Лікування гломерулонефриту та хронічної ниркової недостатності за допомогою інтерферону-b

1. Застосування терапевтичного агента ІФН- b для виробництва лікарського засобу для лікування або профілактики гломерулонефриту у ссавця. 2. Застосування за п. 1, де гломерулонефрит вибраний з групи, що складається з фокального гломерулосклерозу, колабуючих гломерулопатій, хвороби з мінімальними змінами, серпоподібного гломерулонефриту, нефритичного синдрому, нефротичного синдрому, первинного гломерулонефриту, вторинного гломерулонефриту, проліферативного гломерулонефриту, мембранозного гломерулонефриту, мембранопроліферативного гломерулонефриту, імунокомплексного гломерулонефриту, гломерулонефриту з антитілами проти базальної мембрани клубочків (анти-GBM), олігоімунного гломерулонефриту, діабетичної гломерулопатії, хронічного гломерулонефриту та спадкового нефриту. 3. Застосування за п. 1 або п. 2, де терапевтичний агент ІФН- b містить зрілий ІФН- b . 4. Застосування за будь-яким з пп. 1-3, де ІФН- b являє собою ІФН- b людини. 5. Застосування за п. 4, де ІФН- b щонайменше приблизно на 95 % ідентичний повнорозмірному зрілому ІФН- b людини, що має SEQ ID NO:4. 6. Застосування за п. 4, де ІФН- b являє собою ІФН- b -1а. 7. Застосування за п. 4, де ІФН- b являє собою ІФН- b -1b. 2 (19) 1 3 88440 4 фриту, імунокомплексного гломерулонефриту, 29. Спосіб за п. 28, де терапевтичний агент ІФН- b гломерулонефриту з антитілами проти базальної містить зрілий ІФН- b . мембрани клубочків (анти-GBM), олігоімунного 30. Спосіб за п. 28 або п. 29, де ІФН- b являє согломерулонефриту, діабетичної гломерулопатії, бою ІФН- b людини. хронічного гломерулонефриту та спадкового неф31. Спосіб за п. 30, де ІФН- b щонайменше пририту. 22. Спосіб за п. 20 або п. 21, де терапевтичний близно на 95 % ідентичний повнорозмірному зріагент ІФН- b містить зрілий ІФН- b . лому ІФН- b людини, що має SEQ ID NO:4. 23. Спосіб за будь-яким з пп. 20-22, де ІФН- b яв32. Спосіб за п. 30, де ІФН- b являє собою ІФН- b ляє собою ІФН- b людини. 1а. 33. Спосіб за п. 30, де ІФН- b являє собою ІФН- b 24. Спосіб за п. 23, де ІФН- b щонайменше при1b. близно на 95 % ідентичний повнорозмірному зрі34. Спосіб за будь-яким з пп. 28-33, де ссавець лому ІФН- b людини, що має SEQ ID NO:4. являє собою людину. 25. Спосіб за п. 23, де ІФН- b являє собою ІФН- b 35. Спосіб за будь-яким з пп. 20-34, у якому сса1а. вець немає інших показань для лікування ІФН- b . 26. Спосіб за п. 23, де ІФН- b являє собою ІФН- b 36. Спосіб за п. 35, у якому у ссавця немає вірус1b. ної інфекції, яку можна лікувати за допомогою ІФН27. Спосіб за будь-яким з пп. 20-26, де ссавець b. являє собою людину. 37. Спосіб я за п. 35, у якому ссавець не є носієм 28. Спосіб лікування хронічної ниркової недостатвірусу гепатиту. ності у ссавця, що включає виявлення ссавця, 38. Спосіб за п. 35, у якому у ссавця немає вовчаякий має хронічну ниркову недостатність, і ввека. дення даному ссавцеві терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента ІФН- b . Хронічна ниркова недостатність (ХНН) може бути визначена як прогресуюче, перманентне і істотне зниження швидкості клубочкової фільтрації (ШКФ), зумовлене значною і триваючою втратою нефронів. Хронічна декомпенсована ниркова недостатність зазвичай починається з того моменту, коли хронічна ниркова недостатність (тобто перманентне зниження функції нирок щонайменше на 50-60%), веде до деякого ушкодження ниркової тканини, що викликає істотну втрату нефронів. Початкове ушкодження може бути пов'язане або не пов'язане з епізодом гострої ниркової недостатності, або воно може бути пов'язане з будь-якою кількістю ниркових порушень, включаючи, але не обмежуючись цим, кінцеву стадію ниркового захворювання, хронічну діабетичну нефропатію, діабетичну гломерулопатію, діабетичну ниркову гіпертрофію, гіпертензивний нефросклероз, гіпертензивний гломерулосклероз, хронічний гломерулонефрит, спадковий нефрит, ниркову дисплазію та хронічне відторгнення після трансплантації ниркового алотрансплантата. Незалежно від природи початкового ушкодження хронічна декомпенсована ниркова недостатність проявляється у вигляді «загальних кінцевих проявів» ознак і симптомів в результаті прогресуючої втрати нефронів і прогресивного зниження ХНН. Дане прогресуюче погіршення функції нирок є повільним, зазвичай таким, що триває у хворих людей багато років або десятиріч, але, мабуть, неминучим. У людини при прогресуванні декомпенсованої ниркової недостатності і продовженні зниження ШКФ до менше ніж 10% від норми (наприклад, 510мл/хв) суб'єкт входить в кінцеву стадію ниркового захворювання (ESRD). Протягом даної фази нездатність нефронів, що залишилися, адекватно видаляти відходи життєдіяльності з крові при утриманні корисних продуктіві підтримці балансу рідини та електролітів призводить до погіршення стану, при якому може швидко розвинутися недостатність багатьох систем органів і особливо серцево-судинної системи. З цього моменту ниркова недостатність буде швидко прогресувати, призводячи до смерті, поки суб'єкт не почне зазнавати ниркової замісної терапії (тобто хронічного гемодіалізу, постійного перитонеального діалізу або трансплантації нирки). Одним нирковим захворюванням, яке може вести до ХНН, є гломерулонефрит. Гломерулонефрит характеризується запаленням і виникаючим внаслідок цього збільшенням клубочків, що зазвичай зумовлено утворенням імунних комплексів. Акумуляція імунних комплексів в клубочках веде до запальних відповідей, що залучають, серед іншого, гіперплазію клітин, яка може викликати повну або часткову блокаду клубочкової фільтрації, серед інших факторів, звужуючи просвіти капілярів. Одним з результатів даного процесу є інгібування нормальної фільтраційної функції клубочка. Блокада може виникати у великій кількості клубочків, безпосередньо погіршуючи функцію нирок і часто викликаючи аномальне відкладення білків в стінках капілярів, що входять до складу клубочка. Таке відкладення може, в свою чергу, викликати пошкодження базальних мембран клубочків. У тих клубочках, які не заблоковані, розвивається підвищена проникність, що дозволяє великій кількості білка надходити до сечі, стан, що позначається як протеїнурія. 5 88440 6 білком, який є щонайменше приблизно на 95% У багатьох випадках тяжкого гломерулонефриту в просторі Боумена утворюються патологічні ідентичним повнорозмірному зрілому ΙΦΗ-b людиструктури, які називаються серпоподібними, додану, що має SEQ ID NO: 4. ΙΦΗ-b може бути повнотково перешкоджаючи клубочковій фільтрації. Дані розмірним зрілим ΙΦΗ-b людини, що включає або структури можуть бути виявлені тільки при мікроскладається з SEQ ID NO: 4. ΙΦΗ-b може бути гліскопічному дослідженні зразків тканини, отриманих козильованим або не глікозильованим. Терапевтипри біопсії або некропсії, і, таким чином, не завжди чний агент ΙΦΗ-b може також бути повнорозмірним виявляються у тих хворих, у яких вони існують. зрілим ΙΦΗ-b людини, що включає SEQ ID NO: 4, Серпоподібні структури є виявом гіперплазії клітин сполучену з константною ділянкою молекули імуі, як вважається, виникають через екстенсивну ноглобуліну людини, наприклад, з важким ланцюаномальну проліферацію пристінкових епітеліальгом IgGl. Наприклад, терапевтичний агент ΙΦΗ-b них клітин, клітин, які утворюють внутрішню вистіможе включати SEQ ID NO: 14. Терапевтичний лку капсули Боумена. Клінічне дослідження покаагент ΙΦΗ-b може також включати пегильований зало, що існує приблизна кореляція між відсотком ΙΦΗ-b. клубочків з серпоподібними структурами і тяжкістю Терапевтичний агент ΙΦΗ-b може включати захворювання і, таким чином, прогнозом для хвостабілізуючий агент, який може являти собою кисрого. За присутності у великій кількості серпоподілу амінокислоту. Він також може являти собою бні структури є поганою прогностичною ознакою. аргінін. Терапевтичний агент ΙΦΗ-b може мати рН Приблизно 600 хворих на мільйон в США знаміж приблизно 4,0 та 7,2. У переважному здійсходяться на хронічному діалізі кожного року при ненні терапевтичний агент ΙΦΗ-b являє собою середній вартості, що наближується до 60000$AVONEXÒ. 80000$ на хворого за рік. З нових випадків кінцевої Терапевтичний агент ΙΦΗ-b може вводитися стадії ниркового захворювання кожного року припарентерально, наприклад, внутрішньовенно (в. близно 28-33% зумовлено діабетичною нефропав.), підшкірно та внутрішньом'язово (в. м.). Спосіб тією (або діабетичною гломерулопатією чи діабеможе включати введення ссавцеві декількох доз тичною нирковою гіпертрофією), 24-29% терапевтичного агента ΙΦΗ-b. Терапевтичний зумовлено гіпертензивним нефросклерозом (або гіпертензивним гломерулосклерозом) і 15-22% агент ΙΦΗ-b можна вводити протягом декількох зумовлено гломерулонефритом. 5-річний коефіціднів. Наприклад, його можна вводити щотижня в єнт виживаності для всіх хворих на хронічному дозі 6 МIU. Його можна також вводити тричі на діалізі становить приблизно 40%, але для хворих, тиждень в дозі 3, 6 або 12 MIU. Введення терапевстарших 65 років, коефіцієнт знижується до притичного агента ΙΦΗ-b може знизити, наприклад, близно 20%. Отже, існує потреба в лікуванні, яке протеїнурію, проліферацію клітин клубочків або повинне запобігти прогресуючій втраті ниркової запалення клубочків у ссавця. функції, яка примушує майже двісті тисяч хворих У переважному здійсненні ссавцем є людина. тільки в США ставати залежними від хронічного Людина може бути пацієнтом. Ссавцем може бути діалізу і яка веде до передчасної смерті десятків ссавець, який має схильність до розвитку глометисяч хворих кожний рік. рулонефриту, що виявляється, наприклад, за В одному з втілень винахід являє собою спосіб ознаками розвитку запалення щонайменше одного лікування гломерулонефриту або хронічної ниркоклубочка. Ссавцем може бути ссавець, який має вої недостатності у ссавця, у якого є гломерулосхильність до розвитку хронічної тяжкої ниркової нефрит або ймовірність розвитку гломерулонефнедостатності або мати хронічну тяжку ниркову риту, що включає введення ссавцеві терапевтично недостатність, що виявляється, наприклад, за наефективної кількості ΙΦΗ-b-вмісного терапевтичноявністю хронічної ниркової недостатності. Ссавець го агента. У винаході також пропонується застосуідентифікується як такий, що має гломерулонефрит, за присутністю запалення щонайменше одновання ΙΦΗ-b-вмісного терапевтичного агента для го клубочка; гіпертрофії клубочків; гіпертрофії трувиробництва лікарського засобу для лікування або бочок; гломерулосклерозу; або профілактики гломерулонефриту. Гломерулонефтубулоінтерстиціального склерозу. У певних здійсрит може бути вибраний з групи, що складається з неннях "ссавець" в даному контексті не означає фокального гломерулосклерозу, колабуючих глоссавця, який є носієм вірусу, наприклад, вірусу мерулопатій, захворювання з мінімальними змінагепатиту, такого як гепатит В або С, що викликає ми, серпоподібного гломерулонефриту, нефритигломерулонефрит, або ссавця, в якого гломерулочного синдрому, нефротичного синдрому, нефрит був викликаний вірусом. В інших втіленнях первинного гломерулонефриту, вторинного гломессавець не страждає кінцевою стадією тяжкої ниррулонефриту, проліферативного гломерулонефкової недостатності або нирково-клітинною карцириту, мембранозного гломерулонефриту, мембраномою. нопроліферативного гломерулонефриту, На Фіг.1 представлені послідовності нуклеотиімунокомплексного гломерулонефриту, гломерудів (SEQ ID NO: 11) і амінокислот (SEQ ID NO: 12) лонефриту з антитілами проти базальної мембрагібридного білка, що складається з сигнальної пони клубочків (анти-GBM), оліго-імунного гломеруслідовності VCAM, з'єднаної зі зрілим повнорозмілонефриту, діабетичного гломерулонефриту, хронічного гломерулонефриту та спадкового глорним ΙΦΗ-b людини (SEQ ID NO: 3 і 4), в якому гліцин в амінокислоті 162 SEQ ID NO: 4 замінений мерулонефриту. ΙΦΗ-b може бути зрілим або нена цистеїн, з'єднаний з шарнірними СН2 і CH3 дозрілим і може бути позбавлений початкового метіменами IgGlFc людини (ZL5107). оніну. ΙΦΗ-b може являти собою ΙΦΗ-b людини, наприклад, ΙΦΗ-b-1а та ΙΦΗ-b-1b. ΙΦΗ-b може бути 7 88440 8 Єдині форми, що застосовуються в описі та На Фіг.2 представлені послідовності нуклеотидоданій формулі винаходу, включають численні дів (SEQ ID NO: 13) і амінокислот (SEQ ID NO: 14) згадки, якщо в контексті ясно не вказано інакше. гібридного білка, що складається з сигнальної по«Швидкість клубочкової фільтрації» або слідовності VCAM, з'єднаної зі зрілим повнорозмі«ШКФ» пропорційна швидкості кліренсу в сечу рним ΙΦΗ-b людини (SEQ ID NO: 3 і 4), в якому речовини, що знаходиться в плазмі, яка не зв'язагліцин в амінокислоті 162 SEQ ID NO: 4 замінений на з білками сироватки, вільно фільтрується клуна цистеїн, з'єднаний з лінкером G4S, який з'єднабочками та не секретується або не реабсорбуєтьний з шарнірними СН2 і CH3 доменами IgGlFc люся нирковими трубочками. ШКФ (GFR) переважно дини (ZL6206). визначається наступним рівнянням: На Фіг.3 представлений рівень протеїнурії на 7-ий, 14-ий, 21-ий та 28-ий день у щурів, страждаючих нефротоксичним нефритом (NTN), які отриU ´V GFR = conc мували 3´105 одиниць ΙΦΗ-b щурів на день, 6´105 Pconc , одиниць ΙΦΗ-b щурів на день або тільки вектор («контроль») 6 днів на тиждень, починаючи з доби де Uconc являє собою концентрацію маркера в 0. сечі, Рconc являє собою концентрацію маркера в На Фіг.4 представлений рівень протеїнурії на плазмі і V являє собою швидкість потоку сечі в 7-ий, 14-ий, 21-ий та 28-ий день у щурів, страждамл/хв. Необов'язково ШКФ коректують на площу ючих нефротоксичним нефритом (ΝΤΝ), які отриповерхні тіла. Отже, величини ШКФ, що застосо5 мували 6´10 одиниць ΙΦΗ-b щурів на день або вуються тут, можуть бути розглянуті як такі, що тільки вектор («контроль») 6 днів на тиждень, познаходяться в одиницях мл/хв/1,73м2. Переважним чинаючи з доби 0. вимірюванням ШКФ є кліренс інсуліну, але через На Фіг.5 представлена кількість проліферуюважкість вимірювання концентрацій даної речовичих клітин клубочків щурів, страждаючих нефротони в клінічній практиці зазвичай застосовують клі5 ксичним нефритом (ΝΤΝ), які отримували 6´10 ренс креатиніну. Наприклад, для здорового чолоодиниць ΙΦΗ-b щурів на день або тільки вектор віка середнього розміру (70кг, 20-40 років) типова («RSA») 6 днів на тиждень з доби 0 до 7-ї доби. ШКФ, виміряна за кліренсом креатиніну, як очікуНа Фіг.6 представлений рівень протеїнурії на ється, становить приблизно 125мл/хв при концен7-ий та 10-ий день у щурів, страждаючих гломерутрації креатиніну в плазмі 0,7-1,5мг/дл. Для порівлонефритом Thy 1, які отримували 6´105 одиниць няння у жінки середнього розміру типова ШКФ, ΙΦΗ-b щурів на день або тільки вектор («RSA») 6 виміряна за кліренсом креатиніну, як очікується, днів на тиждень, починаючи з доби 0 до 10-їдоби. становить приблизно 115мл/хв при рівні креатиніНа Фіг.7 представлений рівень кліренсу креану 0,5-1,3мг/дл. У період гарного самопочуття ветину на 7-ий та 10-ий день у щурів, страждаючих личини ШКФ людини є відносно стабільними до гломерулонефритом Thy 1, які отримували 6´105 віку приблизно 40 років, коли ШКФ зазвичай почиодиниць ΙΦΗ-b щурів на день або тільки вектор нає вікове зниження. Для суб'єктів, які прожили до («RSA») 6 днів на тиждень, починаючи з доби 0 до віку 85 або 90 років, ШКФ може бути знижена до 10-їдоби. 