Фармацевтично прийнятні солі метил-(3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9н-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно]-метил)-феніл)-ацетату та їх застосування в терапії

Реферат: Заявлений винахід стосується солей метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9Нпурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно]-метил)-феніл)-ацетату, фармацевтичних композицій, що їх містять, та їх застосування в терапії. UA 100996 C2 (12) UA 100996 C2 UA 100996 C2 5 10 15 20 25 30 Цей винахід стосується солей 8-похідного оксоаденіну, фармацевтичних композицій, які їх містять, та їх застосування в терапії. Метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4ілпропіл)-аміно-метил])-феніл)-ацетат конкретно розкрито в прикладах 2-37 Міжнародної патентної заявки № WO 2005/092893 як імуномодулюючий компонент, що діє через Толлподібний рецептор 7 (TLR7). При розробці лікарських засобів важливо, щоб лікарська речовина (активний компонент), була у стані, в якому її можна буде зручно транспортувати і і обробляти. Це має важливе значення не тільки з точки зору отримання комерційно життєздатного процесу виробництва ліків, але і з точки зору подальшого виробництва фармацевтичних препаратів, які містять активний компонент та відповідні наповнювачі. У цьому зв'язку, хімічна та фізична стабільність активної речовини є важливими чинниками. Активні сполуки, а також суміші, що їх містять, повинні бути здатні ефективно зберігатися достатньо відчутні періоди часу, не виявляючи будьякі істотних змін у фізико-хімічних характеристиках (наприклад, хімічному складі, щільності, гігроскопічності та розчинності) активного компоненту. Крім того, якщо активна сполука може бути включена в композицію для застосування у легені, наприклад, через такий порошковий інгалятор, як пристрої Turbuhaler ®, бажано, щоби вона вже була готова до мікронізації у порошок з властивостями, необхідними для розпилювання в складі частинок високо подрібленої фракції (тобто фракції, в якій частинки активного компоненту мають середньо-масовий діаметр (MMD) 10 мкм (мікрон), або менш цього). Така фракція здатна проникати глибоко в легені, ведучи до прискорення та збільшення поглинання активної речовини. Фахівці, які обізнані у даній галузі цінують те, що, як правило, якщо лікарська речовина може бути легко отримана в такій стабільній формі, як стабільна кристалічна, то переваги можуть бути надані, з точки зору зручності у транспортуванні, використанні, легкості отримання і подовженому строку зберігання відповідних фармацевтичних препаратів, а також їх надійним ступенем розчинності. Зараз несподівано виявилося можливим одержати деякі солі (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно]-метил]-феніл))-ацетату з покращеними фізико-хімічними властивостями в порівнянні з вільною основною сполукою, які можуть бути зроблені у якості сухої суміші порошку для застосування у легені. Структура метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3морфолін-4-ілпропіл)-аміно]-метил)-феніл)-ацетату показана нижче: NH2 N O O H N O N N N N O O 35 40 . Таким чином, згідно з цим винаходом, запропоновано створення хлориду, бромідної кислоти або малеїнової кислоти метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату (іменованої надалі як "гідрохлорид, гідробромід або малеат"). В іншому аспекті винахід стосується створення хлориду, бромідної кислоти або малеїнової кислоти метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату, що дають характерні для рентгенівської порошкової дифракції максимуми (в градусах 2θ), які вказані в таблицях A, B або C відповідно (див. далі Приклад 4). Винахід також стосується створення сольватів (у тому числі гідратів) гідрохлориду, 1 UA 100996 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідроброміду або малеату. Тим не менш, гідрохлорид, гідробромід або малеат бажано отримувати безводними, і бажано, не у сольватованій формі. При втіленні цього винаходу, гідрохлорид, гідробромід, малеат або сольват повинні мати кристалічні властивості і бажано мати не менше 50%, кристалічності більш переважно 60% кристалічності, ще більш переважно 70% кристалічності найвпевненіше щонайменше 80% кристалічності. Ступінь кристалічності можна оцінити способами звичайної рентгенівської дифрактометрії. В іншому варіанті втілення винаходу, кристалічна частка гідрохлориду, гідроброміду, малеату або сольвату становить від 50%, 60%, 70%, 80%, або 90% до 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або 100 % . Опис одержання метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3морфолін-4-ілпропіл)-аміно]-метил)-феніл)-ацетату описано в міжнародній патентній заявці № WO 2005/092893. Гідрохлорид, гідробромід і малеат (у тому числі сольват) можна отримувати відомими способами. Тим не менш, що є очевидним для фахівців в даній галузі, існують і інші можливості одержання цих сполук та їх солей. Отримані солі (у тому числі сольватні форми) також є корисними як модулятори активності TLR7 і тим самим можуть бути застосовані у ссавців, включаючи людину, для лікування наступних станів і хвороб: 1. Хвороби дихальних шляхів: обструктивні захворювання дихальних шляхів, у тому числі: астма, у тому числі бронхіальна, алергічна, внутрішнього або, зовнішнього характеру, індукована фізичними навантаженнями, вживанням ліків (включаючи аспірин та нестероїдні протизапальні засоби), пилом( як переривчаста, так і постійна з усіма ускладненнями), гиперчутливість дихальних шляхів, яка має інше походження, хронічна обструктивна хвороба легень(COPD), бронхіт, в тому числі інфекційного і еозинофільного походження; емфізема легенів; бронхів; муковісцидоз; саркоїдоз; алергічний альвеоліт і пов'язані з ними захворювання; пневмоніт з гіперчутливістю; фіброз легень, у тому числі кріптогенний фіброзувальний альвеоліт, інтерстиціальна пневмонія, фіброз ускладнений анті-неопластичною терапією та хронічною інфекцією, у тому числі туберкульозом та аспергильозом та іншими грибковими інфекціями, ускладнення після трансплантації легенів; васкулітичні і тромботичні порушення легеневих судин, легенева гіпертензія, протикашльова активность, включаючи лікування хронічного кашлю пов'язаного із запальними та секреторними процесами дихальних шляхів, ятрогенний кашель, гострі та хронічні риніти, включаючи медикаментозний і вазомоторний риніт; багаторічні і сезонно-алергічні риніти, включаючи анорексичний (сінна лихоманка); носові поліпи, гострі вірусні інфекції, включаючи простудні захворювання, та інфекції, викликані респіраторно-синцитіальним вірусом, вірусом грипу, коронавірусом (включаючи ТОРС) і аденовірусами; 2. Хвороби шкіри: псоріаз, атопічний дерматит, контактний дерматит або інші екземічні дерматози та реакції гіперчутливості уповільненого типу; фіто-і фотодерматит; себорейний дерматит, дерматит герпетиформний, червоний плоский лишай, склеротичні та атрофічні лишаї, піодермія гангренозна, саркоїд шкіри, дискоїдний червоний вовчак, пухирчатка, пемфігоід, епідермолізіс бульозній, кропив'янка, ангіоневротичний набряк, васкулітід, токсична еритема, шкірний еозинофілія, вогнищева алопеція, облисіння за чоловічим типом, синдром Світа, синдром Вебер-Крисчена, мультиформна еритема; целюліт, як інфекційного та неінфекційного типу; паннікуліт; шкірні лімфоми, немеланомний рак шкіри та інших диспластичні ураження; розлади, індуковані ліками, включаючи фіксовані виверження ліків; 3. Хвороби очей: блефарит; кон'юнктивіт, в тому числі багаторічний і весняний алергічний кон'юнктивіт; ірит; передній і задній увеїт; хоріоїдит; аутоімунні, дегенеративні і запальні захворювання сітківки, офтальміт, включаючи симпатетичний; саркоїдоз; інфекції, у тому числі вірусні, грибкові і бактеріальні; 4. Сечостатеві хвороби: нефрит у тому числі інтерстиціальний і гломерулонефрит; нефротичний синдром, цистит, включаючи гострі і хронічні (проміжні) цистити і виразку Ханнера, гострий і хронічний уретрит, простатит, епідидиміт, оофорит і сальпінгіт; вульвовагініт; хвороба Пейроне; еректильні дисфункції (як чоловіків, так і жінок); 5. Відторгнення трансплантата: гострі і хронічні наслідки, наприклад, трансплантації нирок, серця, печінки, легенів, кісткового мозку, шкіри і рогівки або після переливання крові або хронічна хвороба трансплантат проти хазяїна; 6. Інші аутоімунні та алергічні захворювання, включаючи ревматоїдний артрит, синдром подразненого кишечника, системний червоний вовчак, розсіяний склероз, тиреоїдит Хасімото, базедову хворобу, хворобу Аддісона, цукровий діабет, гіпертонічну пурпурну тромбоцитопенію, еозинофільний фасциїт, гіпер-IgE синдром, антифосфоліпідний синдром і синдром Сазарі; 2 UA 100996 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 7. онкологія: лікування поширених видів раку в тому числі простати, молочної залози, легенів, яєчників, підшлункової залози, кишечнику і прямої кишки, шлунку, шкіри і пухлин головного мозку і злоякісних пухлини, що зачіпають кістковий мозок (у тому числі лейкози) та лімфопроліферативних систем, як-то Ходжкіна і негоджкінська лімфома; у тому числі профілактика і лікування метастазів і рецидивів пухлин, а також паранеопластичних синдромів, а також 8. інфекційні захворювання: такі вірусні захворювання, як генітальні бородавки, загальні бородавки, підошовні бородавки, гепатит B, гепатит С, вірус простого герпесу, контагіозний молюск, натуральної віспи, вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), вірус папіломи людини (ВПЛ), цитомегаловірус (ЦМВ), вірус вітряної віспи (VZV), риновіруси, аденовірус, коронавірус, грип, пара-грип, такі бактеріальні захворювання, як туберкульоз і мікобактерій avium, проказа, інші інфекційні захворювання, як-то грибкові захворювання, хламідіоз, кандидоз, Aspergillus, криптококовий менінгіт, пневмонія carnii, криптоспоридіоз, гістоплазмоз, токсоплазмоз, трипаносомна інфекція і лейшманіоз. Таким чином, даний винахід забезпечує використання солей хлоридної, бромідної кислот або малеїнової кислоти метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату або сольвату в терапевтичних цілях. У подальшому аспекті, цей винахід стосується використання солей хлоридної, бромідної кислот або малеїнової кислоти метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9 іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату або сольвату при виробництві ліків для використання в терапевтичних цілях. У контексті цієї специфікації, термін "терапія" також включає в себе поняття "профілактика", якщо не існують конкретні вказівки про протилежне. Терміни "терапевтичних" і "терапевтично" треба тлумачити відповідним чином. Профілактика, як очікується, буде особливо актуальна для лікування осіб, які вже хворіли вказаними захворюваннями, якщо, як вважають, вони піддаються підвищеному ризику, або наявність хвороби є станом питання. Особи, які мають ризик розвитку конкретної хвороби або відповідного стану звичайно мають сімейну історію хвороби чи стану, або ризик визначається шляхом генетичного тестування, або робиться скринінг осіб, особливо сприйнятливих до розвитку хвороби або стану. Зокрема, солі (у тому числі сольватні форми) відповідно до винаходу можуть бути використані при лікуванні астми, COPD, алергічного риніту, алергічного кон'юнктивіту, атопічний дерматиту, раку, гепатиту В, гепатиту С, ВІЛ, HPV, бактеріальних інфекцій та дерматозів. Тому винахід забезпечує спосіб лікування запальних захворювань у пацієнтів, що хворіють, або перебувають під загрозою захворіти на вказані хвороби, які вимагають введення пацієнту терапевтично ефективну кількість солей хлоридної, бромідної, або малеїнової кислот метил (3([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-амінометил]-феніл))-ацетату або їх сольватів. Винахід також стосується способу лікування захворювань дихальних шляхів, наприклад, оборотно-обструктивних хвороб дихальних шляхів, як-то астма, у хворих, або людей схильних до ризику захворіти вказаними захворюваннями, що включає в себе введення пацієнту терапевтично ефективної кількості солей хлоридної, бромідної, або малеїнової кислот метил (3([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-амінометил]-феніл))-ацетату або їх сольватів. Винахід забезпечує спосіб лікування або зниження ризику захворювання або стану, що включає або виникає у зв'язку з ненормальним зростанням клітин (наприклад, раку), для пацієнтів, які потребують введення терапевтично ефективної кількості солей хлоридної, бромідної, або малеїнової кислот метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату або сольвату солі. Для вищезгаданого терапевтичного лікування, дозування, що призначають, звичайно, залежать від солі, яку застосовують, способу застосування, бажаного типу лікування та діагностованого типу хвороби. Наприклад, добова доза (сольватованого) гідрохлориду, гідроброміду, або малеату при вдиханні, може бути в діапазоні від 0,05 мікрограмів на кілограм маси тіла (мкг/кг) до 100 мікрограмів на кілограм маси тіла (мкг/кг) . Крім того, якщо вводити (сольватований) гідрохлорид, гідробромід або малеат перорально, то добова доза може бути в діапазоні від 0, 01 мікрограмів на кілограм ваги тіла (мкг/кг) до 100 міліграмів на кілограм маси тіла (мг/кг) . Гідрохлорид, гідробромід або малеат або сольват згідно з винаходом можуть бути використані самостійно, але як правило, повинні використовуватися у вигляді фармацевтичної 3 UA 100996 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 композиції, в яких гідрохлорид, гідробромід або малеат чи сольват є активним інгредієнтом спільно з фармацевтично прийнятним допоміжним компонентом, розчинником або носієм. Звичайні процедури для відбору та підготовки відповідних фармацевтичних препаратів описані, наприклад, у "Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs", M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988. Залежно від способу введення, фармацевтична композиція може включати від 0,05 до 99 мас% (у відсотках від маси паціента), більш переважно від 0,05 до 80 мас%, ще більш переважно від 0,10 до 70 мас%, і навіть більш переважно 0,10-50 мас%, активного інгредієнту, усі відсотки за вагою грунтуються на загальній композиції. Цей винахід також стосується фармацевтичної композиції, яка містить