щоб уникнути витікання з тубів чи інших контейнерів. Можуть бути використані лінійні чи розгалужені, одно- чи двохосновні алкіл ефіри, такі як диізодипат, ізоцетилстеарат, пропілен гліколь диефір кокосових жирних кислот, ізопропилмірістат, децилолеат, ізопропилпальмітат, бутилстеарат, 2-етилгексил-пальмітат, або суміш складних ефірів з розгалуженим ланцюгом. Вони можуть використовуватись окремо чи в комбінації, в залежності від потрібних властивостей. Як варіант, можуть бути використані ліпіди з високою температурою плавлення, такі як білий м'який парафін та/або рідкий парафін чи інші мінеральні олії. 24 UA 107675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Препарати, придатні для місцевого введення в око, включають очні краплі, в яких активні інгредієнти є розчиненими чи суспендованими у відповідному носієві, зокрема у водному розчиннику для AMG 900. AMG 900 переважно є присутнім в таких препаратах в концентрації від 0,5 до 20 %, краще від 0,5 до 10 %, і зокрема в концентрації біля 1,5 % в/в. Препарати для парентерального введення можуть бути у формі водних чи неводних ізотонічних стерильних ін'єкційних розчинів чи суспензій. Такі розчини і суспензії можуть готуватись зі стерильних порошків чи гранул з використанням одного чи більше носіїв чи розріджувачів, згадуваних для застосування в препаратах для орального введення, або з використанням інших придатних диспергаторів, агентів для змочування чи агентів для суспендування. Наприклад, AMG 900 може бути розчиненим у воді, поліетилен гліколі, пропілен гліколі, етиловому спирті, кукурудзяній олії, бавовниковій олії, арахісовій олії, кунжутній олії, бензиловому спирті, хлориді натрію, трагакантовій камеді та/або різних буферних розчинах. Інші ад'юванти і способи введення є добре і широко відомими в фармацевтичній галузі. AMG 900 можна вводити також як ін'єкцію у вигляді композиції з відповідними носіями, включаючи фізіологічний розчин, декстрозу чи воду, або з циклодекстрином (наприклад, Каптисолом), агентом для солюбілізації спільного розчинника (наприклад, пропілен гліколь) чи для солюбілізації міцел (наприклад, Твін 80). Стерильний ін'єкційний препарат може бути також стерильним ін'єкційним розчином чи суспензією в нетоксичному, прийнятному для парентерального введення розріджувачі чи розчиннику, наприклад як розчин в 1,3-бутандіолі. Серед прийнятних носіїв і розчинників, які можуть бути використані, можна згадати воду, розчин Рингера і ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, в якості розчинника чи середовища для суспендування традиційно застосовуються стерильні нелетучі жирні олії. З цією метою може бути використана будь-яка заспокійлива нелетуча олія, включаючи синтетичні моно- чи дигліцериди. Крім того, при приготуванні ін'єкційних препаратів знаходять застосування такі жирні кислоти, як олеїнова кислота. Як інгаляційний препарат фармацевтична композиція може вводитись у формі аерозолю чи за допомогою інгалятору, включаючи сухий порошковий аерозоль. Супозиторії для ректального введення лікарського засобу можуть готуватись шляхом змішування діючої речовини з відповідною не подразнюючою допоміжною речовиною, такою як кокосова олія і поліетилен гліколі, яка є твердою при звичайній температурі, але стає рідкою при ректальній температурі і, відповідно, буде плавитись в прямій кишці з вивільненням діючої речовини. Фармацевтичні композиції можуть піддаватись звичайним фармацевтичним процедурам, таким як стерилізація, та/або можуть містити звичайні ад'юванти, такі як консерванти, стабілізатори, агенти для змочування, емульгатори, буфери і т.