50% в порівнянні з величинами у віці 40 років. МоНа Фіг.8 представлена шкала проліферації же бути запропоноване визначення «очікуваної клубочків на 10-ий день у щурів, страждаючих ШКФ» або "GFRexp" (ШКФочікувана) на основі врахугломерулонефритом Thy 1, які отримували 6´105 вання віку суб'єкта, маси, статі, площі поверхні одиниць ΙΦΗ-b щурів на день або тільки вектор тіла та ступеня розвитку м'язів, а також концент(«RSA») 6 днів на тиждень, починаючи з доби 0 до рації в плазмі деякої маркерної сполуки (напри10-їдоби. клад, креатиніну), що визначається за тестуванНа Фіг.9 представлений рівень протеїнурії на ням у крові. Таким чином, як приклад, очікувана 7-ий і 14-ий день у щурів, страждаючих пуроміцинШКФ або ШКФехр може бути визначена як: амінонуклеозидною нефропатією (PAN), які отримували 6´102, 6´103, 6´104 або 6´105 одиниць (140 - вік ) ´ маса(кг ) GFRexp » ΙΦΗ-b щурів на день або тільки вектор («конт72 ´ Рconc (мг / дл) роль»). Винахід щонайменше частково ґрунтується на Дане визначення не враховує такі фактори, як відкритті того, що щонайменше певного роду симплощу поверхні, ступінь розвитку м'язів або відсоптоми гломерулонефриту у ссавця можуть бути ток жирової тканини в організмі. Однак, при застополегшені введенням ΙΦΗ-b ссавцеві. Зокрема, суванні рівня креатиніну в плазмі як маркера дана виявлено, що протеїнурія, проліферація клітин формула застосовувалася для чоловіків як недоклубочків і запалення значно знижуються при вверогий спосіб визначення ШКФ. Оскільки креатинін денні ΙΦΗ-b. Відповідно, у винаході пропонуються продукується нирково-смугастими м'язами, очікуспособи та композиції для лікування гломерулована ШКФ або GFRexp жінок визначається за допонефриту у ссавців. могою того ж рівняння, помноженого на 0,85 для 1. Визначення врахування очікуваних відмінностей у м'язовій маДля більш виразної і короткої вказівки предмесі. [Дивись Lemann, et al., (1990) Am. J. Kidney Dis. та обговорення, заявленого у винаході, пропону16 (3):2236-243]. ються наступні визначення специфічних термінів, «Гломерулонефрит», «нефрит», «гострий нещо застосовуються в описі та доданій формулі фрит» і «гломерулярний нефрит» застосовуються винаходу. тут як взаємозамінні терміни. 9 88440 10 Нуклеїнова кислота є «оперативно пов'яза«ΙΦΗ-b-1a» відноситься до молекули ΙΦΗ-b, ною» з іншою нуклеїновою кислотою, коли вона що має амінокислотну послідовність ΙΦΗ-b людини розміщена в функціональному взаємозв'язку з дикого типу та глікозильованої. послідовністю іншої нуклеїнової кислоти. Напри«ΙΦΗ-b-1b» відноситься до молекули ΙΦΗ-b, клад, ДНК для препослідовності лідера секреції що має амінокислотну послідовність ΙΦΗ-b дикого (наприклад, сигнальної послідовності сигнального типу, в якій цистеїн в положенні 17 замінений на пептиду) оперативно зв'язана з ДНК, що кодує серин; метіонін в положенні 1 («початковий метіополіпептид, якщо ДНК експресується у вигляді нін») відсутній і молекула не глікозильована. пребілка, який бере участь в секреції поліпептиду; «Варіант ΙΦΗ-b» відноситься до білка ΙΦΗ-b промотор або енхансер оперативно зв'язаний з дикого типу, що має одну або більше модифікацій, кодуючою послідовністю, якщо він впливає на наприклад, делецій амінокислот, домішок, замін, транскрипцію послідовності; і зв'язувальний сайт посттрансляційну модифікацію або введення одрибосоми оперативно зв'язаний з кодуючою посліного чи більше неіснуючих в природі амінокислотдовністю, якщо він розташований так, що сприяє них залишків або лінкерів між ними. Частини ΙΦΗ-b трансляції. Зазвичай «оперативно зв'язані» ознавключаються до терміну «варіант ΙΦΗ-b». «Біолочає, що послідовності ДНК, будучи зв'язаними, є гічно активний варіант ΙΦΗ-b» являє собою варіант стичними і у випадку, наприклад, лідери секреції ΙΦΗ-b, який має щонайменше деяку активність при стикаються в процесі зчитування. Скріплення сулікуванні ниркових порушень, наприклад, гломепроводжується лігуванням у відповідних сайтах рулонефриту. Варіант ΙΦΗ-b може бути існуючим в рестрикції. Якщо таких сайтів не існує, можуть буприроді ΙΦΗ-b, таким, що має, наприклад, вставку, ти використані синтетичні олігонуклеотидні адапделецію або заміну однієї або більше амінокислот тери або лінкери відповідно до загальноприйнятої по відношенню до ΙΦΗ-b дикого типу, тобто існуюпрактики. чим в природі мутантом або поліморфним варіан«Відсоток ідентичності» або «відсоток схожостом, або він може бути неіснуючим в природі ΙΦΗті» відноситься до схожості послідовностей двох b. поліпептидів, молекул або двох нуклеїнових кис«Виділений» (такий, що застосовується взаєлот. Коли положення в обох з двох послідовносмозамінно з «по суті чистий») при застосуванні до тей, що порівнюються, зайняте однією і тією ж мополіпептидів означає поліпептид, який внаслідок номерною одиницею основи або амінокислоти, то свого походження або маніпуляцій: (і) присутній в відповідні молекули є ідентичними за даним полоклітині-хазяїні як продукт експресії частини ексженням. Відсоток ідентичності двох послідовноспресійного вектора; (іі) зв'язаний з білком або інтей є функцією кількості відповідних або ідентичшою хімічною частиною, відмінною від тієї, до якої них положень, що є в двох послідовностях, він приєднаний в природі; або (ііі) не існує в прирозділеної на кількість порівнюваних полороді, наприклад, білок, який хімічно модифіковажень´100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень в ний шляхом привішування або додання щонаймедвох послідовностях відповідають або ідентичні, нше однієї гідрофобної частини до білка, так що то дві послідовності гомологічні на 60%. Як прибілок знаходиться у формі, яка не існує в природі. клад, послідовності ДНК CTGACT і CAGGTT проПід «виділеним» додатково мається на увазі білок, являють 50% гомологію (3 з сумарних 6 положень який: (і) синтезується хімічно; або (іі) експресуєтьвідповідають). Зазвичай порівняння роблять, коли ся в клітині-хазяїні і очищується від зв'язаних або дві послідовності вирівняні для отримання максизабруднюючих білків. Термін зазвичай означає мальної ідентичності. Таке вирівнювання може поліпептид, який відділений від інших білків і нукбути забезпечене при застосуванні, наприклад, леїнових кислот, з якими він співіснує в природі. способу Karlin і Altschul, описаного нижче більш Краще, щоб поліпептид був також відділений від детально. По відношенню до нуклеїнової кислоти речовин, таких як антитіла або матрикси гелю (по«відсоток гомології» і «відсоток ідентичності» заліакриламід), які застосовують для його очищення. стосовується взаємозамінно, в той час як по від«Виділений» (такий, що застосовується взаємозаношенню до поліпептиду «відсоток гомології» відмінно з «по суті чистий») при застосуванні до нукноситься до міри схожості, коли амінокислоти, що леїнових кислот відноситься до полінуклеотиду представляють консервативні заміни інших аміноРНК або ДНК, частини геномного полінуклеотиду, кислот, розглядаються як ідентичні цим іншим амікДНК або синтетичного полінуклеотиду, який внанокислотам. «Консервативна заміна» залишку в слідок свого походження або маніпуляцій: (і) не базовій послідовності являє собою заміну амінокизв'язаний з повним полінуклеотидом, з яким він слотою, котра фізично або функціонально схожа з зв'язаний в природі (наприклад, присутній в клітивідповідним базовим залишком, наприклад, має ні-хазяїні як експресійний вектор або його частисхожий розмір, конфігурацію, електричний заряд, на); або (іі) зв'язаний з нуклеїновою кислотою або хімічні властивості, включаючи здатність утворюіншою хімічною частиною, відмінною від тієї, до вати ковалентні або водневі зв'язки, або тому поякої він приєднаний в природі; або (ііі) не існує в дібне. Особливо переважними консервативними природі. Під «виділеною» додатково мається на замінами є ті, які задовольняють критерії, визнаувазі полінуклеотидна послідовність, яка (і) амплічені для «прийнятих точкових мутацій» в Dayhoff et фікується in vitro за допомогою, наприклад, поліal., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: меразної ланцюгової реакції (ПЛР); (іі) синтезуєтьSuppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. ся хімічно; (ііі) продукується рекомбінантно Foundation, Washington, Відсоток гомології або шляхом клонування; або (iv) очищується, наприідентичності двох амінокислотних послідовностей клад, шляхом відщеплення та розділення на гелі. або двох послідовностей нуклеїнових кислот може 11 88440 12 довжині 187 амінокислот, і кодуюча послідовність бути визначений із застосуванням алгоритму виріSEQ ID NO: 1 відповідає нуклеотидам 76-639. Сигвнювання Karlin і Altschul [Proc. Nat. Acad. Sci. USA нальна послідовність відповідає амінокислотам з 1 87: 2264 (1990)], модифікованого Karlin і Altschul по 21. Амінокислотна послідовність зрілої форми [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 5873 (1993)]. Такий алгоритм включено до програми NBLAST або даного ΙΦΗ-b відповідає амінокислотам 22-187 XBLAST у Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). (нуклеотиди 139-639 SEQ ID NO: 1). Зрілий білок BLAST пошуки виконуються за допомогою програΙΦΗ-b людини і кодуюча його нуклеотидна посліми NBLAST, бальна оцінка=100, довжина послідодовність представлені в SEQ ID NO: 4 і 3, відповівності=12, для отримання нуклеотидних послідовдно. ностей, гомологічних нуклеїновій кислоті винаходу. ΙΦΗ-b, який продукується клітинами ссавців, є BLAST пошуки білків виконуються за допомогою глікозильованим. Існуючий в природі ΙΦΗ-b дикого програми XBLAST, бальна оцінка=50, довжина типу глікозильований по залишку 80 (Asn 80) зріпослідовності=3, для одержання амінокислотних лого поліпептиду SEQ ID NO: 4 або залишку 101 послідовностей, гомологічних базовому поліпеп(Asn 101) незрілого поліпептиду SEQ ID NO: 2. тиду. Для одержання вирівнювань з пропусками Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b також включають для порівнянь застосовується BLAST з пропускаΙΦΗ-b, що не відноситься до людини, наприклад, ми, [як описано в Altschul et al., Nucleic Acid Res., хребетного, такого як ссавець, наприклад, не лю25: 3389 (1997)]. При застосуванні BLAST і BLAST диноподібних приматів, бичачий, овечий, свинний, з пропусками застосовуються параметри відповідкінський, котячий, собачий, щурячий та мишачий; них програм (XBLAST і NBLAST) за умовчанням. або птахів чи амфібій. Послідовності ΙΦΗ-b даних Дивись http://www/ncbi.nlm.nih.qov. видів можуть бути одержані з GenBank і/або публіТерапевтичний агент ΙΦΗ-b, як зазначається, кацій, або вони можуть бути визначені з нуклеїномає «терапевтичну ефективність» і кількість теравих кислот, виділених при м'яких умовах гібридипевтичного агента ΙΦΗ-b, як зазначається, є «тезації з геном ΙΦΗ-b інших видів. рапевтично ефективною», якщо введення даної Варіанти білків ΙΦΗ-b дикого типу включають кількості терапевтичного агента ΙΦΗ-b є достатнім білки, що мають амінокислотну послідовність, яка для індукції клінічно значного поліпшення стандарщонайменше приблизно на 70%, 80%, 90%, 95%, тних маркерів функції нирок при введенні суб'єкту 98% або 99% ідентична або гомологічна ΙΦΗ-b (наприклад, на тваринній моделі або людині), який дикого типу, наприклад, ΙΦΗ-b людини, що має страждає або відноситься до групи ризику розвитSEQ ID NO: 2 або 4. Варіанти можуть мати одну ку гломерулонефриту або хронічної ниркової неабо більше заміни амінокислот, делецій або добадостатності. Такі маркери ниркової функції добре вок. Наприклад, можуть бути застосовані біологічвідомі в медичній літературі і включають, не обно активні фрагменти білків ΙΦΗ-b дикого типу. межуючись цим, швидкості збільшення рівнів азоту Такі фрагменти можуть мати 1, 2, 3, 5, 10 або 20 сечовини BUN, швидкості збільшення креатиніну амінокислот, видалених, доданих або замінених на сироватки, статичні вимірювання BUN, статичні С- або N-кінці білка. Варіанти можуть також мати вимірювання креатиніну сироватки, швидкості клу1, 2, 3, 5, 10 або 20 амінокислотних замін, делецій бочкової фільтрації (ШКФ), відношення або добавок. Деякі варіанти можуть мати менш ніж BUN/креатинін, сироваткові концентрації натрію приблизно 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 або 5 аміно(Na+), відношення сеча/плазма для креатиніну, кислотних замін, делецій або добавок. Заміни мовідношення сеча/плазма для сечовини, осмотичжуть бути існуючими в природі амінокислотами ний тиск сечі, добову продукцію сечі тощо [дивись, або їх аналогами, наприклад, D-стереоізомерними наприклад, Brenner and Lazarus (1994) in Harrison's амінокислотами. Principles of Internal Medicine, 13th edition, В обсяг винаходу також входять варіанти ΙΦΗIsselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York; b, що кодуються нуклеїновими кислотами, які гібLuke and Strom (1994), in Internal Medicine, 4th ридизуються в суворих умовах з нуклеїновою кисEdition, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. лотою, що кодує існуючий в природі ΙΦΗ-b, наприLouis]. У переважному здійсненні введення тераклад, представлений послідовностями SEQ ID NO: певтично ефективної кількості терапевтичного 1 або 3, або комплементарними їм. Відповідна агента ΙΦΗ-b призводить до зниження протеїнурії, суворість умов, які сприяють гібридизації ДНК, проліферації клітин клубочків або до зниження + наприклад, 6,0 x хлорид натрію/цитрат натрію присутності запальних клітин, наприклад, CD8 Т(SSC) при приблизно 45°С з подальшим промиклітин і макрофагів в клубочках. ванням 2,0´SSC при 50°С, відомі фахівцям в даній 2. Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b галузі техніки або можуть бути знайдені в Current Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b, які можуть бути Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, застосовані за винаходом, включають ΙΦΗ-b дикоN.