солі хлоридної, бромідної, або малеїнової кислот метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9 іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату або сольвату в поєднанні з фармацевтично прийнятним ад'ювантом, розчинником або носієм. Винахід також стосується способу отримання фармацевтичної композиції, яка включає суміш солей хлоридної, бромідної, або малеїнової кислот метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату або сольвату з фармацевтично прийнятними ад’ювантами, розчинниками або носіями. Фармацевтичні композиції можуть бути введені звичайним шляхом (наприклад, через шкіру або легені і/або дихальні шляхі) у вигляді, наприклад, кремів, розчинів, суспензій, гептафлюороалканових (HFA), аерозолів та сухих порошків, наприклад, для застосування інгаляторних пристроїв, такіх як Turbuhaler®, або системно, наприклад, шляхом прийому всередину у вигляді пігулок, капсул, сиропів, порошків або гранул; або парентерального введення у вигляді розчинів або суспензій; або підшкірно; або ректальне введення у вигляді супозиторіїв, або трансдермально. При втіленні винаходу, фармацевтичну композицію вводять інгаляцією (перорально або назально). У подальшому втіленні, фармацевтичну композицію можна вводити, застосовуючи порошковий інгалятор (DPI). Застосування DPI може бути "пасивним", або активованим диханням, або "активним", де порошок диспергують якимось механізмом, крім інгаляції пацієнта, наприклад, внутрішнім джерелом стисненого повітря. В даний час є три типа пасивних інгаляторів на сухому порошку: з одноразовою дозою, з кількома одиницями дози або багатодозові (резервуарні) інгалятори. У пристроях з одноразовою дозою, індивідуальні дози надають, як правило, в желатинових капсулах, і повинні бути завантажені в інгалятор перед використанням, прикладами яких є інгалятори Spinhaler ("Авентіс"), Rotahaler (GlaxoSmithKline), AeroliserTM (Novartis), Inhalator (Boehringer) і Eclipse ("Авентіс"). Інгалятори з кількома одиницями дози містять декілька індивідуально упакованих доз, як і в чисельних желатинових капсулах, так і в блістерах, прикладами яких є пристрої Diskhaler (GlaxoSmithKline), Diskus (GlaxoSmithKline) і Aerohaler (Boehringer). У багатодозових пристроях ліки зберігаються в об'ємних порошкових резервуарах, з яких відмірюються окремі дози. Прикладами таких пристроїв є Turbuhaler (AstraZeneca), Easyhaler (Orion), Novolizer (АСТА Медіка), Clickhaler (Innovata Biomed) і Pulvinal (Chiesi) . Фармацевтичні композиції для вдихання чи суха суміш порошку для використання в DPI можуть бути отримані шляхом змішування дрібнодисперсного активного інгредієнта (середньомасовий діаметр зазвичай дорівнює або менше 10 мкм, переважно рівна або менше 5 мкм) з носієм, наприклад, з моно-, ди-і полісахаридами, цукровим алкоголем або іншим поліолем. Носії, що підходять, є цукри, наприклад, лактоза, глюкоза, рафіноза, мелезитоза, лактитол, мальтитол, трегалоза, сахароза, маннітол і крохмаль. Порошкові суміші можуть потім, при необхідності, бути у вигляді твердих желатинових капсул, кожна з яких містить бажану дозу активного інгредієнта. Крім того, фармацевтична композиція для вдихання може бути отримана шляхом переробки мілкодісперсного порошку (наприклад, що складається з дрібнодисперсних активного інгредієнта і дрібнодисперсних часток носія) у кульки, які розпадаються протягом процедури інгаляції. Цей сферизований порошок заповнюється в резервуар для ліків багатодозових інгаляторів, наприклад, як-то Turbuhaler®, в якому дозована одиниця дорівнює дозі, яку потім інгалюють пацієнту. Таким чином, даний винахід також забезпечує сухі порошкові інгалятори, зокрема, сухі порошкові інгалятори з чисельними дозами, що містять фармацевтичну композицію даного винаходу, яка вдихається. Гідрохлорид, гідробромід, малеат або сольват згідно винаходу можна також вживати разом з іншими сполуками, що використовують для лікування зазначених вище станів. 4 UA 100996 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Тому в подальшому цей винахід стосується комбінованої терапії, у якої гідрохлорид, гідробромід або малеат чи сольват згідно винаходу використовується, у складі фармацевтичної композиції, яка містить гідрохлорид, гідробромід або малеат чи сольват, що вводиться одночасно або послідовно, або в якості комбінованого препарату з іншим терапевтичним агентом або агентами для застосування в одному більше з перерахованих станів. Фіг. 1 показує рентгенодифрактограму порошку моногідрохлоріду метил (3-([[3-(6-аміно-2бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл)ацетату. Фіг. 2 показує рентгенодифрактограму порошку моногідроброміду метил (3-([[3-(6-аміно-2бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл)ацетату. Фіг. 3 показує