п. Таблетки і пігулки можуть додатково виготовлятись з ентеросолюбільним покриттям. Такі композиції також можуть містити ад'юванти, такі як агенти для змочування, підсолоджувачі, смакові добавки і ароматизатори. Комбінації Хоча AMG 900 може даватись в певних дозах чи вводитись як єдиний активний фармацевтичний агент, його можна застосовувати також в комбінації з одним чи більше хіміотерапевтичними та/або антимітотичними агентами. При введенні у вигляді комбінації, AMG 900 може готуватись як окремі композиції, що вводяться одночасно чи послідовно в різні моменти часу, або AMG 900 може даватись як єдина композиція. Вираз "ко-терапія" (чи "комбінаційна терапія"), визначаючи застосування AMG 900 за цим винаходом і іншого хіміотерапевтичного агента, охоплює введення кожного агента послідовно за схемою, яка буде забезпечувати сприятливі ефекти від цієї комбінації агентів, і, крім того, охоплює спільне введення цих агентів суттєво одночасним чином, наприклад у вигляді єдиної капсули, яка містить фіксоване співвідношення цих активних агентів, або у вигляді кількох окремих капсул для кожного агента. Зокрема, введення AMG 900 може здійснюватись в поєднанні з додатковим хіміотерапевтичним агентом, включаючи антимітотичні агенти, відомі спеціалістам в цій галузі для попередження чи лікування раку. Даний винахід не передбачає обмежень у відношенні послідовності введення, тобто AMG 900 може вводитись до, одночасно чи після введення відомого протиракового чи антимітотичного агента. Вищенаведений опис є тільки ілюстрацією даного винаходу і не задумувався з наміром обмежити його описаними застосуваннями. Варіації і зміни, які є рутинними для спеціаліста в цій галузі, вважаються такими, що є в рамках об'єму і природи цього винаходу, як вони визначені у формулі винаходу, що додається. Всі наведені в описі посилання, патенти, заявки і публікації вважаються включеними до даного винаходу за посиланням в їх повному об'ємі. 25 UA 107675 C2 26 UA 107675 C2 27 UA 107675 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 1. Застосування сполуки N-(4-((3-(2-аміно-4-піримідиніл)-2-піридиніл)окси)феніл)-4-(4-метил-2тієніл)-1-фталазинаміну або її фармацевтично прийнятної солі для лікування раку у суб'єкта, коли рак у цього суб'єкта є рефрактерним до лікування протираковим агентом. 2. Застосування сполуки за п. 1, де протираковим агентом є хіміотерапевтичний агент. 3. Застосування сполуки за п. 2, де хіміотерапевтичним агентом є агент, вибраний з групи, яка складається з антимітотичного агента і антрацикліну. 4. Застосування сполуки за п. 2, де хіміотерапевтичним агентом є агент, вибраний з групи, яка складається з таксолу, доцетакселю, вінкристину, вінбластину, віндезину, а також вінорелбіну, даунорубіцину, доксорубіцину, ідарубіцину, епірубіцину і мітоксантрону. 5. Застосування сполуки за п. 1, де протираковим агентом є AZD1152, РНА-739358, МК-0457 або їх комбінація. 6. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, де рак являє собою одну або більше з (а) солідних або гематологічних пухлин, вибраних з раку сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, нирки, печінки, легені, дрібноклітинного раку легені, стравоходу, жовчного міхура, яєчника, підшлункової залози, шлунка, матки, щитоподібної залози, передміхурової залози і шкіри, (b) гематопоетичних пухлин лімфоїдної лінії, вибраних з лейкозу, гострого лімфоїдного лейкозу, гострого лімфобластного лейкозу, В-клітинної лімфоми, Т-клітинної лімфоми, лімфоми Ходжкіна, неходжкінської лімфоми, волосатоклітинної лімфоми і лімфоми Буркетта, (с) гематопоетичних пухлин мієлоїдної лінії, вибраних з гострого і хронічного мієлогенного лейкозу, мієлодиспластичного синдрому і промієлоцитарного лейкозу, (d) пухлин мезенхімального походження, вибраних з фібросаркоми і рабдоміосаркоми, (e) пухлин центральної і периферичної нервової системи, вибраних з астроцитоми, нейробластоми, гліоми і шваноми, або (f) меланоми, семіноми, тератокарциноми, остеосаркоми, пігментної ксеродерми, кератоакантоми, фолікулярного раку щитоподібної залози або саркоми Капоші. 7. Застосування за будь-яким з пп. 1-5, де рак є одним або більше з солідної пухлини, вибраної з раку сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, нирки, печінки, легені, недрібноклітинного раку легені, голови і шиї, стравоходу, ШКТ, яєчника, підшлункової залози, 28