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Наприклад, концентрація го типу та їх біологічно активні варіанти, наприсолі на стадії промивання може бути вибрана від клад, існуючі в природі і не існуючі в природі варім'яких умов гібридизації - приблизно 2,0´SSC при анти. Нуклеотидні та амінокислотні послідовності 50°С до суворих умов - приблизно 0,2´SSC при існуючого в природі людського ΙΦΗ-b дикого типу 50°С. Крім того, температура на стадії промивання представлені в SEQ ID NO: 1 і 2, відповідно, які може бути збільшена від м'яких умов - при кімнатідентичні номерам доступу GenBank NO: M28622 і ній температурі приблизно 22°С, до дуже суворих ААА36040, відповідно. Дані ІФН описуються також, умов - при приблизно 65°С. Як температуру, так і наприклад, в Seghal (1985) J. Interferon Res. 5:521. сіль можна варіювати, або температуру та конценПовнорозмірний білок ΙΦΗ-b людини складає по трацію солі можна підтримувати постійними при 13 88440 14 зміні іншої змінної. У переважному здійсненні нукз існуючим в природі людським ΙΦΗ-b дикого типу леїнова кислота, що кодує варіант ΙΦΗ-b, буде [див. WO 00/23472 і USSN 09/832659]. Інші переважні модифікації або заміни усувагібридизуватися з однією з SEQ ID NO: 1 або 3 або ють сайти міжмолекулярних поперечних зшивок комплементарних їм в помірно суворих умовах, або утворення неправильних дисульфідних містонаприклад, і, включаючи промивання при прибличків. Наприклад, ΙΦΗ-b, як відомо, має три залишзно 2,0´SSC і приблизно 40°С. В особливо переки cys в дикому типі в положеннях 17, 31 і 141 SEQ важному здійсненні нуклеїнова кислота, що кодує ID NO: 4. Один варіант ІФН являє собою ІФН, в варіант ΙΦΗ-b, буде зв'язуватися з однією з SEQ ID якому cys (С) в положенні 17 замінений на ser (S), No: 1 або 3 або комплементарних їм в дуже суво[як описано в патенті США №4588585]. Інші варіарих умовах, наприклад, і включаючи промивання нти ΙΦΗ-b включають варіанти ΙΦΗ-b, що мають, при приблизно 0,2´SSC і приблизно 65°С. наприклад, один або більше ser (S), що заміщують Прикладами модифікацій є консервативні моcys (С) в положенні 17 і val (V) в положенні 101, дифікації, які надають мінімального ефекту втозаміщений phe (F), trp (W), tyr (Y) або his (Η), переринній та третинній структурі білка. Приклади конважно phe (F) при нумерації відповідно до ΙΦΗ-b сервативних замін включають описані Dayhoff в Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978) і дикого типу, що має, наприклад, SEQ ID NO: 4, Argos в ЕМВО J., 8, 779-785 (1989). Наприклад, такого, як описаний, наприклад, в патенті США амінокислоти, що належать до однієї з наступних 6127332. Інші переважні варіанти включають полігруп, являють собою консервативні заміни: аlа, пептиди, що мають послідовність ΙΦΗ-b дикого pro, gly, gln, asn, ser, thr, cys, ser, tyr, thr; типу, наприклад, SEQ ID NO: 4, де val (V) в полоval, ile, leu, met, ala, phe, lys, arg, his; і phe, tyr, женні 101 при нумерації відповідно до ΙΦΗ-b дикоtrp, his. го типу заміщений на phe (F), tyr (Y), trp (W), his (H) Інші модифікації включають заміну однієї аміабо phe (F), так само, [як описано, наприклад, в нокислоти іншою амінокислотою, що може не обопатенті США 6127332]. в'язково являти собою консервативну заміну. НаІншими варіантами ΙΦΗ-b є зрілі молекули приклад, можуть бути зроблені заміни, які істотно ΙΦΗ-b з відсутністю початкового метіоніну, наприне впливають на тривимірну структуру ΙΦΗ-b. Триклад, метіоніну 1 SEQ ID NO: 4. Ілюстративні варівимірна структура не глікозильованого ΙΦΗ-b люанти ΙΦΗ-b не мають початкового метіоніну і мадини описана, наприклад, в Radhakrishnan et al. ють щонайменше одну амінокислотну заміну, (1996) Structure 4: 1453, і тривимірна структура наприклад, в положенні 17 зрілої форми, [як опиглікозильованого ΙΦΗ-b описана, наприклад, в сано в патенті США №4588585]. Karpusas et al. (1997) PNAS 94:11813. Істотно, що Молекули ΙΦΗ-b можуть також бути модифікоΙΦΗ-b включає п'ять спіралей: спіраль А, яка склавані шляхом заміни однієї або більше амінокислот дається з приблизно амінокислот 2-22 SEQ ID NO: однією чи більше дериватизованими амінокисло4; спіраль В, яка складається з приблизно амінотами, які є природними або не природними амінокислот 51-71 SEQ ID NO: 4; спіраль С, яка складакислотами, в яких існуючий в нормі бічний ланцюг ється з приблизно амінокислот 80-107 SEQ ID NO: або кінцева група модифікований за допомогою 4; спіраль D, яка складається з приблизно амінохімічної реакції. Такі модифікації включають, накислот 118-136 SEQ ID NO: 4; і спіраль Е, яка приклад, гамма-карбоксилювання, бетаскладається з приблизно амінокислот 139-162 карбоксилювання, пегілювання, сульфатування, SEQ ID NO: 4 [Karpusas et al., вище]. Спіралі А, В, сульфонування, фосфорилювання, амідування, С і Е утворюють закручену ліворуч чотириспіральестерифікацію, N-ацетилювання, карбобензилюну зв'язку типу 2. Існує довга петля у вигляді листвання, тозилювання та інші модифікації, відомі в ка конюшини, петля АВ, яка зв'язує спіралі А і В, і даній галузі техніки. три коротші петлі (позначаються ВС, CD і DE), які Інші модифікації включають застосування зв'язують спіралі, що залишилися [Karpusas et al., аналогів амінокислот або дериватизованих аміновище]. Попередні дослідження показали, що Nкислот, в яких бічний ланцюг подовжений або укокінцева, С-кінцева та глікозильована ділянки спірочений при забезпеченні, що все ще зберігаєтьралі С молекули ΙΦΗ-b не лежать в межах зв'язуся, карбоксильною, аміноабо іншою вального сайта для рецептора [дивись WO функціональною групою-попередником для крис00/23472 і USSN 09/832659]. Відповідно, мутації в талізації, а також аналогів амінокислот, що мають даних ділянках не повинні особливо несприятливо варіантні бічні ланцюги з відповідними функціонапозначитися на біологічній активності молекули льними групами. Наприклад, цільова сполука моІФН. Раніше також було показано, що мутації в же включати амінокислотний аналог, такий як, наспіралі С (амінокислоти 81, 82, 85, 86 і 89 зрілого приклад, ціаноаланін, канаванін, д'єнколеву ΙΦΗ-b людини) ведуть до молекули, що має більш кислоту, норлейцин, 3-фосфосерин, гомосерин, дигідроксифенілаланін, 5-гідрокситриптофан, 1високу противірусну активність в порівнянні з ΙΦΗметилгістидин, 3-метилгістидин, діамінопімелінову b дикого типу [дивись WO 00/23472 і USSN кислоту, орнітин або діаміномасляну кислоту. Інші 09/832659]. Подібно було показано, що мутанти по існуючі в природі метаболіти або попередники спіралі А (амінокислоти 2, 4, 8 і 11 зрілого ΙΦΗ-b амінокислот, що мають відповідні бічні ланцюги, людини) і по петлі CD (амінокислоти 110, 11, 113, повинні бути відомі фахівцям в даній галузі техніки 116 і 119) мають більш високу зв'язувальну активі включаються в обсяг даного винаходу. ність відносно рецептора і більш високу противіруІнші варіанти ΙΦΗ-b включають зворотні або сну та антипроліферативну активності в порівнянні ретро пептидні послідовності. «Зворотною» або 15 88440 16 «ретро» пептидною послідовністю позначають ту b, наприклад, член суперсімейства імуноглобулінів частину повної послідовності ковалентно пов'язаабо його фрагмент, або частину, наприклад, часних амінокислотних залишків (або їх аналогів чи тину або фрагмент IgG, наприклад, константну міметиків), в якій утворення пептидного зв'язку в ділянку важкого ланцюга IgGl людини, наприклад, нормальному напрямі від карбоксилу до аміно в СН2, СН3 та шарнірні ділянки. Конкретно «ΙΦΗ-b/Ig амінокислотному кістяку реверсовано так, що при гібрид» являє собою білок, що включає біологічно зчитуванні в загальноприйнятому напрямі зліва активну частину ΙΦΗ-b, з'єднану з N-кінцем ланцюнаправо аміночастина пептидного зв'язку передує га імуноглобуліну. Види ΙΦΗ-b/Ig гібриду являють карбонільній частині (а не йде за нею). [Див., засобою «ΙΦΗ-b/Fc гібрид», який є білком, що вклюзвичай, Goodman, Μ. and Chorev, M. Accounts of чає частину ΙΦΗ-b, сполучену з щонайменше часChem. Res. 1979, 12, 423]. Описана тут зворотна тиною константної ділянки імуноглобуліну. Переорієнтація пептидів включає (а) таку, коли один важний гібрид Fc включає частину ΙΦΗ-b, або більше амінокінцевих залишків переведений в сполучену з фрагментом антитіла, що містить Сзворотну ("rev") орієнтацію (з отриманням, таким кінцевий домен важких ланцюгів імуноглобуліну. чином, другого «карбоксильного кінця» в самому Відповідно, в одному здійсненні гібридний білівому положенні молекули), і (b) таку, коли один лок має загальну формулу Χ-Υ-Ζ, де X являє соабо більше карбоксильних кінцевих залишків пебою поліпептид, що має амінокислотну послідовреведений в зворотну ("rev") орієнтацію (з отриність ΙΦΗ-b або її частину чи варіант; Υ являє манням другого «амінокінця» в самому правому собою необов'язковий лінкерний залишок, Ζ являє положенні молекули). Пептидний (амідний) зв'язок собою поліпептид, що включає щонайменше часне може бути утворений на межі між залишком з тину поліпептиду, відмінну від частини X інтерфенормальною орієнтацією та залишком зі зворотрону бета. В інших здійсненнях гібридний білок ною орієнтацією. Отже, певні зворотні поліпептиди має загальну формулу Ζ-Υ-Χ, в якій поліпептид, винаходу можуть бути утворені за допомогою защо не є ΙΦΗ-b, сполучений з N-кінцевою частиною стосування відповідного компонента у вигляді амілінкера, який сполучений з N-кінцевою частиною нокислотного міметика для зв'язку двох сусідніх поліпептиду ΙΦΗ-b або його частиною чи варіанчастин послідовностей, що використовують зворотом. Частина Ζ може бути частиною поліпептиду, тний пептидний (амідний) зв'язок. У випадку (а), який містить імуноглобуліноподібні домени. Припредставленому вище, центральний залишок диклади таких інших поліпептидів включають GD1, кетосполуки може бути легко застосований для CD2, CD4 і члени класу І та класу II антигенів гозв'язку структур з двома амідними зв'язками з доловного комплексу гістосумісності. Див. патент сягненням структури пептидоміметика. У випадку США 5565335 [Capon et al.] для прикладів таких (b), представленому вище, центральний залишок поліпептидів. діаміносполуки буде також придатний для зв'язку Частина Ζ може включати, наприклад, безліч структур з двома амідними зв'язками з утворенням гістидинових залишків або переважно Fc ділянку структури пептидоміметика. Зворотний напрям імуноглобуліну, "Fc" визначається тут як фрагмент зв'язків в таких поліпептидах повинен зазвичай антитіла, що містить С-кінцевий домен важких ладодатково вимагати інверсії енантіомерної конфінцюгів імуноглобуліну. гурації зворотних амінокислотних залишків для Частина Υ може бути будь-яким лінкером, який підтримки просторової орієнтації бічних ланцюгів, дозволяє частині ΙΦΗ-b зберігати свою біологічну яка схожа з такою не зворотного пептиду. Конфігуактивність. Частина Υ може бути довжиною в одну рація амінокислот в зворотному положенні пептиамінокислоту або щонайменше в дві амінокислоти. дів являє собою переважно (D), і конфігурація не Υ може також складати від приблизно 2 до призворотного положення являє собою переважно (L). близно 5 амінокислот; від приблизно 3 до приблиПротилежні або змішані конфігурації прийнятні, зно 10 амінокислот в довжину або 10 чи більше коли підходять для оптимізації зв'язувальної актиамінокислот. У переважному здійсненні Υ складавності. Модифікації поліпептидів додатково описається з або включає GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID NO: ні, наприклад, в патенті США №6399075. 6), яка кодується, наприклад, нуклеотидною посліТерапевтичні агенти ΙΦΗ-b включають також довністю GGCGGTGGTGGCAGC (SEQ ID NO: 5). Υ білки ΙΦΗ-b і їх варіанти (наприклад, зрілий білок), може також складатися з або включати сайт впізсполучені з гетерологічним пептидом. Гетерологінавання ентерокіназою, наприклад, чний пептид може бути доданий, наприклад, з меAspAspAspAspLys (SEQ ID NO: 8), який кодується, тою збільшення напівперіоду життя білка ΙΦΗ-b наприклад, GACGATGATGACAAG (SEQ ID NO: 7). або поліпшення його продукції. Приклади гетероВ іншому здійсненні Υ складається з або включає логічних пептидів включають молекули імуноглоSerSerGlyAspAspAspAspLys (SEQ ID NO: 10), яка булінів (Ig) або їх частини, наприклад, константний кодується, наприклад, домен легкого або важкого ланцюга молекули Ig. В AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID одному здійсненні білок ΙΦΗ-b або його варіант NO: 9). приєднують (або іншим чином з'єднують) до всієї Крім того, на з'єднання між частиною ΙΦΗ-b (X) або частини шарнірної та константної ділянок легта іншою не-ΙΦΗ-b частиною Ζ (наприклад, ділянкого ланцюга імуноглобуліну, важкого ланцюга або кою Fc імуноглобуліну) можна також вплинути за до обох. Таким чином, в даному винаході охаракдопомогою будь-якої хімічної реакції, яка повинна теризована молекула, яка включає: (1) частину зв'язувати дві молекули разом так, щоб частини X і білка ΙΦΗ-b (тобто ΙΦΗ-b або його варіант), (2) друΖ зберігали свою відповідну активність. Дане хімігий пептид, наприклад, такий, який збільшує розчне зв'язування може включати багато хімічних чинність або тривалість життя in vivo частини ΙΦΗ 17 88440 18 Cold Spring Harbor, N.Y.] або одержані з клонів, що механізмів, таких, як ковалентне зв'язування, знаходяться у відкритому доступі. Способи отриафінне зв'язування, інтеркалювання, кординаційне мання генів, які кодують константні ділянки важкозв'язування та комплексування. Приклади з'єднуго і легкого ланцюгів імуноглобулінів вказані, навальних агентів (тобто лінкерів "Υ" у загальній фоприклад, Robinson, R. et al., заявка РСТ, публікація рмулі) для створення ковалентного зв'язування №W087/02671. Послідовність кДНК, що кодує моміж частиною ΙΦΗ-b та частиною Ζ можуть вклюлекулу або фрагмент інтерферону, може бути чати органічні сполуки, такі як тіоефіри, карбодііміпрямо сполучена з кДНК, що кодує константні діди, сукцинімідні ефіри, діізоціанати, такі як толілянки важких ланцюгів Ig, або може бути приєднален-2,6-діізоціанат, глутеральдегіди, діазобензоли на через лінкерну послідовність. У додаткових та гексаметилендіаміни, такі як біс-(п-діазонійздійсненнях винаходу може бути створена систебензоїл)-етилендиамін, біфункціональні похідні ма рекомбінантних векторів для адаптації послідоімідоефірів, такі як диметиладипімідат, та бісвностей, що кодують інтерферон бета, до правиактивні сполуки фтору, такі як 1,5-дифтор-2,4льної рамки зчитування з синтетичною шарнірною динітробензол. Даний перелік не розглядається як ділянкою. Додатково може бути бажано включити вичерпний для різних класів хімічних приєднувау вигляді частини рекомбінантної векторної систельних агентів, відомих в даній галузі техніки. Багами нуклеїнові кислоти, які відповідають 3'то з них є в продажу, такі як N-сукцинімідил-3-(2фланкуючій ділянці гена імуноглобуліну, включаюпіриділдитіо)пропіонат (SPDP), 1-етил-3-(3чи сайти розщеплення РНК/поліаденілування та диметиламінопропіл)карбодііміду гідрохлорид нижчевикладені послідовності. Більш того, може (EDC); 4-сукцинімідилоксикарбоніл-альфа-мети)бути бажано сконструювати сигнальну послідовтолуол (SMPT: Pierce Chem. Co., Cat. # 21558G). ність, вищу за послідовності, що кодують імуноПереважний гібридний білок ΙΦΗ-b /Ig складаглобуліновий гібридний білок, для полегшення ється з або включає SEQ ID NO: 12, яка містить секреції гібридної молекули з клітини, трансфорповнорозмірну зрілу форму ΙΦΗ-b людини, тобто мованої рекомбінантним вектором. SEQ ID NO: 4, сполучену з IgGlFc людини (ZL5107) У даному винаході пропонуються димерні гіб[див. WO 00/23472 і USSN 09/832659] (див. Фіг.1). ридні молекули, а також мономерні або мультимеВідповідна нуклеотидна послідовність представрні молекули, що включають гібридні білки. Такі лена в SEQ ID NO: 11. ДНК, що кодує ΙΦΗ-b людимультимери можуть бути створені із застосуванни, закінчується нуклеотидним триплетом 568-570 ням ділянок Fc або їх частин, молекул Ig, які за(ААС, що кодує аргінін), і ДНК, що кодує константзвичай мультивалентні, таких як пентамери IgM ну ділянку IgGl людини, починається з триплету або димери IgA. Зрозуміло, що для утворення та (GAC, що кодує аспарагінову кислоту), який почистабілізації пентамерів IgM і димерів IgA може бунається з нуклеотидного номеру 574 SEQ ID NO: ти необхідний ланцюг J поліпептиду. Альтернати11. вно, мультимери гібридних білків ΙΦΗ-b можуть Інший переважний гібридний білок ΙΦΗ-b/Ig бути утворені із застосуванням білка з афінністю представлений в SEQ ID NO: 14 і кодується SEQ до ділянки Fc молекул Ig, такого як протеїн А. НаID NO: 13 [див. WO 00/23472 і USSN 09/832659]. приклад, безліч гібридних білків ΙΦΗДаний останній гібридний білок складається з ΙΦΗb/імуноглобулін може бути приєднано до кульок b людини, сполученого з лінкером G4S, який сам протеїн А-агарози. сполучений з IgGlFc людини (ZL6206). Лінкер G4S Дані полівалентні форми корисні, оскільки во(що кодується нуклеотидами з 571 по 585 SEQ ID ни містять безліч інтерферон-зв'язувальних сайтів NO: 7) складається з амінокислотної послідовності для рецептора. Наприклад, двовалентний розчинGGGGS (SEQ ID NO: 9). Способи отримання даних ний ΙΦΗ-b може складатися з двох тандемних побілків описані в WO 00/23472 і USSN 09/832659. вторів амінокислот з 1 по 166 SEQ ID NO: 4 (або У переважному здійсненні поліпептид ΙΦΗ-b таких, що кодуються нуклеїновими кислотами під з'єднують через його С-кінець з щонайменше часномерами з 1 по 498 SEQ ID NO: 3) (частина X в тиною ділянки Fc імуноглобуліну. ΙΦΗ-b утворює загальній формулі), розділених лінкерною ділянамінокінцеву частину, а ділянку Fc утворює карбокою (частина Y), повтори зв'язані щонайменше з ксикінцеву частину. У даних гібридних білках ділячастиною константного домену імуноглобуліну нка Fc переважно обмежена шарнірною ділянкою (частина Z). Можуть бути також сконструйовані константного домену та доменами СН2 і СН3. Діальтернативні полівалентні форми, наприклад, за лянка Fc в даних гібридах може бути також обмедопомогою хімічного приєднання гібридів ΙΦΗ-b/Ig жена частиною шарнірної ділянки, причому