рентгенодифрактограму порошку дималеату метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл)-ацетату. Даний винахід далі буде пояснено з посиланням на наступні приклади. Загальні способи 1H ЯМР спектри були записані на 298К Varian Unity Inova 400 МГц (програмне забезпечення: VNMR 6.1C і 1.1D VNMRJ; зонд: Nalorac 5 мм DG400-5AT) або Varian Меркурій-VX 300 МГц (програмне забезпечення: VNMR 6.1C; зонд: Varian 5mm AutoSW PFG). Центральні піки ацетону-D6 або диметилсульфоксиду (ДМСО)-D6 були використані як внутрішній стандарт. Для РХ / MС аналізу був використаний наступний спосіб: MС апаратура: Agilent 1100 серії, оснащений інтерфейсом APCI РХ апаратура: Agilent 1100 серії, оснащений УФ-детектором VWD, автоматичний пробовідбірник ALS, бінарний насос і вакууматор РХ-колонка: Chromolith Швидкість ROD, RP-C18, ø 4, 6 х 50 мм Елюент: Розчинник: вода 0, 1% трифторуксусної кислоти (TFA); Розчинник B: ацетонітріл 0, 1% TFA Умови: РХ: потік 2,5 мл / хв; 5 до 95%B у градієнту; час виконання 3, 6 хвилин; УФ-220 нм Приклад 1 Отримання хлориду метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)пропіл]-(3-морфолін-4 -ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату (1:1 солі) (А) Метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4ілпропіл)-аміно]-метил)-феніл)-ацетату (40 мг, 0.07 ммоль) розчинили в етилацетаті (5 мл) і додавали 3.28M HCl / спиртовий розчин (21 мкл, 0.07 ммоль). Вилучення розчинника було зроблено за рахунок випаровування і залишок сушили у вакуумі, щоб отримати метил (3-([[3-(6аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]феніл))-ацетату моногідрохлорід в якості кінцевого продукту. (Б) 80 мМ розчин хлоридної кислоти в метанолі (65, 0 мл,5, 2 ммоль) додавали у розчин метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату (3, 0 мг, 5,3 ммоль), розчиненого у метанолі (1,5 мл) при кімнатній температурі. Розчин струшували при температурі 60 °С протягом 1 години, потім охолоджували до 5 °C. Через 30 хвилин, розчинник залишали повільно випаровуватися при 5 °C, для одержання метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3морфоліну-4-ілпропілу)-аміно-метил]-феніл))-ацетату моногідрохлоріду в якості кінцевого продукту. Подальші кількості моногідрохлорідної солі були виготовлені наступними способами: (С) стехіометричну кількість хлоридної кислоти в метанолі (2, 4 мас-співвідношення, WR) додавали до суспензії метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл](3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату в метанолі (4, 0 WR) на 5 °C. Після перемішування протягом 10 хвилин, біла суспензія була розчинена з отриманням прозорого розчину. Трет-бутил метиловий естер (5, 1 WR) краплями додавали в розчин і після добавляли до нього засівальний кристал моногідрохлоріду (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро -9Hпурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату, приготованого, як описано в пункті (а) вище, сформувався білий осад. Після перемішування протягом 5 хвилин додавали трет-бутил метиловий естер (11, 2 WR), і суспензію перемішували протягом 1 години при 5 °C. Осад відфільтровано і промито трет-бутил метиловим естером (3, 7 WR), щоб отримати моногідрохлорід метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату твердому стані (вихід 90%). 5 UA 100996 C2 Елементний аналіз Елемент Знайдений рівень (мас%) Теоретичний рівень (мас%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 C 57.18 57.46 H 7.26 7.32 N 16.22 16.18 Cl 5.88 5.85 Стехіометрия, основна речовина до кислоти 1:1 була підтверджена способом ЯМР. Приклад 2 Отримання бромідної кислоти метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4 -ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату (сіль 1:1) (А) 1.55M розчин гідроброміду в етанолі (34 мл,53 ммоль) додавали у розчин метил (3-([[3(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-амінометил]-феніл))-ацетату (30 мг, 0,053 ммоль) у метанолі (0, 3 мл). Розчин додавали до третбутил метилового естеру (0.9ml) при кімнатній температурі. Прозорий розчин був залишений при -10 °C протягом тижня, після чого з’явився осад у вигляді кристалічної речовини. Цю речовину, моногідробромід метил-(3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату, фільтрували і сушили. Подальші кількості моногідробромідної солі були приготовані наступним способом: (Б) Стехіометричну кількість розчину бромідної кислоти (aq., 48%) у метанолі (0, 8 WR) додавали до суспензії метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8 -оксо-7,8-дигідро-9H-пурину-9-іл)пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату в метанолі (11, 9 WR) при кімнатній температурі. Після перемішування протягом 10 хвилин, біла суспензія розчинилася, даючи