частидо будь-якої клінічно прийнятної молекули-носія, на здатна утворювати міжмолекулярні дисульфідні полімеру, вибраного з групи, що складається з місточки, і доменами СН2 і CH3 або їх функціонафіколу, поліетиленгліколю або декстрану із застольними еквівалентами. Дані константні ділянки суванням загальноприйнятих способів приєднанможуть походити від будь-якого виду ссавців (пеня. Альтернативно, ΙΦΗ-b може бути хімічно приреважно людини) і можуть походити від будь-якого єднаний до біотину, і потім біотин-інтерферон відповідного класу і/або ізотипу, включаючи IgA, бета-Fc кон'югату дають зв'язатися з авідином, що IgD, IgM, IgE та IgGl, IgG2, IgG3 і IgG4. дає чотирьохвалентні молекули авіРекомбінантні молекули нуклеїнових кислот, дин/біотин/інтерферон бета. Гібриди ΙΦΗ-b/Ig моякі кодують гібриди Ig, можуть бути одержані будьжуть бути також ковалентно приєднані до динітяким способом, відомим в даній галузі техніки рофенолу (DNP) або тринітрофенолу (ΤΝΡ), і [Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A одержаний кон'югат осаджений анти-DNP- або Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, анти-TNP-IgM з утворенням декамерних кон'югатів 19 88440 20 з валентністю 10 для зв'язувальних сайтів рецепВ одному здійсненні білок ΙΦΗ-b або його варіторів інтерферону бета. ант з'єднують на Ν- або С-кінці з одним з наступПохідні білків винаходу також включають різні них пептидів: HisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO: 16), структурні форми первинного білка, які зберігають який може кодуватися нуклеотидною послідовнісбіологічну активність. Завдяки присутності амінотю САТСАТСАТСАТСАТСАТ (SEQ ID NO: 15); та карбоксильних груп, що іонізуються, наприклад, SerGlyGlyHisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO: 18), який білки ΙΦΗ-b та їх варіанти можуть бути у формі може кодуватися нуклеотидною послідовністю солей кислоти або основи, або можуть бути в нейTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT (SEQ тральній формі. Індивідуальні амінокислотні залиID NO: 15) і шки можна також модифікувати за допомогою окиSerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspA слення або відновлення. Крім, того, первинну spAspLys (SEQ ID NO: 20), який може кодуватися амінокислотну структуру (включаючи Ν- і/або Снуклеотидною послідовністю TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT кінцеві частини) або глікан ΙΦΗ-b можна модифікуCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID NO: 19). вати («дериватизувати») за допомогою утворення Амінокислотна послідовність інтерферону бековалентних або агрегатних кон'югатів з іншими та може бути також приєднана до пептиду хімічними частинами, такими як глікозильні групи, AspTyrLysAspAspAspAspLys (DYKDDDDK) (SEQ ID полімери поліалкіленгліколю, такі як поліетиленгNO: 21) [Норр et al., Bio/Technology 6:1204, 1988]. ліколь, ліпіди, фосфат, ацетильні групи тощо, або Остання послідовність є високо антигенною і заза допомогою створення мутантних амінокислотбезпечує епітопом, що оборотно зв'язується спених послідовностей. цифічним моноклональним антитілом, дозволяючи Інші похідні інтерферону бета/Ig включають швидко тестувати і легко очищувати рекомбінантковалентні або агрегатні кон'югати інтерферону ний білок, що експресується. Дана послідовність бета або його фрагментів з іншими білками або також специфічно розщеплюється ентерокіназою поліпептидами, такими як додаткові N-кінці або Сслизової бика по залишку, який іде одразу після кінці, одержані за допомогою синтезу в рекомбінапари Asp-Lys. нтній культурі. Наприклад, кон'югований пептид В іншому здійсненні терапевтичний агент ΙΦΗможе бути сигнальною (або лідируючою) поліпепb включає білок ΙΦΗ-b або його варіант, сполучетидною послідовністю N-кінцевої ділянки білка, який котрансляційно або постгрансляійно направний з білком альбуміном, його варіантом або часляє перенесення білка з місця його синтезу до тиною. Такий гібридний білок може бути створемісця його функції всередині або зовні клітинної ний, [як описано, наприклад, в WO 01/77137]. мембрани чи стінки (наприклад, дріжджовий лідерТерапевтичний агент ΙΦΗ-b може також вклюальфа-фактор). Наприклад, сигнальний пептид чати молекулу, яка не є поліпептидом. Наприклад, може бути від ΙΦΗ-b, тобто амінокислоти з 1 по 21 білок ΙΦΗ-b або його варіант можуть бути приєдSEQ ID NO: 2, які відповідають нуклеотидам 1-138 нані ковалентно або не ковалентно до полімеру, SEQ ID NO: 1. Сигнальний пептид може бути танаприклад, полімеру, який біодеградується. Накож від VCAM, тобто амінокислоти 1-24 SEQ ID приклад, білок ΙΦΗ-b або його варіант можуть бути NO: 12, які кодуються нуклеотидами 1-72 SEQ ID пегильовані, наприклад, приєднані до поліетиленNO: 11. гліколю (ПЕГ), [як описано в WO 00/23114]. Гетерологічний поліпептид (наприклад, пепВ широких рамках цього винаходу єдина мотид) або інша молекула може також бути викорислекула полімеру може бути застосована для кон'тана як мітка або для допомоги в очищенні тераюгації з ΙΦΗ-b, хоч також передбачається, що мопевтичного агента ΙΦΗ-b. Такі пептиди добре же бути приєднано також більше однієї полімерної відомі в даній галузі техніки. Наприклад, полінукмолекули. Повинно бути зрозуміло, що при кон'юлеотид цього винаходу може бути сполучений в гації полімеру можуть застосовуватися будь-які рамці зчитування з маркерною послідовністю, що групи, частини або інші варіанти кон'югуючих агенпозначається тут також як Tag-sequence («тагтів, які підходять для кінцевого використання при послідовність»), що кодує «таг-пептид», що дозвозастосуванні. Як приклад, в деяких застосуваннях ляє маркувати і/або очищувати поліпептид цього може бути придатне ковалентне прив'язування до винаходу. У переважному здійсненні маркерна полімеру функціональної частини, що надає стійпослідовність являє собою гексагістидиновий таг, кості до УФ-деградації або антиоксидантної, або наприклад, такий, що поставляється вектором такої, що має інші властивості чи характеристики. PQE-9. Є в продажу інші численні таг-пептиди. Інші Як додатковий приклад, в деяких застосуваннях таги, які часто застосовуються, включають епітопи може бути вигідно функціоналізувати полімер, myc [наприклад, див. Ellison et al. (1991) J Biol. додаючи йому реакційної здатності або здатності Chem. 266:21150-21157], які включають послідовдо поперечного зшивання, для підсилення різних ність із 10 залишків від с-myc, систему pFLAG властивостей або характеристик всього кон'югова(International Biotechnologies, Inc.), систему pEZZного матеріалу. Відповідно, полімер може містити протеїн A (Pharmacia, NJ) і частину з 16 амінокисбудь-яку функціональну частину, групи, що повтолот від білка гемаглютиніну Haemophilus influenza. рюються, зв'язки або інші постійні структури, які не Більш того, будь-який пептид може бути викорисперешкоджають ефективності композиції кон'юготаний як таг за умови, що реагент, наприклад, анваного ΙΦΗ-b в призначених для нього цілях. титіло, яке взаємодіє специфічно з тагΙΦΗ-b кон'югують переважно через кінцеву реполіпептидом, є в наявності або може бути одеракційно здатну групу полімеру, хоча кон'югації можане або ідентифіковане. жуть також бути відгалужені від не кінцевих реак 21 88440 22 ційно здатних груп. Полімер з реакційно здатдериватизація ΙΦΗ-b по N-кінцю карбонільною груною(ними) групою(ами) позначають тут як «актипою, що містить полімер. Реакцію проводять при вований полімер». Реакційно здатна група вибіррН, який дозволяє досягнути переваги у відмінносково взаємодіє з вільними аміно- або іншими тях рКа між епсилон-аміногрупами залишків лізину реакційно здатними групами на білкові. Активоваі альфа-аміногрупою N-кінцевого залишку ΙΦΗ-b. ний(і) полімер(и) взаємодіє(ють) так, що приєдДаний тип хімічних перетворень добре відомий нання може здійснюватися до будь-якої доступної фахівцям в даній галузі техніки. аміногрупи ΙΦΗ-b, такої, як альфа-аміногрупи або Наприклад, може бути використана реакційна епсилон-аміногрупи лізинів. Вільні карбоксильні схема, в якій дана вибірність підтримується за догрупи, належним чином активовані карбонільні помогою проведення реакцій при низькому рН (загрупи, гідроксил, гуанідил, окислені вуглеводневі звичай 5-6) за умов, коли полімер ПЕГ-альдегід частини і меркаптогрупи ΙΦΗ-b (якщо вони є довводять в реакцію з ΙΦΗ-b в присутності ціаноборступними) також можуть бути використані як сайти гідриду натрію. Після очищення ΠΕΓ-ΙΦΗ-b і аналіприєднання. зу за допомогою ДДС-Na ПААГЕ, масХоча полімер може бути приєднаний де заспектрометрії MALDI і пептидного секвенуванвгодно на молекулі ΙΦΗ-b або його варіанті, або ня/картування це дає ΙΦΗ-b, чий N-кінець специфіінших амінокислотах, приєднаних прямо або посечно помічений частиною ПЕГ. редньо до молекули ΙΦΗ-b, найбільш переважний Кристалічна структура ΙΦΗ-b вказує на те, що сайт для приєднання полімеру являє собою NΝ- і С-кінці локалізовані близько один до одного кінець молекули ΙΦΗ-b. Вторинний(і) сайт(и) зна[див. Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: ходиться(яться) у або біля С-кінця і приєднані че11813-11818]. Таким чином, модифікації С-кінцевої рез залишки цукрів. Таким чином, винахід охоплює ділянки ΙΦΗ-b також повинні мати мінімальний як свої найбільш переважні здійснення: (і) кон'югаефект на активність. Оскільки не існує простої хіти ΙΦΗ-b або його варіанту, з'єднані з полімером мічної стратегії для цільового приєднання поліалпо N-кінцю; (іі) кон'югати ΙΦΗ-b або його варіанту, кіленгліколевого полімеру, такого як ПЕГ, до Скінця, потрібно вдатися прямо до генної інженерії з'єднані з полімером по С-кінцю; (ііі) з'єднані з цуксайта, який може бути застосований як мішень для рами кон'югати полімерних кон'югатів; (iv) а також полімерної частини. Наприклад, включення Cys в кон'югати білків ΙΦΗ-b або їх варіантів, з'єднані з сайт, який знаходиться у або біля С-кінця, повинно полімером по Ν-, С-кінцях і по цукрах. дозволити створити специфічну модифікацію із Звичайно застосовують від приблизно 1,0 до застосуванням малеїміду, вінілсульфону або галоприблизно 10моль активованого полімеру на моль генцетат-активованого поліалкіленгліколю (наприбілка в залежності від концентрації білка. Кінцева клад, ПЕГ). Дані похідні можуть бути специфічно кількість являє собою баланс між максималізацією застосовані для модифікації сконструйованих цисступеня реакції при мінімалізації неспецифічних теїнів, завдяки високій вибірності даних реагентів модифікацій продукту і при визначенні в той же для Cys. Інші стратегії, такі як включення гістидичас хімічного складу, який повинен підтримувати нового тагу, який може бути мішенню [Fancy et al., оптимальну активність, нарівні з цим при оптимі(1996) Chem. & Biol. 3: 551], або додаткового сайта зації в той же час, якщо це можливо, напівперіоду глікозилювання, являють собою інші альтернативи життя білка. для модифікації С-кінця ΙΦΗ-b. Найкраще, щоб зберігалося щонайменше приблизно 50% біологічної активності білка, і найкраГлікан на певному ΙΦΗ-b знаходиться також в ще, щоб зберігалося 100%. положенні, яке дозволяє зробити додаткову моРеакції можна здійснювати за допомогою дифікацію без зміни активності. Способи цільових будь-якого доцільного методу, що застосовується цукрів як сайтів для хімічної модифікації також для взаємодії біологічно активних матеріалів з добре відомі і, отже, можливо, щоб поліалкіленгліінертними полімерами, переважно приблизно при колевий полімер був доданий прямо і специфічно рН 5-7, якщо реакційно здатні групи знаходяться до цукрів на ΙΦΗ-b, які були активовані окисленна альфа-аміногрупі на N-кінці. Зазвичай процес ням. Наприклад, може бути створений поліетиленвключає одержання активованого полімеру (який гліколь-гідразид, який утворює відносно стабільні може мати щонайменше одну кінцеву гідроксильну гідразонові зв'язки шляхом конденсації з альдегігрупу) і після цього взаємодія білка з активованим дами і кетонами. Дана властивість була викорисполімером для одержання розчинного білка, підтана для модифікації білків через окислені олігоходящого для складу. Модифікації вказаної вище сахаридні зв'язки. [Див. Andresz, H. et al., (1978), реакції можуть бути проведені декількома спосоMakromol. Chem. 179: 301]. Зокрема, обробка ПЕГбами, які можуть включати одну або більше стадій. карбоксиметилгідразиду нітритом дає ПЕГЯк вказувалося вище, в найбільш переважних карбоксиметилазид, який являє собою електрофіздійсненнях винаходу як лінкер до полімеру застольно активну групу, реакційно здатну по відношенсовується N-кінцева ділянка ΙΦΗ-b. Одним ілюстню до аміногруп. Дана реакція може бути викорисративним способом є спосіб відновного алкілувантана також для отримання білків, модифікованих ня, в якому використовується диференційна поліалкіленгліколем. [Див. патенти США 4101380 і реакційна здатність різних типів первинних аміно4179337]. груп (епсилон-аміногруп на лізині в порівнянні з Хімічні модифікації, опосередковані тіоловим аміногрупами N-кінцевого метіоніну), доступних лінкером, можуть додатково сприяти поперечним для дериватизації на ΙΦΗ-b. За відповідних вибірзшивкам білків. Це може бути виконано, наприклад, шляхом створення реакційно здатних альдекових умов може бути досягнута по суті вибіркова 23 88440 24 гідів на вуглеводних частинах за допомогою періго гліцерину являє собою той самий кістяк, що й одату натрію з утворенням цистамінових кон'югаіснуючий в природі, наприклад, у тварин і людини тів через альдегіди і індукцією поперечних зшивок в моно-, ди- і тригліцеридах. Отже, дане розгалучерез тіолові групи на цистамінах [див. Pepinsky, ження не повинне обов'язково розглядатися як В. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249 і чужорідний агент в організмі. Chen, L.L. et al., (1991) J. Bid. Chem., 266: 18237Як альтернатива поліалкіленовим оксидам 18243]. Відповідно, даний тип хімічних перетвоможуть бути застосовані декстран, полівінілпіролірень, як очікується, буде підходити для модифікадони, поліакриламіди, полівінілові спирти, полімеції поліалкіленгліколевими полімерами, коли лінри на основі вуглеводів і тому подібне. Фахівець в кер включається до цукру та поліалкіленгліколевий даній галузі техніки повинен знати, що попередній полімер приєднується до лінкера. Тоді як лінкери, перелік є тільки ілюстративним і що охоплюються що містять амінотіол або гідразин, здатні допускавсі полімерні матеріали, що мають якості, які опити приєднання одиничної полімерної групи, струксуються тут. тура лінкера може варіюватися так, щоб приєднуНеобов'язково, щоб полімер мав якусь конкревалася безліч полімерів і/або щоб просторова тну молекулярну масу, але бажано, щоб молекулярна маса була між приблизно 300 і 100000, краорієнтація полімеру по відношенню до ΙΦΗ-b зміще між 10000 і 40000. Зокрема, розміри 20000 або нювалася. більше є найкращими для запобігання втрати білПриклади полімерів включають розчинний у ка через фільтрацію в нирках. воді полімер, такий як поліалкіленгліколевий поліСтворення похідних поліалкіленгліколей дає мер. Перелік таких полімерів, що не обмежується, ряд вигідних властивостей для складу кон'югатів включає інші поліалкіленоксидні гомополімери, полімер- ΙΦΗ-b при здійсненні даного винаходу, такі як поліпропіленгліколі, поліоксиетиленовані поліоли, їх співполімери та їх блок-співполімери. пов'язаних з наступними властивостями похідних Інші приклади відповідних розчинних у воді і не поліалкіленгліколей: поліпшення розчинності у пептидних полімерних кістяків включають поводі за відсутності в той самий час антигенної або лі(оксиетильований поліол), полі(олефіновий імуногенної відповіді; високий ступінь біосумісносспирт), полі(вінілпіролідон), поті; відсутність біодеградації похідних поліалкіленгліколей in vivo; і вільна екскреція живими організлі(гідроксипропілметакриламід), полі(a-гідрокси мами. кислоту), полівініловий спирт), поліфосфазен, поБільш того, в іншому аспекті винаходу можна ліоксазолін, полі(N-акрилоїлморфолін) і їх співпозастосовувати ΙΦΗ-b, ковалентно зв'язаний з полілімери, триполімери та суміші. В одному здійсненні полімерний кістяк являє собою мерним компонентом, в якому природа кон'югації полі(етиленгліколь) або монометоксиполіетиленгвключає хімічні ковалентні зв'язки, що розщеплюліколь (мПЕГ), що мають середню молекулярну ються. Це дозволяє здійснювати контроль в плані масу від приблизно 200Да до приблизно плину часу, за який полімер може бути відщепле400000Да. Повинно бути зрозуміло, що інші споріний від ΙΦΗ-b. Даний ковалентний зв'язок між ліднені полімери також підходять для застосування ками ΙΦΗ-b і полімером може бути розщеплений при здійсненні даного винаходу і що застосування шляхом хімічної або ферментативної реакції. Протерміну ПЕГ або полі(етиленгліколь) розглядаєтьдукт полімер-ΙΦΗ-b зберігає прийнятний рівень ся як таке, що включає, а не виключає в даному активності. Одночасно частини поліетиленгліколю відношенні. Термін ПЕГ включає поприсутні в кон'югуючому полімері для надання лі(етиленгліколь) в будь-якій з його форм, вклюкон'югату полімер-ΙΦΗ-b високої розчинності у воді чаючи алкоксиПЕГ, біфункціональний ПЕГ, "багаі збільшеної здатності до циркуляції в кровотоку. торукий" ПЕГ, роздвоєний ПЕГ, розгалужений ПЕГ, Внаслідок даних поліпшених характеристик винапідвішений ПЕГ або ПЕГ з деградуючими зв'язкахід охоплює парентеральну, інтраназальну та пеми у ньому. роральну доставку обох активних видів полімеруВ одному здійсненні поліалкіленгліколеві заΙΦΗ-b і, після гідролітичного розщеплення, біодослишки С1-С4 алкілполіалкіленгліколей, переважно тупність ΙΦΗ-b per se при застосуванні in vivo. поліетиленгликолю (ПЕГ), або поВзаємодія полімеру з ΙΦΗ-b для отримання лі(окси)алкіленгліколеві залишки таких гліколей кон'югатів, наприклад, Ν-кінцевих кон'югованих включаються в полімерні системи, що цікавлять. продуктів, може бути легко здійснена із застосуТаким чином, полімер, до якого приєднується біванням широкого спектра реакційних схем. Активлок, може бути гомополімером поліетиленгліколю ність і стабільність кон'югатів ΙΦΗ-b може варіюва(ПЕГ) або являти собою поліоксиетильований потися декількома способами за допомогою ліол, що пропонується у всіх випадках так, що позастосування полімеру з різним розміром молекулімер є розчинним у воді при кімнатній температули. Розчинність кон'югатів може варіюватися шлярі. Необмежуючі приклади таких полімерів хом зміни пропорції та розміру фрагмента полівключають поліалкіленоксидні гомополімері, такі етиленгліколю, включеного в полімерну як ПЕГ або поліпропіленгліколі, поліоксиетильовакомпозицію. ні гліколі, їх співполімері ті їх блок-співполімери, В одному здійсненні кон'югати за даним винаякі пропонуються так, що підтримується розчинходом отримують шляхом взаємодії білка з актиність у воді блоку-співполимеру. Приклади поліовованою поліалкіленгліколевою сполукою (PCG). ксиетильованих поліолів включають, наприклад, Наприклад, ІФН може бути введений в реакцію з поліоксиетильований гліцерин, поліоксиетильоваПЕГ-альдегідом в присутності відновлювального ний сорбіт, поліоксиетильовану глюкозу або тому агента (наприклад, ціаноборгідриду натрію) з одеподібне. Гліцериновий кістяк поліоксиетильовано 25 88440 26 натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, і потім пегильований ржанням через відновне алкілювання кон'югату інтерферон бета елююють з колонки 5мМ фосфаПЕГ-білок, з'єднаних через амінний зв'язок. [Див., том натрію, рН 5,5, 800мМ NaCl. Фракції елюату наприклад, європейський патент 0154316 В1 і міжаналізують на вміст білка за поглинанням при народну патентну заявку № PCT/US03/01559]. 280нм. Концентрацію пегильованого інтерферону В певних здійсненнях винаходи ΙΦΗ-b людини представляють в еквівалентах інтерферону, оскіпегильований з наступними активованими поліалльки частина ПЕГ не дає внеску в поглинання при кіленгліколями: 20кДа мПЕГ-0-2280нм. Даний спосіб та характеристика отриманометилпропіональдегідом, 20кДа мПЕГ-0-пго пегильованого ΙΦΗ-b додатково описані в WO метилфеніл-0-2-метилпропіональдегідом, 20кДа мПЕГ-0-м-метилфеніл-0-200/23114. Кон'югація ПЕГ з ΙΦΗ-b, очевидно, не метилпропіональдегідом, 20кДа мПЕГ-0-пзмінює його противірусної активності. Крім того, фенілацетальдегідом, 20кДа мПЕГ-0-пбуло виявлено, що специфічна активність пегифенілпропіональдегідом і 20кДа мПЕГ-0-мльованого ΙΦΗ-b є більш високою (приблизно в 10 фенілацетальдегідом, з одержанням ΙΦΗ-b, модираз), ніж така сама не пегильованого ΙΦΗ-b [WO фікованого 20кДа мПЕГ-0-200/23114]. метилпропіональдегідом, ΙΦΗ-b, модифікованого ΙΦΗ-b може бути також пегильований части20кДа мПЕГ-0-п-метилфеніл-0-2ною 5К ПЕГ, яку можна придбати, наприклад, у метилпропіональдегідом, ΙΦΗ-b, модифікованого Fluka, Inc. (Cat. №75936, Ronkonkoman, NY), до20кДа мПЕГ-0-м-метилфеніл-0-2тримуючись того самого протоколу, що описаний метилпропіональдегідом, ΙΦΗ-b, модифікованого вище для 20К ПЕГ альдегіду. ΙΦΗ-b, модифікований 20кДа мПЕГ-0-220кДа мПЕГ-0-п-фенілацетальдегідом, ΙΦΗ-b, мометилпропіональдегідом, може бути одержаний дифікованого 20кДа мПЕГ-0-птаким чином. 10мл сипкого проміжного продукту фенілпропіональдегідом, і ΙΦΗ-b, модифікованого ΙΦΗ-b (клінічна партія сипких ліків, яка проходить 20кДа мПЕГ-0-м-фенілацетальдегідом відповідно. всі тести для застосування у людини), 250мкг/мл, в Докладний опис одержання і характеристика люд100мМ фосфату натрію, рН 7,2, 200мМ NaCl, розського ΙΦΗ-b, модифікованого 20кДа мПЕГ-0-2водять 12мл 165мМ MES, рН 5,0, і 50мл 5н HCl. метилпропіональдегідом і 20кДа мПЕГ-0-пЗразок наносять на 300мкл колонку FF SPфенілацетальдегідом, представлено нижче і також Сефарози (Pharmacia). Колонку промивають пропонується в міжнародній патентній заявці No. 3´300мкл 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, 75мМ PCT/US03/01559. NaCl, і білок елююють 5мМ фосфатом натрію, рН В одному здійсненні пегильований ΙΦΗ-b оде5,5, 600мМ NaCl. Фракції елюату аналізують на їх ржують таким чином. ΙΦΗ-b, наприклад, сипкий поглинання при 280нм, і концентрацію ΙΦΗ-b в проміжний продукт ΙΦΗ-b-1а (клінічна партія сипзразках, визначену із застосуванням коефіцієнта ких ліків, яка проходить всі тести для застосування екстинії 1,51 для розчину 1мг/мл. Фракції піка об'у людини) в концентрації 250мкг/мл в 100мМ фосєднують, що дає концентрацію ΙΦΗ-b 3,66мг/мл, фаті натрію, рН 7,2, 200мМ NaCl, розводять рівним яка розводиться потім до 1,2мг/мл водою. об'ємом 100мМ MES, рН 5,0 і рН, доводять до 5,0 До 0,8мл ΙΦΗ-b з розведеного пулу елюату з за допомогою HCl. Зразок наносять на колонку FF SP-Сефарози додають 0,5Μ фосфат натрію, рН SP-СефарозиÒ (Pharmacia, Piscataway, NJ) при 6,0, до 50мМ, ціаноборгідрид натрію (Aldrich) до6мг ΙΦΗ-b/мл смоли. Колонку промивають 5мМ дають до 5мМ і 20кДа мПЕГ-0-2фосфату натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, і продукт метилпропіональдегід додають до 5мг/мл. Зразок елююють 30мМ фосфату натрію, рН 6,0, 600мМ інкубують при кімнатній температурі протягом 16 NaCl. Фракції елюату можуть бути проаналізовані годин у темряві. Пегильований ΙΦΗ-b очищують з на їх величини поглинання при 280нм, і концентреакційної суміші на колонці FF SP-Сефарози, рацію інтерферону в зразках, визначену за погли0,5мл, таким чином: 0,6мл реакційної суміші рознанням із застосуванням коефіцієнта екстинкції водять 2,4мл 20мМ MES, рН 5,0, і наносять на 1,51 для розчину 1мг/мл. колонку SP-Сефарози. Колонку промивають фосДо розчину ΙΦΗ-b 1мг/мл з елюату SP додають фатом натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, і потім Пегильо0,5Μ фосфат натрію, рН 6,0, до 50мМ, ціаноборгіваний ΙΦΗ-b елююють з колонки 25мМ MES, рН дрид натрію (Aldrich, Milwaukee, WI) додають до 6,4, 400мМ NaCl. Пегильований ΙΦΗ-b додатково 5мМ і 20К ПЕГ альдегіду (Shearwater Polymers, очищують на колонці для FPLC Суперози 6 HR Huntsville, AL) додають до 5мг/мл. Зразок інкубу10/30, що ділить за розміром, 5мМ фосфатом нають при кімнатній температурі протягом 20 годин. трію, рН 5,5, 150мМ NaCl як рухома фаза. ШвидПегильований інтерферон очищують від продуктів кість струму крізь колонку, що ділить за розміром реакції за допомогою послідовних хроматографіч(25мл), становить 20мл/годину, і збирають фракції них стадій на колонці для FPLC СуперозиÒ 6 по 0,5мл. Фракції елюату аналізують на вміст білка (Pharmacia), що ділить за розміром, 5мМ фосфаза поглинанням при 280нм, об'єднують і визначатом натрію, рН 5,5, 150мМ NaCl як рухома фаза, і ють концентрацію білка пулу. Концентрацію Пегина SP-СефарозіÒ FF. Використання колонки, що льованого ΙΦΗ-b представляють в еквівалентах ділить за розміром, веде до базисної лінії роздіІФН, оскільки частина ПЕГ не дає внесок в поглилення модифікованого і не модифікованого ΙΦΗ-b. нання при 280нм. Зразки пулу відбирають для Пул елюату з гель-фільтрації, що містить ПЕГаналізу, і частина, що залишилася, може розводиінтерферон бета, розводять 1:1 водою і наносять тися до 30мкг/мл буфером складу, який містить на колонку SP-СефарозиÒ 2мг інтерферону бета/мл смоли. Колонку промивають 5мМ фосфатом 27 88440 28 HSA, аліквотуватися по 0,25мл/флакон і зберігатиприблизно 40 кілодальтон. Інший ΙΦΗ-b, який може ся при -70°С. бути застосований, являє собою фізіологічно актиΙΦΗ-b, модифікований 20кДа мПЕГ-0-пвну композицію інтерферону-бета, що включає фізіологічно активний глікозильований інтерфефенілацетальдегідом, може бути одержаний таким рон-бета, пов'язану на N-кінці з полімером, що чином. 20мл сипкого проміжного продукту ΙΦΗ-b включає поліалкіленгліколеву частину, де фізіоло(клінічна партія сипких ліків, яка проходить всі тесгічно активний інтерферон-бета і поліалкіленглікоти для застосування у людини), 250мкг/мл, в лева частина організовані так, що фізіологічно 100мМ фосфату натрію, рН 7,2, 200мМ NaCl, розактивний інтерферон-бета в фізіологічно активній водять 24мл 165мМ MES, рН 5,0, 100мкл 5н HCl і композиції інтерферону-бета має по суті схожу 24мл води. Зразок наносять на 600мкл колонку FF активність у порівнянні з фізіологічно активним SP-Сефарози (Pharmacia). Колонку промивають інтерфероном-бета, що не має вказаної частини, 2´900мкл 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, 75мМ при тестуванні на противірусну активність. NaCl, і білок елююють 5мМ фосфатом натрію, рН Гетерологічні поліпептиди або інші молекули 5,5, 600мМ NaCl. Фракції елюату аналізують на їх можуть бути ковалентно або нековалентно зв'язані поглинання при 280нм, і концентрацію ΙΦΗ-b в з білком ΙΦΗ-b або його варіантом. «Ковалентно зразках визначають із застосуванням коефіцієнта зв'язані» означає, що різні залишки згідно з винаекстинії 1,51 для розчину 1мг/мл. Фракції піка об'ходом або прямо ковалентно зв'язані один з одєднують, що дає концентрацію ΙΦΗ-b 2,3мг/мл. До ним, або інакше посередньо ковалентно сполучені 1,2мл ΙΦΗ-b-1а з пулу елюату з SP-Сефарози доодин з одним через проміжну частину або частини, дають 0,5Μ фосфат натрію, рН 6,0, до 50мМ, ціатакі як місточок, спейсер або лінкерна частина або ноборгідрид натрію (Aldrich) додають до 5мМ і частини. Проміжна частина або частини називають 20кДа мПЕГ-0-п-фенілацетальдегід додають до «приєднуючою групою». Термін «кон'югований» 10мг/мл. Зразок інкубують при кімнатній темперазастосовують взаємозамінно з «ковалентно зв'ятурі протягом 18 годин в темряві. Пегильований заним». ΙΦΗ-b може бути очищений з реакційної суміші на ΙΦΗ-b для застосування у винаході може бути колонці FF SP-Сефарози, 0,75мл, таким чином: глікозильованим або не глікозильованим (або без 1,5мл реакційної суміші розводять 7,5мл 20мМ глікозилювання). Не глікозильовані ΙΦΗ-b можуть MES, рН 5,0, 7,5мл води і 5мкл 5н HCl і наносять бути одержані, наприклад, в прокаріотичних клітина колонку SP-Сефарози. Колонку промивають нах-хазяїнах. Білки ΙΦΗ-b або їх варіанти також фосфатом натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, і потім пегиможуть бути модифіковані шляхом приєднання льований ΙΦΗ-b елююють з колонки 20мМ MES, рН полісахаридів, які не присутні на ΙΦΗ-b в нормаль6,0, 600мМ NaCl. Пегильований ΙΦΗ-b додатково них умовах. очищують на колонці для FPLC Суперози 6 HR 3. Способи отримання терапевтичних агентів 10/30, що ділить за розміром, 5мМ фосфатом наΙΦΗ-b трію, рН 5,5, 150мМ NaCl як рухома фаза. ШвидТерапевтичні агенти ΙΦΗ-b цього винаходу кість струму через колонку, що ділить за розміром можуть бути одержані будь-якими відповідними (25мл), становить 20мл/годину, і збирають фракції способами, такими як способи, що включають по 0,5мл. Фракції елюату аналізують на вміст білка конструювання нуклеїнової кислоти, що кодує теза поглинанням при 280нм, об'єднують і визначарапевтичний агент ΙΦΗ-b, і експресію даної нуклеїють концентрацію білка пулу. Концентрацію Пегинової кислоти у відповідному трансформованому льованого ΙΦΗ-b представляють в еквівалентах хазяїні. Даний спосіб буде давати рекомбінантні ІФН після врахування внеску ПЕГ (20кДа мПЕГ-0терапевтичні агенти ΙΦΗ-b. Терапевтичні агенти п-фенілацетальдегід має коефіцієнт екстинії при 280нм 0,5 для розчину 1мг/мл) у поглинання при ΙΦΗ-b можуть також бути одержані за допомогою 280 нм із застосуванням коефіцієнта екстинії 2 для хімічного синтезу або поєднання хімічного синтезу і технології рекомбінантної ДНК. розчину Пегильованого ΙΦΗ-b 1мг/мл. Зразки пулу В одному здійсненні нуклеїнову кислоту, що можуть бути відібрані для аналізу, і частина, що залишилася, може розводитися до 30мкг/мл букодує терапевтичний агент ΙΦΗ-b, конструюють фером складу, що містить HSA, аліквотуватися по шляхом виділення або синтезу послідовності ДНК, 0,25мл/флакон і зберігатися при -70°С. що кодує ΙΦΗ-b або його варіант. Наприклад, гібУ способах винаходу може бути застосований ридний білок ΙΦΗ-b може бути одержаний як опиглікозильований ΙΦΗ-b, сполучений з не існуючим сано, наприклад, тут. Існуюча в природі нуклеїнова в природі полімером. Полімер може включати покислота ΙΦΗ-b може бути одержана відповідно до ліалкіленгліколеву частину. Поліалкіленгліколева методів, добре відомих в даній галузі техніки. Начастина може бути приєднана до інтерферонуприклад, нуклеїнова кислота може бути виділена бета за допомогою групи, вибраної з альдегідної за допомогою полімеразної ланцюгової реакції зі групи, малеїмідної групи, вінілсульфонової групи, зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР) із застосувангалогенацетатної групи, безлічі гістидинових заням РНК, одержаною з клітини, відомої як експрелишків, гідразинової групи і амінотіолової групи. суюча ΙΦΗ-b, наприклад, лейкоцита, і праймерів на ΙΦΗ-b може бути приєднаний до поліетиленглікооснові послідовності гена ΙΦΗ-b, наприклад, SEQ левої частини, де ΙΦΗ-b приєднують до поліетилеID NO: 1. Нуклеїнові кислоти, що кодують білки нгліколевої частини за допомогою лабільного зв'яΙΦΗ-b, можуть також бути виділені за допомогою зку, де лабільний зв'язок розщеплюється шляхом скринінгових бібліотек, наприклад, бібліотек кДНК, біохімічного гідролізу і/або протеолізу. Полімер створених від клітин, що експресують ΙΦΗ-b, із може мати молекулярну масу від приблизно 5 до 29 88440 30 зондом, наприклад, олігонуклеотидом, що включає агент ΙΦΗ-b, вставляють в експресійний вектор, в частину послідовності ΙΦΗ-b. якому вона оперативно зв'язана з контролюючою експресію послідовністю, придатною для експресії Альтернативно, може бути використана повна амінокислотна послідовність для конструювання терапевтичного агента