прозорий розчин. Далі до розчину додавались кристалічні гранули моногідроброміду метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату, приготованого, як описано в пункті (а) вище. Трет-бутил метиловий естер (11, 3 WR) потім додавали краплями до отримання білого осаду. Суспензію охолоджували до 3 ° С та перемішували протягом 1 години. Осад було відфільтровано і промито трет-бутил метиловим естером (3, 7 WR), щоб отримати моногідробромід метил (3-([[3(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-амінометил]-феніл))-ацетату у твердому стані (вихід 87.7-89.4%). Стехіометрія, луг до кислоти, 1:1, була підтверджена способом ЯМР. Приклад 3 Отримання солі малеїнової кислоти метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9Hпурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4 -ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату (1:2) (А) 27 мМ розчин малеїновий кислоти в 1, 4-діоксані (0,5 мл, 13,5 мкмоль) додавали у розчин метил(3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетату (4 мг, 7 мкмоль) в 1, 4-діоксані (0, 75 мл) при кімнатній температурі і суміш залишали стояти на ніч. На наступний день, розчин було нагрівали до 40 °С і струшували протягом 1 години, а потім охолоджували до кімнатної температури. Розчинник було випарено при кімнатній температурі, щоб отримати дималеат метил (3-([[3-(6-аміно-2бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))ацетату в якості кінцевого продукту. Подальші кількості дималеату були приготовані наступним способом: (Б) малеїнову кислоту (0,9 г, 7,8 ммоль) додавали до суміші метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл)-ацетату (2,2 г, 3,9 ммоль) у метанолі (20 мл) та ізопропіловому спирті (20 мл) та отриману суміш було нагріто до 50 °C до отримання прозорого розчину. Далі розчин охолоджували до кімнатної температури, а потім додавали кристалічний дималеат метил (3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4-ілпропіл)-аміно-метил]-феніл)-ацетату, приготований, як описано в пункті (а) вище. Через 16 годин речовину у твердому стані фільтрували і сушили при 50 °C в умовах високого вакууму протягом 72 годин. Вихід 2.96 g, 95%. 1H NMR (DMSO-d6); d 9.88 (s, 1H), 7.32-7.22 (m, 4H), 6.43 (s, 2H), 6.11 (s, 4H), 4.12 (t, 2H), 3.95 (s, 2H), 3.71 (brs, 6H), 3.68 (s, 2H), 3.60 (s, 3H), 2.94-2.75 (m, 10H), 1.99-1.94 (m, 2H), 1.901.80 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 2H), 1.41-1.32 (m, 2H), 0.90 (t, 3H). РХ-MС m/z 570 APCI+ve 6 UA 100996 C2 Елементарний аналіз Елемент C 55.8 55.4 Знайдена кількість (мас%) Теоретична кількість (мас%) 5 10 15 20 25 30 H 6.2 6.4 N 12.1 12.2 Стехіометрія, основна речовина до кислоти, 1:2, була підтверджена способом ЯМР. Приклад 4 Рентгенівський аналіз порошкової дифракції. Загальні процедури. Аналіз рентгенівської дифракції порошку (XRPD) може проводитися на зразках, виготовлених у відповідності зі стандартними способами (див., наприклад, iacovazzo et al., eds., Fundamentals of Crystallography, Oxford University Press (1992); Jenkins & Snyder, eds., Introduction to X-Ray Powder Diffractometry, John Wiley & Sons, New York (1996); Bunn, ed., Chemical Crystallography, Clarendon Press, London (1948); and Klug & Alexander eds., X-ray Diffraction Procedures, John Wiley & Sons, New York (1974)). Дифракційні рентгенограми солей, що описані в прикладах від 1 до 3 вище (у безводній формі) були отримані, як описано нижче: Для аналізу було застосовано парафокусний порошковий рентгенівський дифрактометр Брегга-Брентано з використанням монохроматичного випромінювання Сіка (45 кВ і 40 мА) . Первинна оптика містила щілини Соллера та автоматичні антирозсіювачні щілини. Плоскі зразки були підготовлені на нульових поверхнях пластин, які оберталися протягом вимірів. Вторинна оптика містила щілини Соллера, автоматичні антирозсіювачні щілини, щілиниотримувачі та монохроматор. Дифрагірований сигнал було виявлено пропорційним детектором, заповненим ксеноном. Дифрактограми були зібрані в межах з 2 ° ≤ 2q (тета) ≤ 40 ° в безперервному режимі сканування з кроком в 0, 016 ° 2q у розмірі 4 ° 2q на хвилину. Необроблені дані було зібрано в електронному вигляді. Оцінка була проведена на необроблених або згладжених дифракційних пробах. В режимі віддзеркалення для вищезгаданих вимірювань був застосований дифрактометр Panalytical X'pert PRO MPD QQ. Фахівці у даній галузі можуть встановлювати інструментальні параметри для порошкових рентгенівських дифрактометрів так, щоб ці дані дифракції можна було накопичувати з вже зібраними порівняними результатами. Отримані результати представлені на фіг.1, фіг.2 та фіг. 3. В таблицях A, B і C нижче кожна налічує 2q (2 тета) значення (точність: / - 0, 1 ° 2а), г відстаней і відносних