ΙΦΗ-b в бажаному трансгена за зворотною трансляцією. Може бути синтеформованому хазяїні. Правильність компонування зований олігомер ДНК, який містить нуклеотидну може бути підтверджена з допомогою секвенуванпослідовність, що кодує терапевтичний агент ΙΦΗня нуклеотидів, рестрикційного картування і експресії біологічно активного поліпептиду у придатb. Наприклад, можна синтезувати декілька невеному хазяїні або клітині-хазяїні. Як добре відомо в ликих олігонуклеотидів, що кодують частини бажаданій галузі техніки, для того, щоб отримати високі ного пептиду, і потім зв'язати їх разом. Індивідуарівні експресії трансфікованого гена в хазяїні або льні нуклеотиди зазвичай містять 5э або 3' клітині-хазяїні, ген повинен бути оперативно зв'явиступаючі кінці для комплементарного об'єднанзаний з послідовностями, що здійснюють експреня. сійний контроль транскрипції і трансляції, які фунЗміни в нуклеїнові кислоти, що кодують білки кціонують в вибраному експресійному хазяїні. ΙΦΗ-b, можуть бути введені способами, добре віВибір послідовності, яка контролює експресію, домими в даній галузі техніки. Наприклад, зміни і експресійного вектора повинен залежати від виможуть бути зроблені з допомогою сайтбору клітини-хазяїна. Може бути застосована шинаправленого мутагенезу, [як описано, наприклад, рока різноманітність поєднань хазяїна експрев Mark et al., "Site-specific Mutagenesis Of The сії/вектора. Придатні експресійні вектори для Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. еукаріотичних хазяїнів, наприклад, еукаріотичних Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984) і в патенті США клітин-хазяїнів, містять, наприклад, вектори, що №4588585]. включають послідовності, контролюючі експресію, Інший спосіб конструювання нуклеїнової кисвід SV40, вірусу папіломи бика, аденовірусу та лоти, що кодує терапевтичний агент ΙΦΗ-b, поляцитомегаловірусу, наприклад, наступні вектори: гає в хімічному синтезі. Наприклад, ген, який кодує вектори, що походять від pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, бажаний терапевтичний агент ΙΦΗ-b, може бути pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, синтезований хімічними способами із застосуванpRSVneo, pMSG, pSVTV, pko-neo і pHyg. Альтерням олігонуклеотидного синтезатора. Такі олігонунативно, похідні вірусів, таких як вірус папіломи клеотиди створюються на основі амінокислотної бика (BPV-1) або вірус Эпштейна-Барра (рНЕВо, послідовності бажаного терапевтичного агента що походять від pREP і р205) можуть бути застоΙΦΗ-b. совані для тимчасової експресії білків в еукаріотиПри виборі нуклеїнової кислоти для експресії в чних клітинах. Різні способи, що застосовуються експресійній системі може бути бажаним відбір тих для отримання плазмід і трансформації організмівкодонів, які сприятливі для клітини-хазяїна або хазяїнів, добре відомі в даній галузі техніки. З приекспресійної системи, в якій рекомбінантний агент воду інших експресійних систем [див. Molecular ΙΦΗ-b буде продукуватися. Відомо, наприклад, що Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by певні кодони експресуються переважно в порівSambrook, Fritisch and Maniatis (Cold Spring Harbor нянні з іншими в прокаріотичних клітинах («переLaboratory Press: 1989) розділи 16 і 17]. вага кодонів»). Придатні для бактерійних хазяїнів експресійні Послідовність ДНК, що кодує терапевтичний вектори включають відомі бактерійні плазміди, такі агент ΙΦΗ-b, може також включати або не включаяк плазміди від Е. coli, включаючи El, pCR1, ти послідовність ДНК, яка кодує сигнальну посліpBR322, рМВ9 і їх похідні, широкий діапазон плаздовність. Така сигнальна послідовність, якщо вона мід хазяїв, таких як RP4, ДНК фагів, наприклад, присутня, повинна бути такою, що розпізнається численні похідні фага лямбда, наприклад, NM989, і клітиною, вибраною для експресії терапевтичного інші ДНК фагів, такі як М13 і односпіральні ДНК агента ΙΦΗ-b. Сигнальна послідовність може бути нитчастих фагів. Придатні експресійні вектори для прокаріотичною, еукаріотичною або поєднанням їх дріжджових клітин включають плазміду 2.mu. і її двох. Сигнальні послідовності добре відомі в даній похідні. Придатні вектори для клітин комах вклюгалузі техніки, і декілька різних представників опичають pVL 941. [Див. також Gate et 1., "Isolation Of сано в даній галузі техніки. Сигнальна послідовThe Bovine And Human Genes For Mullerian ність може бути такою від нативного (тобто існуюInhibiting Substance And Expression Of The Human чого в природі) ΙΦΗ-b. Вмикання сигнальної Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986)]. послідовності залежить від того, чи є бажаним Крім того, будь-яка з широкої різноманітності отримання терапевтичного агента ΙΦΗ-b, що секпослідовностей, які контролюють експресію, може ретується рекомбінантними клітинами, в яких він бути застосована в даних векторах. Такі придатні продукується. Якщо вибрані клітини є прокаріотичпослідовності, що контролюють експресію, вклюними, зазвичай бажано, щоб послідовність ДНК не чають контролюючі експресію послідовності, покодувала сигнальну послідовність. Якщо вибрані в'язані зі структурними генами вказаних вище ексклітини є еукаріотичними, зазвичай переважно, пресійних векторів. Приклади придатних щоб сигнальна послідовність кодувалася, і найпослідовностей, контролюючих експресію, вклюбільш бажано, щоб застосовувалася сигнальна чають, наприклад, ранні і пізні промотори SV40 послідовність ΙΦΗ-b дикого типу. або аденовірусу, систему lac, систему trp, систему Вже скомпоновану (за допомогою синтезу, ТАС або TRC, ділянки головного оператору і просайт-направленого мутагенезу або іншого спосомотору фага лямбда, наприклад, PL, що контробу) нуклеїнову кислоту, що кодує терапевтичний люють ділянки оболонкового білка fd, промотор 3 31 88440 32 фосфогліцераткінази або інших гліколітичних феВ рамках даних параметрів фахівець в даній рментів, промотори кислої фосфатази, наприклад, галузі техніки може обрати різні поєднання вектор/контролююча експресію послідовність/хазяїн, Pho5, промотори a-спряжувальної системи дріжщо призведе до експресії бажаних послідовностей джів і інші послідовності, відомі як такі, що контроДНК при ферментації або в крупномасштабний люють експресію генів прокаріотичних або еукарітваринній культурі, наприклад, із застосуванням отичних клітин, або їх вірусів та їх різні поєднання. клітин СНО або клітин COS. Застосування клітинДля одержання терапевтичних агентів ΙΦΗ-b ної лінії СНО CHO-KUKX-B1 sup для експресії ваможе бути застосований будь-який відповідний ріантів ΙΦΗ-b додатково описане в патенті США хазяїн, включаючи бактерії, гриби (включаючи дрі№6127332. жджі), рослину, комаху, ссавця або інші відповідні Терапевтичний агент ΙΦΗ-b може бути також клітини тварин чи клітинні лінії, а також трансгенні тварини або рослини. Приклади хазяїв включають одержаний в системі in vitro, наприклад, в трансштами Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, ляційний системі in vitro, наприклад, клітинному Streptomyces, гриби, дріжджі, клітини комах, таких лізаті, наприклад, лізаті ретикулоцитів. Термін як Spodoptera fruaiperda (SF9), клітини тварин, такі «трансляційний система in vitro», який застосовуяк клітини яєчників китайського хом'ячка (СНО), і ється тут взаємозамінно з терміном «безклітинна клітини мишей, такі як NS/0, клітини африканської трансляційна система» відноситься до транслязеленої мавпи, такі як COS 1, COS 7, BSC 40 і ВМТ ційний системи, яка являє собою безклітинний 10, і клітини людини, а також клітини рослин в ткаекстракт, що містить щонайменше мінімум елеменинній культурі. Такі клітини можуть бути одержані нтів, необхідних для трансляції молекули РНК в з американської колекції типових культур (АТСС). білок. Трансляційний системи in vitro зазвичай Переважні клітини-хазяї для експресії в клітинах включають макромолекули, такі як ферменти, фатварин включають клітини СНО та клітини COS 7 і ктори трансляції, ініціації та елонгації, хімічні реаособливо клітинну лінію CHO-DDUKY-J31. генти та рибосоми. Наприклад, трансляційний сисПовинно бути, звичайно, зрозуміло, що не всі тема in vitro може включати, щонайменше, вектори і послідовності, що контролюють експрерибосоми, ТРНК, що ініціює метіоніл-TPHКмет, білки сію, будуть функціонувати однаково добре стосовабо комплекси, залучені до трансляції, наприклад, но експресії описаних тут послідовностей ДНК. Не eIF2, eIF3, кеп-зв'язувальний (СВ) комплекс, який всі хазяї функціонують однаково добре з тією ж включає кеп-зв'язувальний білок (СВР) і еукаріотисамою експресійною системою. Однак фахівець в чний фактор ініціації 4F (eIF4F). Безліч трансляційданій галузі техніки може зробити відбір серед них систем in vitro добре відома в даній галузі техданих векторів, послідовностей, що контролюють ніки, і вони включають набори, що є в продажу. експресію, і хазяїв без надмірних експериментів. Приклади трансляційних систем in vitro включають Повинно також розглядатися число копій вектора, еукаріотичні лізати, такі як лізати ретикулоцитів здатність контролювати дане число копій і експрекролика, лізати ооцитів кролика, лізати клітин люсія будь-яких інших білків, що кодуються вектором, дини, лізати клітин комах і екстракти зародків таких як маркери антибіотиків. Наприклад, перепшениці. Лізати є в продажу у виробників, таких як важні вектори для застосування в даному винаході Promega Corp., Madison, Wis,; Stratagene, La Jolla, включають ті, які дозволяють ДНК, що кодує тераCalif.; Amsterdam, Arlington Heights, Ill.; і GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y. РНК для застосупевтичний агент ΙΦΗ-b, ампліфікуватися в ряд ковання в трансляційний системах in vitro може бути пій. Такі вектори, що ампліфікуються, добре відомі одержана in vitro, наприклад, із застосуванням в даній галузі техніки. Вони включають, наприклад, промоторів SP6 або Т7, відповідно до способів, вектори, здатні до ампліфікації з допомогою ампвідомих в даній галузі техніки. ліфікації DHFR [див., наприклад, Kaufman, патент В іншому способі терапевтичний агент ΙΦΗ-b США №4470461, Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: експресується ендогенним геном клітини-хазяїна. Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Даний спосіб може включати введення гетерологіMol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)], або амплфічного промотору вище кодуючої ділянки гена ΙΦΗфікації глутамінсинтетази ("GS") [див., наприклад, b, наприклад, промотору, що індукується, експрепатент США №5122464 і європейську опубліковану сію ендогенного гена ΙΦΗ-b і відкриття ΙΦΗ-b, що заявку 338841]. продукується. Гетерологічний промотор може бути При виборі послідовності, що контролює ексвведений в клітини з допомогою «нокінгу» відповіпресію, повинні бути розглянуті різноманітні факдно до способів, відомих в даній галузі техніки або тори. Вони включають, наприклад, відносну міцальтернативно шляхом введення промотору в ген ність послідовності, її контрольованість і сумісність ΙΦΗ-b. з діючою послідовністю ДНК, що кодує терапевтиТерапевтичний агент ΙΦΗ-b, одержаний за дачний агент ΙΦΗ-b, особливо відносно потенційних ним винаходом, може бути глікозильованим або не вторинних структур. Хазяї повинні бути вибрані глікозильованим в залежності від організму хазяїпри розгляді їх сумісності з вибраним вектором, ну, що застосовується для продукції терапевтичтоксичності продукту, що кодується для послідовного агента. Якщо як хазяїн вибрані бактерії, то ностей ДНК даного винаходу, характеристик їх терапевтичний агент ΙΦΗ-b, що продукується, буде секреції, їх здатності до правильного укладання не глікозильованим. З іншого боку, еукаріотичні білків, вимог до їх ферментації або культивування клітини будуть глікозилювати терапевтичні агенти і легкості очищення продуктів, що кодуються поΙΦΗ-b. слідовностями ДНК. 33 88440 34 0,1; 0,01; 0,001% забруднюючого клітинного матеТерапевтичний агент ΙΦΗ-b, який продукується ріалу. трансформованим хазяїном, може бути очищений Переважні композиції терапевтичного агента відповідно до будь-якого придатного способу. Для ΙΦΗ-b є також по суті вільними від інших клітинних очищення ΙΦΗ-b відомі різні способи. [Див., наприбілків (що також позначаються тут як «забруднююклад, патент США № 4289689, 4359389, 4172071, чі білки»), тобто композиції мають менш ніж при4551271, 5244655, 4485017, 4257938, 4541952 і близно 20% (по сухій масі) забруднюючого білка, і 6127332]. В переважному здійсненні терапевтичпереважно мають менш ніж приблизно 5% забрудний агент ΙΦΗ-b очищують імуноафінним спосонюючого білка. Переважні препарати цільових побом, як описано, [наприклад, в Okamura et al., ліпептидів мають менш ніж приблизно 2% забруд"Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent нюючого білка; навіть більш переважно менш ніж Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid приблизно 1% забруднюючого білка і найбільш Sequence." Biochem., 19, pp. 3831-35 (1980)]. переважно менш ніж приблизно 0,5; 0,2; 0,1; 0,01; Наприклад, білки ΙΦΗ-b і їх варіанти можуть 0,001% забруднюючих білків. бути виділені і очищені відповідно до загальноЧистота і концентрація препаратів ΙΦΗ-b може прийнятих умов, таким як екстракція, преципітація, бути визначена відповідно до способів, відомих в хроматографія, афінна хроматографія, електроданій галузі техніки, наприклад, шляхом гельфорез або тому подібне. Наприклад, білки і фрагелектрофорезу зразків, і, [як описано, наприклад, в менти інтерферону можуть бути очищені шляхом Robert К. Scopes, Protein Purification, Principles and пропускання їх розчину через колонку, що має Practice, Third Ed., Springer Verlag New York, 1993, і іммобілізований на ній рецептор інтерферону [див. посиланнях, що цитуються там]. патент №4725669]. Молекулу інтерферону, що Біологічну активність терапевтичних агентів зв'язалася, можна потім елюювати шляхом обробΙΦΗ-b можна проаналізувати за допомогою будьки хаотропною сіллю або шляхом елюції водним якого відповідного способу, відомого в даній галузі розчином оцтової кислоти. Гібридні білки з імунотехніки, наприклад, за нейтралізацією антитілами глобуліном можуть бути очищені шляхом пропуспротивірусної активності, за індукцією протеїнкінакання розчину, що містить гібридний білок, через зи, за активністю по відношенню до олігоаденілат колонку, яка містить іммобілізований протеїн А або 2,5-А синтетази або фосфодіестерази, наприклад, протеїн G, які селективно зв'язують Fc частину [як описано в патенті ЕР-В1-41313 і WO 00/23472]. гібридного білка. [Див., наприклад, Reis, К. J., et al., Такі тести також включають оцінки імуномодуляJ. Immunol. 132:3098-3102 (1984); заявку PCT торної активності [див., наприклад, патент США W087/00329]. Гібридне антитіло може бути потім №4753795], тести на гальмування росту і вимірюелюйоване шляхом обробки хаотропною сіллю вання зв'язування з клітинами, що експресують або шляхом елюції водним розчином оцтової кисрецептори інтерферону. Приклади противірусних лоти. тестів додатково описані в патенті США 6127332 і Альтернативно, білки інтерферону і гібридні WO 00/23472. молекули з імуноглобуліном можуть бути очищені Здатність терапевтичних агентів ΙΦΗ-b лікувана колонках з антитілами проти інтерферону або ти гломерулонефрит може бути також оцінена на на колонках з антитілами проти імуноглобуліну з тваринних моделях, наприклад, тих, які описані тут одержанням по суті чистого білка. Під терміном далі в прикладах. Тестування може бути проведе«по суті чистий» мається на увазі, що білок вільне, наприклад, як описано в прикладах. ний від забруднень, які зв'язані з ним в природі. Доказом істотної чистоти може бути одна смуга на Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b можуть бути також електрофорезі. придбані комерційно під наступними торговельниΙΦΗ-b, який був одержаний і очищений, може ми марками: AVONEXÒ (ΙΦΗ-b-1a) (Biogen, Inc., бути охарактеризований, наприклад, за допомогою Cambridge, MA); REBIFÒ (ΙΦΗ-b-1a) (Serono, S.A., пептидного картування. Наприклад, зразок тераGeneva, Switzerland); BETAFERONÒ або Bferon певтичного агента ΙΦΗ-b може бути гідролізований (ΙΦΗ-b-1b) (Schering Aktiengesellschaft, Berlin, ендопротеїназою Lys-C і проаналізований на Germany); і BETASERONÒ або Bseron (Berlex, ВЕРХ з оберненою фазою, [як описано, наприMontville, NJ, ΙΦΗ-b-1b). AVONEXÒ і REBIFÒ є реклад, в патенті США №6127332]. комбінантним глікозильованим ΙΦΗ-b людини, що В переважному здійсненні терапевтичний продукується в клітинах яєчника китайського хоагент ΙΦΗ-b є по суті вільним від іншого клітинного м'ячка. BETAFERONÒ і BETASERONÒ продукуютьматеріалу, наприклад, білків. Терміни «очищені ся в бактеріях. препарати терапевтичного агента ΙΦΗ-b» відно4. Способи лікування за допомогою терапевсяться до препаратів терапевтичного агента ΙΦΗтичних агентів ΙΦΗ-b b, що мають менш ніж приблизно 20% (по сухій У винаході пропонуються способи лікування масі) забруднюючого клітинного матеріалу, напригломерулонефриту або хронічної ниркової недоклад, нуклеїнових кислот, білків і ліпідів, і перевастатності у суб'єкта, що має або припускається, що жно таким, що мають менш ніж приблизно 5% замає гломерулонефрит, який розвивається, що бруднюючого клітинного матеріалу. Переважні включають введення суб'єкту терапевтично ефекпрепарати терапевтичного агента ΙΦΗ-b мають тивної кількості терапевтичного агента ΙΦΗ-b. Суменш ніж приблизно 2% забруднюючого клітинного б'єктом може бути суб'єкт з виявленими гломеруматеріалу; навіть більш переважно менш ніж прилонефритом або хронічною нирковою близно 1% забруднюючого клітинного матеріалу і недостатністю. найбільш переважно менш ніж приблизно 0,5; 0,2; 35 88440 36 Гломерулонефрит, що позначається також як фільтрації, спричиняючи тим самим появу деяких «гострий нефрит» або «гострий гломерулонефтипів ниркової недостатності. рит», являє собою гострий, але скороминущий Для опису різних особливостей захворювання запальний процес, який торкається клубочків, що клубочків розроблена традиційна номенклатура. У літературі можуть застосовуватися взаємозамінно призводить до гострих реакцій ШКФ, внаслідок чого виникає дисбаланс рідини і відхилення від захворювання клубочків, гломерулопатія та гломерулонефрит, хоча термін гломерулонефрит норми електролітів. Симптоми гломерулонефриту часто означає запальний процес, як обговорювавключають: протеїнурію; знижену швидкість клубочкової фільтрації (ШКФ); зміни електролітів силося вище. Захворювання клубочків класифікують як первинні, коли патологія виникає в нирках і роватки, включаючи азотемію (уремія, надлишковий азот сечовини в крові - BUN) і затримку солі, звідси викликає системні прояви; захворювання клубочків називають вторинними, коли вони винищо веде до затримки води, яка призводить до гіпертензії та набряку; гематурію і аномальні осади кають внаслідок деякого іншого, мультисистемного розладу. Патологічні особливості, видимі при світсечі, що включають згустки еритроцитів; гіпоальбумінемію; гіперліпідемію; і ліпідурію. ловій мікроскопії, забезпечують додаткову характеристику типу захворювання клубочків. УшкоРяд захворювань, наприклад, зазначених нижче, включають гломерулонефрит. При достатній дження, що торкається частини структури тяжкості гострий гломерулонефрит може викликаклубочків, називають сегментарним, а ушкодження, що торкається майже всієї структури клубочків, ти гостру або таку ниркову недостатність, що швидко розвивається. Гострий гломерулонефрит, асоназивають глобальним. Аномалії, що характеризуються збільшенням кількості клітин в клубочку, ційований з нирковою недостатністю, що швидко розвивається, є звичайним сценарієм, який може називають проліферативними, незалежно від того, чи зумовлено збільшення кількості клітин інфільтбути названий гломерулонефритом, що швидко розвивається через його клінічний прояв. Оскільки рацією лейкоцитів або проліферацією резидентних ушкодження стінки клубочка є постійним фактором клітин клубочків. Клітинну проліферацію, що вклюпри гострому гломерулонефриті, еритроцити і чає клітини капсули Боумена, називають екстракаальбумін зазвичай проникають у простір Боумена і пілярною; проліферацію, що включає ендотеліальні або мезангіальні клітини, називають надходять до сечі. Поєднання наявності еритроциінтракапілярною або ендокапілярною. Скупчення тів в сечі, ниркової недостатності і аномалій гоклітин, що збираються в просторі Боумена, і що меостазу рідини називають нефритичним синдромає серпоподібну форму, називають серпоподібмом. Масивна втрата білків плазми може вести до ною структурою, і зазвичай воно складається з стану, званого нефротичним синдромом, коли втрата білків з сечею веде до порушення білкового проліферувальних парієтальних епітеліальних балансу сироватки, що супроводжується низьким клітин та інфільтрованих моноцитів. Серпоподібрівнем альбуміну в сироватці, аномаліями ліпідів і ний гломерулонефрит являє собою тип гострого набряком. Таким чином, для діагнозу гострого гломерулонефриту, відмінного утворенням серпоподібних структур в клубочках. Оскільки даний гломерулонефриту потрібні лабораторні дані, що стан часто асоційований з швидко прогресуючою свідчать про протеїнурію (альбумінурію) та геманирковою недостатністю, термін серпоподібний турію, зазвичай зі згустками еритроцитів, в той час гломерулонефрит може застосовуватися взаємояк відсутність таких даних вказує на інший діагноз. замінно з швидко прогресуючим гломерулонефриНаприклад, тубулоінтерстиційний нефрит включає том. Якщо захворювання клубочків відрізняється швидкоплинне гостре запалення ниркових канальців і інтерстицію, що не торкається капілярів клупотовщенням базальної мембрани клубочка за бочків. Як і при гострому гломерулонефриті, мають рахунок імунного відкладення, то його називають місце гематурія, згустки еритроцитів і зниження мембранозним. Поєднання вказаних вище термінів ШКФ, але протеїнурія менш виражена і включає застосовують для опису складових частин захворювання клубочків на підставі їх основних патолопереважно низькомолекулярні білки замість альгічних особливостей. Проліферативні гломерулобуміну. патії, які називаються також запальними За синдром гострого гломерулонефриту може гломерулопатіями, включають такі стани, як фокабути відповідальним ряд складових захворювання. Зазвичай для оцінки хворих з гострим гломерулольний проліферативний гломерулонефрит, дифунефритом потрібна ниркова біопсія, незалежно від зний проліферативний гломерулонефрит, мезангіальний проліферативний гломерулонефрит і ступеня та наявності ниркової недостатності. Діагсерпоподібний гломерулонефрит, причому кожний ноз, прогноз і терапія визначаються точними гістологічними та ультраструктурними особливостями, термін передбачає локалізацію і/або тип проліфевиявленими на матеріалі ниркової біопсії. Більш рувальних клітин. Дані стани відрізняються наявнітого, біопсійні тканини можуть бути піддані аналізу стю клітин крові та білків в осаді сечі, але відсутністю втрати білків, яка могла б викликати для визначення типів імунних комплексів, імунонефротичний синдром, так звану «нефритичну» глобулінів і інших речовин, залучених в конкретний гломерулонефрит, причому зазвичай проводять картину. Мембранозні гломерулопатії включають імунофлуоресцентний аналіз. Захворювання, що зміну в клубочковому фільтраційному бар'єрі для білків, що включає базальну мембрану клубочків ушкоджують нирки, можуть бути розділені на категорії відповідно до їх патогенезу, незалежно від та вісцеральні епітеліальні клітини. Дані порушення, включаючи мембранну гломерулопатію, хвотого, чи приводять вони до ушкодження нефрону, достатнього для порушення швидкості клубочкової робу з мінімальною зміною та фокальний і сегментарний гломерулосклероз, ведуть до тяжкої втрати 37 88440 38 білка і можуть призводити до нефротичного синдрювання нирок. Зазвичай є відкладення антитіл в рому. Як передбачається назвою, мембранопроклубочковому пучку, часто аутоантитіл. Механізми ліферативний гломерулонефрит являє собою зміклітинного імунітету, залучені в опосередкований шане захворювання з клінічними особливостями, антитілами гломерулонефрит, додатково модущо передбачають як клітинну проліферацію, так і люють утворення антитіл і індукують залежну від ушкодження бар'єру клубочкової фільтрації. Дані антитіл цитотоксичність. Велика частина гломерузахворювання, відмінні вираженим позасудинним лонефриту у хворих ініціюється взаємодією циркувідкладенням білкової або фібрилярної речовини, люючих антитіл з аутоантигенами. називають хворобами клубочкового відкладення. Антитіла можуть бути виявлені в клубочку як Вони можуть включати як нефритичні, так і нефрорезультат декількох різних процесів. По-перше, тичні компоненти, що, таким чином, перекриваєтьциркулюючі аутоантитіла можуть взаємодіяти з ся з таким, що має місце при проліферативних або внутрішніми аутоантигенами, які є компонентами мембранозних захворюваннях. До останньої катенормального клубочка. По-друге, циркулюючі аугорії захворювань, що торкаються нирок, віднотоантитіла і зовнішні антигенні, які були відкладені сяться тромботичні мікроангіопатії, захворювання, всередині клубочка, можуть забезпечувати утвопри яких згортання відбувається всередині ниркорення in situ клубочкових імунних комплексів. Пової сітки мікросудин. Кожна з даних категорій вотретє, імунні комплекси, утворені в системному лодіє особливим типом етіології. кров'яному руслі, можуть бути захоплені в клубоІснує спектр проліферативних гломерулопатій, чок. Локалізація відкладення антитіл зазвичай в що передбачає те, що різні гістопатологічні особзначній мірі визначає клінічні особливості захволивості виникають внаслідок різних запальних рювання клубочків. Гостре відкладення антитіла в процесів. Наприклад, дифузний проліферативний субендотеліальному просторі або мезангіумі може гломерулонефрит може представляти собою гоствикликати сильну нефритичну відповідь, що відріру імунну відповідь на несподіване потужне надзняється швидким рекрутуванням лейкоцитів і ходження антигену. Серпоподібний гломерулонетромбоцитів з капілярів клубочків. Відкладення фрит може включати менш драматичну імунну антитіл в субепітеліальному просторі зазвичай відповідь на менше надходження антигену у превикликає відповідь нефротичного типу, що відріззентованих індивідуумів. Фокальний проліфератиняється протеїнурією з менш вираженою інфільтвний або мезангіальний проліферативний гломерацією клітин запалення. рулонефрит являють собою останню агресивну Будь-який з даних імунологічних процесів моформу спектра, коли хворі можуть страждати лиже індукувати каскад запальних реакцій в клубочше від повільно прогресуючої ниркової недостатку, що призводять до ушкодження клубочка і поності. дальшого відновлення. Здатність аутоантитіл до Імунофлуоресцентні дослідження біопсійного взаємодії з внутрішніми антигенами або антигенаматеріалу нирок допомагають розрізняти основні ми пересадженого клубочка веде до утворення причини проліферативної гломерулопатії. Існують комплементу, хемоатрактантів, хемокінів і цитокітри широкі діагностичні категорії, кожна з яких понів. Тим самим ініціюються залежні від комплемев'язана з конкретною особливістю відкладення нту і незалежні від комплементу механізми, що імуноглобулінів, що виявляється за імунофлуорепризводять до ушкодження клітин клубочка. В клусценцією в поєднанні з сильною клітинною пролібочок рекрутуються також лейкоцити і тромбоцити, ферацією. Гранулярні відкладення імуноглобуліну викликаючи додаткове ушкодження. Стійке відклавідрізняють першу категорію: імунокомплексний дення імунного комплексу протягом від місяців до гломерулонефрит. Лінійне відкладення імуноглороків може також провокувати значне збільшення буліну вздовж базальної мембрани клубочка відріутворення базальної мембрани. Процес відновзняє другу категорію: хворобу анти-GBM. Мінімалення для будь-якої імунологічної опосередковальне відкладення імуноглобуліну відрізняє третю ної гломерулопатії не може відбутися доти, доки категорію: оліго-імунний гломерулонефрит. Імуноне припиниться локальна імунна активність з прикомплексний гломерулонефрит може являти сопиненням подальшої продукції імунного комплексу бою відповідь на відомий антигенний стимул (наз видаленням відкладених і циркулюючих імунних приклад, постстрептококовий гломерулонефрит) комплексів, із запобіганням подальшого рекрутуабо може утворювати частину мультисистемного вання клітин запалення, з видаленням медіаторів захворювання з імунними комплексами (напризапалення в тканинах нирок та з нормалізацією клад, вовчака, кріоглобулінемії або бактеріального судинного тонусу і адгезивності ендотелію. ендокардиту); в деяких випадках причину не вдаПісля ушкодження клубочка може наступити ється встановити, і захворювання розглядається одужання з рубцюванням. Одужання може бути як ідіопатичне. Хвороба анти-GBM є рідким захвоповним без залишкового ушкодження. Частіше рюванням, при якому утворюються антитіла, що рубцювання клубочка відбувається більш широко з атакують колаген типу IV. У більшості хворих хвопорушенням функції нирок. Було виявлено, що робою анти-GBM є також геморагія легень, стан, трансформуючий фактор росту b (TGF-b), цитокін, який називається синдромом Гудпасчера. Олігоякий сприяє процесу загоєння в клубочках, стимуімунний гломерулонефрит відрізняється аномальлює утворення позаклітинного матриксу і інгібує ним рівнем антитіл в кров'яному руслі проти цитосинтез тканинних протеаз, які руйнують білки матплазми нейтрофілів, що означає деяку дисрегуляриксу, тим самим підсилюючи утворення рубця цію гуморального імунітету. після ушкодження клубочка. Утворення рубця пісІмунологічний опосередкований гломерулоля ушкодження клубочка додатково ушкоджує нефрит становить велику частину набутого захвожиттєздатні нефрони, які залишилися, що веде до 39 88440 40 ну ниркову недостатність або що мають ризик їх прогресуючої втрати нефронів. По мірі втрати нерозвитку (або ризик внаслідок необхідності ниркофронів, що функціонують, нефрони, що залишивої замісної терапії), включають, але не обмежулися їх компенсують, що, як описано вище, являє ються цим, наступних: суб'єкти, яких можна розсобою процес, який руйнує їх самих. Кінцевим реглядати як страждаючих на хронічну ниркову зультатом може бути прогресивне зниження функнедостатність, на кінцеву стадію хвороби нирок, на ції нирок, що завершується хронічною нирковою хронічну діабетичну нефропатію, гіпертензивний недостатністю з її фінальною стадією кінцевої станефросклерозом, хронічний гломерулонефрит, дії хвороби нирок. спадковий нефрит і/або ниркову дисплазію; суб'єкТерапевтичні агенти ΙΦΗ-b можуть бути також ти, що мають протеїнурію, зміни електролітів сизастосовані для лікування фокального гломерулороватки, наприклад, азотемію (уремію, тобто надсклерозу та колапсуючих гломерулопатій, вклюмірний азот сечовини в крові або "BUN"); затримку чаючи ідіопатичні та вторинні форми, зумовлені солі, що призводить до гіпертензії і набряку, гемаінфекцією ВІЛ. Колапсуючий гломерулонефрит турію і аномальні осади сечі, що включають згустявляє собою швидко прогресуюче захворювання, ки еритроцитів; гіпоальбумінемію, гіперліпідемію що веде до ниркової недостатності, для якої немає та ліпідурію; суб'єкти з біопсією, що вказує на гіефективної терапії. Дане захворювання має місце пертрофію клубочків, гіпертрофію канальців, хроголовним чином у хворих