інтенсивностей піків, які показані в рентгенівських дифракційних пробах, відповідно фіг. 1, 2 та 3. Таблиця А Рентгенодифрактограма гідрохлоріду 2Ø () 4.6 9.2 10.1 11.3 12.1 13.2 13.7 16.2 16.5 d-параметр (Å) 19.2 9.7 8.8 7.8 7.3 6.7 6.5 5.5 5.4 2Ø () 16.9 17.6 19.2 20.2 21.7 22.1 22.9 24.1 27.1 Відносна інтенсивність (%) 100 7 3 5 6 4 10 6 8 35 7 d-параметр (Å) 5.2 5.0 4.6 4.4 4.1 4.0 3.9 3.7 3.3 Відносна інтенсивність (%) 21 15 8 22 22 7 4 22 6 UA 100996 C2 Таблиця В Рентгенодифрактограма гідроброміду 2Ø () 5.1 9.7 10.2 10.5 10.8 13.3 15.1 15.9 16.8 17.1 17.7 17.9 18.0 18.4 18.7 d-параметр (Å) 17.2 9.1 8.6 8.4 8.2 6.7 5.9 5.6 5.3 5.2 5.0 5.0 4.9 4.8 4.7 2Ø () 20.7 21.0 21.3 22.2 22.5 22.9 23.2 24.0 24.5 24.9 25.7 26.1 26.3 27.3 Відносна інтенсивність (%) 100 10 16 6 12 16 19 25 14 52 16 36 15 13 22 d-параметр (Å) 4.3 4.2 4.2 4.0 4.0 3.9 3.8 3.7 3.6 3.6 3.5 3.4 3.4 3.3 Відносна інтенсивність (%) 45 52 73 21 26 10 10 13 56 14 14 16 13 9 Таблиця С Рентгенодифрактограма малеату 2Ø () 5.0 9.3 9.8 9.9 11.5 11.8 12.1 12.6 13.9 14.9 15.6 15.9 16.3 16.7 17.3 5 10 15 d-параметр (Å) 17.7 9.5 9.1 8.9 7.7 7.5 7.3 7.0 6.4 5.9 5.7 5.6 5.4 5.3 5.1 2Ø () 17.9 18.1 18.5 19.4 19.7 19.9 20.7 20.9 22.1 22.7 22.9 24.3 24.9 26.5 Відносна інтенсивність (%) 19 86 33 15 24 27 26 17 40 73 15 12 13 16 32 d-параметр (Å) 5.0 4.9 4.8 4.6 4.5 4.5 4.3 4.3 4.0 3.9 3.9 3.7 3.6 3.4 Відносна інтенсивність (%) 32 62 16 15 48 30 16 26 32 16 39 100 88 30 Приклад 5 Диференціальна сканувальна калориметрія (ДСК) Використовували стандартні способи, наприклад, які описані у Höhne, G. W. H. et al (1996), Differential Scanning Calorimetry, Springer, Berlin. Калориметрична реакція тестового зразка досліджувалася при підвищенні температури на диференційному скануючому калориметрі з модульованою температурою (MTDSC )TA Instruments Q1000 з використанням модуляції ± 0,50 ° C з інтервалом в 40 секунд і швидкістю прискорення 5 ° C у хвилину. Зразки кількістю приблизно з 1 по 5 мг були поміщені в алюмінієвих чашках з кришками (без обпресування) у середовище рідкого азоту. Добре відомо, що початок ДСК і пікові температури можуть змінюватися в залежності від чистоти зразка та інструментальних показників, особливо температури сканованої долі. Фахівці можуть використовувати звичайну оптимізацію / калібрування, створюючи інструментальні параметри для диференційного скануючого калориметра так, щоби ці дані можна було 8 UA 100996 C2 5 10 15 20 порівняти з отриманими для подальшого накопичування інформації. Температура плавлення типового зразку безводної солі моногідрохлоріду, що була отримана в Прикладі 1 (с) дорівнювала 144 ° C ± 3 ° C (початкова). Температура плавлення типового зразку безводної солі моногідроброміду, що був отриманий в Прикладі 2 (б) дорівнювала 150 ° C ± 3 ° C (початкова). Температура плавлення типового зразку безводної солі дималеату, що був отриманий у Прикладі 3 (б) дорівнювала 150 ° C ± 3 ° C (початкова). Приклад 6 Зменшення розмірів частинок Для зменшення розмірів частинок було використано млин 2” Spiral Jet Mill (SJM). Зменшення було проведено на трьох тестових речовинах: сіль моногідрохлоріду стосовно Прикладу 1 (сіль, що була винайдена), сіль дималеату стосовно Прикладу 3 (так само) та вільна лужна основна сполука, метил-(3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін4-ілпропіл)-аміно ]-метил)-феніл)-ацетат (порівнювальна сполука). Просіяну партію випробуваної речовини подавали у камеру струменевого млина вібраційним подавальником через систему подачі Вентурі. Мікронізація була досягнута за рахунок зіткнень принесених частинок стисненим газом (азот), пропущеним через кутові сопла в камері струменевого млину. Частинки різних розмірів розвивали різні швидкості та інерцію та, коли розмір часток зменшувався, вони спускалися у бік центру струменевого млину та виходили через отвір у збираючу скриньку. Параметрами процесу, від якіх залежить розмір частинок, на додаток до притаманним цім сполукам властивостям до мікронізації, є швидкість подачі, тиск шліфування та тиск Вентурі, що узагальнено в наступній Таблиці I. Таблиця І Тест-сполука Порівнювальна сполука Дималеат Моногідрохлорид 25 30 35 40 45 50 Оброблена кількість (g) Вихід (%) 1.7 1.7 2.0 37 48 85 Швидкість подачі Тиск Вентурі (bar) Тиск розмелення (bar) Постійний 5 (4) 2 (1) Постійний Постійний 5 5 2 1 У зв'язку з нарощуванням кількості порівняльної сполуки на виході, млин почав зупинятися. Зниження тиску шліфування/тиску Вентурі з 2/5 бар до 1/4 бар не дало значного позитивного ефекту у цьому відношенні. Таким чином, зниження розмірів частин порівняльної сполуки було перервано після завантаження тільки 1, 7 г замість передбачуваних 7 г. На відміну від цього, моногідрохлорід та дималеат легко мікронізувалися і не було ніякого істотного блокування млина в процесі обробки. Приклад 7 Вимірювання частинок дрібної фракції (FPF) Порядок виконання Вимірювання FPF, починаючи з одержаної речовини, було проведено у відповідності з наступним порядком: 1. Зниження розмірів частинок отриманої речовини. 2. Вимірювання розмірів частинок (після зменшення розміру) за допомогою інструменту лазерної дифракції. 3. Ручне завантаження зразка. 4. Дезагрегація порошку та збір аерозолю у каскадну дробарку. 5. Визначення кількості способом рідинної хроматографії під високим тиском (ВЕРХ) і розрахунок FPF. Було випробувано три речовини: моногідрохлорид за Прикладом 1 ( сіль, що була винайдена), моногідробромід за Прикладом 2 (сіль, що була винайдена) і вільну базову сполуку метил-(3-([[3-(6-аміно-2-бутоксі-8-оксо-7,8-дигідро-9H-пурин-9-іл)-пропіл]-(3-морфолін-4ілпропіл)-аміно-метил]-феніл))-ацетат (порівняльна сполука). Зменшення розмірів частинок. Зменшення розмірів частинок (мікронізація) було виконано у струменевому млині, в якому під тиском газу, використованого для виробництва субстанції, відбувалися зіткнення частинок з високою швидкістю для того, щоби отримати зменшення їх розміру. Вимірювання розмірів частинок: 9 UA 100996 C2 Вимірювання розмірів частинок проводилося з використанням лазерної дифракції на приладі Malvern Scirocco. Отримані результати представлені у наступній Таблиці 1. Таблиця 1 Тест-сполука Порівнювальна сполука Моногідрохлорід (винахід) Моногідробромід (винахід) 5 10 15 20 25 30 Тиск (bar) 4 1.5 1.5 d(0.1) ( мкм) 0.6 0.9 0.8 d(0.5) (мкм) 1.7 1.8 1.9 d(0.9) (мкм) 4.1 3.5 4.1 Завантаження проби. Дози 1-2 мг зважували вручну (без зіскоблювання) в порожнини прототипу інгалятора (див. нижче). Два експерименти було проведено для кожної речовини, що тестувалася, та дві дози були використані в кожному досвіді і, таким чином, взагалі в експерименті було використано 4 дози кожної речовини, що тестувалася. Зразки сушили в азотному середовищі протягом ночі перед проведенням експериментів. Експериментальне обладнання і дезагрегація порошку. Для детального оцінювання частинок була застосована каскадна дробарка нового покоління, NGI. Вона детально описана в фармакопеї USP, (general chapter AERSOLS, NASAL SPRAYS, METERED-DOSE INHALERS, AND DRY POWDER INHALERS, apparatus 5) та у Eur. Pharmacopoeia (5.8 section 2.9.18 PREPARATIONS FOR INHALATION: AERODYNAMIC ASSESSMENT OF FINE PARTICLES, apparatus E), де є докладний опис про те, як її встановлювати, керувати та калібрувати для використання на різних швидкостях потоку. У даному випадку було застосовано дві дробарки NGI, по одній на експеримент. Простий прототип інгалятору, що був використаний для випробувань, складався з циліндричних каналів L-форми, включаючи вертикальну і горизонтальну складові. Прототип інгалятора з’єднувався з NGI дробаркою через USP-вхід. Дрібнодисперсний порошок переміщувався через вертикальний канал у закруті прототипу інгалятора (тобто через вигин Гподібного каналу). Кожна доза 1-2 мг порошку переміщувалась повітряним потоком швидкістю 60 л/хв протягом 2 секунд (вимірюється на вході в індукційному отворі), порошок, що знаходився у вигині, втягувався, і після цього аерозоль переміщувався через горизонтальну складову каналу, спіраль мундштуку і NGI дробарку. Порошки ліків збиралися в індукційному отворі та на 8 чашок (див. посилання наведені вище). Вилучення та збір порошків ліків проводили в ізоляційному боксі (рукавичкою) з рівнем відносної вологості нижче 2%. Аналіз ВЕРХ. Порошок, зібраний в індукційному отворі та на 8 чашках потім був кількісно аналізований з використанням методології рідинної хроматографії високого тиску, як описано в Таблиці 2. Таблиця 2 Параметри Колона Температура колони (°C) Потік (ml/min) Мобільна фаза A Мобільна фаза B Композиція Об'єм ін’єкції (l) Довжина хвилі детектора (nm) Порівняння cpd. Thermo Electron Hypersil Gold 50 mm Χ 3 mm. 3 мкм частини Тест-сполука Моногідрохлорід Моногідробромід Symmetry C18 150 mm Χ 3mm. 3.5 мкм частини Symmetry C18 150 mm Χ 3mm. 3.5 мкм частини 20 40 60 1.0 0.64 0.02% трифлуороацетової 0.1% ацетату амонія у воді. кислоти у воді. 0.1 % ацетату амонія у 0.02% трифтороацетової воді/ацетонітрилі (10/90%) кислоти у ацетонітрилі. Iзократичний, A/B : 60/40% Ізократичний, A/B : 81/19% 20.0 75 283 244 0.64 0.02% трифлуороацетової кислоти у воді. 0.02% трифтороацетової кислоти у ацетонітрилі. Ізократичний, A/B : 81/19% 75 244 35 Розрахунок. Основні дані, які було використовувано для розрахунків FPF, що були отримані аналізами 10 UA 100996 C2 ВЕРХ, представлені у Таблиці 3.Розрахунки FPF були зроблені шляхом фармакопеї (див. посилання вище). Таблиця 3 Дані Отриманий рівень (g) Зібрано на стадіях 3-8 (