на ВІЛ. Оскільки при данічний гломерулосклероз і/або хронічний тубулоінних захворюваннях головну роль відіграє протеїтерстиційний склероз; суб'єкти, що зазнали нурія, очікується, що терапевтичні агенти ΙΦΗ-b, ультразвукового, MRI, CAT сканування або іншого які значно знижують протеїнурію, повинні здійснюнеінвазивного обстеження, вказуючого на нирковати значно поліпшуючий вплив на дані захворювий фіброз або менший у порівнянні з нормою вання. Іншою хворобою, при якій протеїнурія відірозмір нирок. Додаткові вказування на суб'єктів, грає головну роль і при якій, як очікується, що мають гломерулонефрит або ХНН чи ризик їх придатні терапевтичні агенти ΙΦΗ-b, є хвороба з розвитку, добре відомі фахівцям в даній галузі мінімальною зміною, яка називається також нефтехніки. Наприклад, все наступне може служити ропатією з мінімальною зміною (MCN) та нефротикритерієм для визначення того, чи має суб'єкт чним синдромом з мінімальною зміною (MCNS). гломерулонефрит або ХНН чи ризик їх розвитку: Відповідно, терапевтичні агенти ΙΦΗ-b можуть суб'єкти з незвичайною кількістю великих згустків, застосовуватися для лікування станів нирок, пов'ящо знаходяться в осаді сечі; суб'єкти з ШКФ, яка заних із запаленням клубочків, наприклад, будьхронічно становить менш ніж приблизно 50% і яких з наступних станів нирок: фокальний гломеособливо менш ніж приблизно 40%, 30% або 20% рулосклероз та колапсуючі гломерулопатії, хворовід очікуваної ШКФ для суб'єкта; суб'єкти-чоловіки ба з мінімальними змінами, гострий гломерулонез масою щонайменше приблизно 50кг і маючі фрит, серпоподібний гломерулонефрит, ШКФ, яка хронічно становить менш ніж приблизно нефритичний синдром, нефротичний синдром, 50мл/хв і особливо менш ніж приблизно 40мл/хв, первинний гломерулонефрит, вторинний гломеру30мл/хв або 20мл/хв; суб'єкти-жінки з масою щолонефрит, проліферативний гломерулонефрит, найменше приблизно 40кг і маючі ШКФ, яка хронімембранозний гломерулонефрит, мембранопрочно становить менш ніж приблизно 40мл/хв і особліферативний гломерулонефрит, імунокомплексливо менш ніж приблизно 30мл/хв, 20мл/хв або ний гломерулонефрит, гломерулонефрит з антиті10мл/хв; суб'єкти з кількістю функціональних нефлами проти базальної мембрани клубочків (антиронових одиниць, що складає менш ніж приблизно GBM), оліго-імунний гломерулонефрит, діабетична 50% і особливо менш ніж приблизно 40%, 30% або гломерулопатія, хронічний гломерулонефрит і 20% від кількості функціональних нефронових спадковий нефрит. Будь-яке захворювання або одиниць, що є у здорового, але в інших відношенстан, що виникає внаслідок захворювань нирок, нях схожого суб'єкта; суб'єкти, що мають одну ниртаких як хронічна хвороба нирок і хвороба нирок ку; і суб'єкти, що є реципієнтами ниркового транскінцевої стадії, також може лікуватися відповідно плантату. до способів винаходу. Ссавцеві суб'єкти, які можуть зазнавати ліку5. Суб'єкти для лікування вання, включають, але не обмежуються цим, суЗагалом способи цього винаходу можуть бути б'єктів-людей або пацієнтів. Окрім того, винахід застосовані до будь-якого ссавцевого суб'єкту, що може бути застосований для лікування одомашнемає гломерулонефрит, хронічну ниркову недостаних ссавців, які містяться як компаньйони людини тність або такого, що має ризик їх розвитку або (наприклад, собак, кішок, коней), що мають значну ризик в результаті ниркової замісної терапії (тобто комерційну цінність (наприклад, дійні корови, м'ясхронічного діалізу або трансплантації нирки). «Суна велика рогата худоба, спортивні тварини), які б'єктом, що має ризик розвитку гломерулонефриту мають значну наукову цінність (наприклад, понеабо хронічної ниркової недостатності» є суб'єкт, волені або вільні представники вимираючих видів), який, як обґрунтовано очікується, буде страждати або які мають іншу цінність. Суб'єкти для лікування від прогресуючої втрати функції нирок, пов'язаної з не потребують надання показань для лікування прогресуючою втратою функціональних нефронотерапевтичними агентами ΙΦΗ-b, відмінних від вих одиниць. Чи має суб'єкт гломерулонефрит або того показання, яке пов'язане з ризиком гломерухронічну ниркову недостатність або має ризик їх лонефриту, хронічної ниркової недостатності і розвитку, є предметом визначення, яке може бути хвороби нирок кінцевої стадії, наприклад, при незвичайним чином проведене фахівцем у відповідобхідності замісної ниркової терапії. Тобто, очікуній ділянці медичної або ветеринарної техніки. ється, що суб'єкти для лікування в інших відноСуб'єкти, що мають гломерулонефрит або хроніч 41 88440 42 шеннях вільні від показань для лікування терапевники), однак потрібно зазначити, що деякі з них є особливо токсичними для тканин і структур нирок і, тичними агентами ΙΦΗ-b. В деяких випадках, одотже, їх застосування може бути нерозсудливим у нак, можуть існувати суб'єкти з іншими симптомасуб'єктів, що мають гломерулонефрит або хронічми (наприклад, вірусним захворюванням, таким як ну ниркову недостатність чи ризик їх розвитку. Такі інфекція гепатиту), для яких лікування терапевтинеінвазивні способи сканування можуть застосочними агентами ΙΦΗ-b могло б бути показане. У вуватися для визначення таких станів, як нирковий таких випадках лікування повинне бути відповідфіброз або склероз, фокальний нирковий некроз, ним чином адаптоване до того, щоб уникнути надниркові кісти та ниркова масивна гіпертрофія, які мірного дозування. зазвичай є у суб'єкта, що відноситься до категорії Фахівець в галузі медичної або ветеринарної таких, що мають ризик розвитку гломерулонефритехніки навчений розпізнавати суб'єкти, які можуть ту, хронічної ниркової недостатності або ризик мати значний ризик гломерулонефриту, хронічної необхідності замісної ниркової терапії. ниркової недостатності або значний ризик замісної Часто прогноз, діагноз і/або рішення про лікуниркової терапії. Зокрема, клінічні і неклінічні вивання основуються на клінічних показниках функції пробування, а також накопичений досвід, що стонирок. Одним з таких показників служить наявність суються розкритих тут і інших способів лікування, в осаді сечі незвичайної кількості «великих» або як очікується, повинні дати досвідченому професі«пов'язаних з нирковою недостатністю» згустків, оналу інформацію при розв'язанні питання про те, що є указаниям на канальцеву гіпертрофію і печи має даний суб'єкт гломерулонефрит, хронічну редбачає компенсаторну ниркову гіпертрофію, що ниркову недостатність чи ризик їх розвитку або є типовою для хронічної ниркової недостатності. ризик необхідності замісної ниркової терапії, і того, Іншим показником ниркової функції є швидкість чи є будь-яке конкретне лікування найбільш відпоклубочкового потоку (ШКФ), яка може бути вимірявідним потребам суб'єкта, включаючи лікування на прямо шляхом кількісного визначення швидкозгідно з цим винаходом. сті кліренсу конкретних маркерів, або яка може Загалом, ссавцевий суб'єкт може розглядатибути виведена з непрямих вимірювань. ся як такий, що має гломерулонефрит, хронічну Способи лікування згідно з даним винаходом ниркову недостатність чи ризик їх розвитку або не повинні бути обмежені суб'єктами, що мають ризик необхідності замісної ниркової терапії, якщо будь-які конкретні значення ШКФ або будь-якого у даного суб'єкта вже було діагностоване ураженіншого конкретного маркера ниркової функції. Дійня або якщо даного суб'єкта можна було б розглясно, немає необхідності в тому, щоб ШКФ у суб'єкдати як ураженого станом, який зазвичай веде до та або будь-який інший конкретний маркер ниркопрогресуючої втрати функції нирок, пов'язаної з вої функції визначалися до здійснення лікування прогресуючою втратою функціональних нефроновідповідно до даного винаходу. Проте, вимірюванвих одиниць. Такі стани включають, але не обменя ШКФ розглядають як переважний інструмент жуються цим, хворобу нирок кінцевої стадії, хроніоцінки ниркової функції. чну діабетичну нефропатію, діабетичну Як добре відомо в даній галузі техніки, ШКФ гломерулопатію, діабетичну ниркову гіпертрофію, відображає швидкість кліренсу референтної або гіпертензивний нефросклероз, гіпертензивний маркерної сполуки з плазми в сечу. Маркерна спогломерулосклероз, хронічний гломерулонефрит, лука, що розглядається, зазвичай являє собою спадковий нефрит, ниркову дисплазію та хронічне сполуку, яка вільно фільтрується клубочками, але відторгнення після пересадки ниркового алотрансяка не секретується активно або реабсорбується плантату і тому подібне. Дані і інші захворювання і нирковими канальцями і яка не зв'язується в значстани, відомі в даній галузі техніки, зазвичай веній мірі білками в кровоносному руслі. Швидкість дуть до прогресивної втрати функціональних нефкліренсу зазвичай визначають за формулою, ронів та настання хронічної ниркової недостатноспредставленою вище, в якій співвідносять об'єм ті. сечі, утвореної за двадцятичотиригодинний період, Часто фахівець в галузі медицини або ветериі відносні концентрації маркера в сечі і плазмі. Для нарії може обґрунтувати прогноз, діагноз або рібільшої точності ШКФ потрібно також відкоригувашення про лікування на основі обстеження біоти на площу поверхні тіла. Референтною сполукою псійного зразка нирок. Такі біопсії забезпечують «золотого стандарту» служить інсулін завдяки йобагату інформацію, корисну для діагностики заго фільтраційним властивостям та відсутності зв'яхворювань нирок. Суб'єкти, що мають гломерулозування в сироватці. Однак, важко кількісно вимінефрит, хронічну ниркову недостатність чи ризик ряти концентрацію даної сполуки в крові або сечі. їх розвитку або ризик необхідності замісної ниркоТому замість інсуліну часто використовують швидвої терапії, можуть бути виявлені за гістологічними кості кліренсу інших сполук, включаючи креатинін. показаннями на основі ниркових біопсій, включаюКрім того, часто застосовують формули, в яких чи, але не обмежуючись цим, наявність клітин задля спрощення визначення дійсної ШКФ опускапалення, наприклад, Т-клітин та макрофагів, в ють розгляд дійсних концентрацій маркера в сечі, клубочках, клубочкової гіпертрофії, канальцевої дійсних добових, об'ємів утвореної сечі і дійсної гіпертрофії, гломерулосклерозу, тубулоінтерстиплощі поверхні тіла. Дані величини можуть бути ційного склерозу і тому подібного. замінені величинами, основаними на інших фактоМенш інвазивні способи оцінки морфології нирах, базовими величинами, встановленими для рок включають MRI, CAT і ультразвукове' сканутого ж самого суб'єкта, або стандартними величивання. Придатні також способи сканування, при нами для схожих суб'єктів. Дані величини, однак, яких застосовують контрастуючі або формуючі потрібно застосовувати з обережністю, оскільки зображення агенти (наприклад, радіоактивні барв 43 88440 44 вони можуть вести до невиправданих висновків, нефронів, яка складає менш ніж приблизно 40, 30 що ґрунтуються на нирковій функції нормальних або 20% від кількості у схожого, але здорового або здорових суб'єктів. Крім того, для визначення суб'єкта. швидкості ниркового кліренсу застосовують пНарешті, потрібно зазначити, що суб'єкти, які аміногіпурат (РАН). мають одну нирку, незалежно від історії втрати В даній галузі техніки були розроблені різні другої нирки (наприклад, фізичної травми, хірургіспособи і формули, які описують очікувану величного видалення, дефекту при народженні), мочину ШКФ у здорового суб'єкта з певними показнижуть розглядатися як такі, що мають, за відсутнісками. Зокрема, є формули, які дають очікувану тю доказів на користь противного, ризик величину ШКФ на основі рівня креатиніну в плазмі, гломерулонефриту, хронічної ниркової недостатвіку, маси і статі (див., наприклад, розділ «Визнаності або необхідності в замісній нирковій терапії. чення» тут). Звичайно, можуть бути застосовані Це особливо вірно відносно тих суб'єктів, у яких інші формули, і можуть бути створені таблиці стаодна нирка була втрачена через захворювання ндартних величин для суб'єктів даного віку, маси, або стан, який може пошкодити нирку, що залистаті і/або концентрації креатиніну в плазмі. В цей шилася. Схожим чином, суб'єкти, які вже є реципічас в даній галузі техніки доступні також і більш єнтами ниркового трансплантату або які вже занові способи вимірювання або встановлення ШКФ знають хронічного діалізу (наприклад, хронічного (наприклад, із застосуванням способів ЯМР або гемодіалізу або тривалого амбулаторного перитоMRI), і вони можуть бути застосовані згідно з цим неального діалізу), можуть розглядатися як такі, винаходом [див., наприклад, патенти США що мають ризик гломерулонефриту, хронічної ни№5100646 і 5335660]. ркової недостатності або необхідності в подальшій Загалом, незалежно від способу вимірювання замісній нирковій терапії. або встановлення ШКФ, суб'єкт можна розглядати Суб'єкти, які можуть лікуватися згідно зі спосояк такий, що має гломерулонефрит або хронічну бами винаходу, включають також тих, які мають ниркову недостатність чи ризик їх розвитку або стан або захворювання, яке, як відомо, може лікуризик необхідності в замісній нирковій терапії, коли ватися ΙΦΗ-b, наприклад, розсіяний склероз та суб'єкт має ШКФ, яка хронічно становить менш ніж вірусні інфекції. Типові вірусні інфекції включають приблизно 50% від очікуваної ШКФ для даного гепатит, наприклад, інфекції гепатиту В. В таких суб'єкта. При більшому зниженні ШКФ ризик вваситуаціях може бути розроблений режим введення жається великим. Таким чином, суб'єкт розглядатерапевтичного агента ΙΦΗ-b, адаптований для ють як такий, що має зростаючий ризик, якщо сулікування обох станів. Суб'єктами можуть бути б'єкт має ШКФ, яка хронічно становить менш ніж також суб'єкти, в яких немає вірусної інфекції, яку приблизно 40%, 30% або 20% від очікуваної ШКФ. можна лікувати ΙΦΗ-b, або вірусної інфекції, що Суб'єкт-чоловік з масою щонайменше приблизно викликає гломерулонефрит. Відповідно, типові 50кг може розглядатися як такий, що має гломеруприклади суб'єктів включають ті, які не є носіями лонефрит або хронічну ниркову недостатність чи вірусу гепатиту, наприклад, вірусу гепатиту В або ризик їх розвитку або ризик необхідності в замісній С, або ті, у яких гломерулонефрит не був викликанирковій терапії, якщо суб'єкт має ШКФ, яка хроніний вірусом гепатиту, наприклад, вірусом гепатиту чно становить менш ніж приблизно 50мл/хв. При В або С Альтернативно, суб'єктом може бути табільшому зниженні ШКФ ризик вважається великож суб'єкт, що має гломерулонефрит або що має ким. Таким чином, суб'єкт розглядають як такий, ймовірність його розвитку, викликаний вірусною що має зростаючий ризик, якщо суб'єкт має ШКФ, інфекцією. В інших здійсненнях у суб'єкта немає яка хронічно становить менш ніж приблизно 40, 30 ниркової недостатності кінцевої стадії або ниркоабо 20мл/хв. Суб'єкт-жінка з масою щонайменше во-клітинної карциноми. приблизно 40кг може розглядатися як такий, що 6. Склади та способи лікування має гломерулонефрит або хронічну ниркову недоТерапевтичні агенти ΙΦΗ-b можуть вводитися статність чи ризик їх розвитку або ризик необхідбудь-яким шляхом, який є сумісним з конкретним ності в замісній нирковій терапії, якщо суб'єкт має терапевтичним агентом, що застосовується для ШКФ, яка хронічно становить менш ніж приблизно нирок. Так, придатним може бути пероральне або 40мл/хв. При більшому зниженні ШКФ ризик ввапарентеральне введення, включаючи внутрішньожається великим. Таким чином, суб'єкт розглядавенний, внутрішньочеревинний або внутрішньокають як такий, що має зростаючий ризик, якщо супсульний нирковий шляхи введення. Крім того, б'єкт має ШКФ, яка хронічно становить менш ніж введення може проводитися шляхом періодичних приблизно 30, 20 або 10мл/хв. Загалом, суб'єкт ін'єкцій болюсу агента (агентів), описаних тут (тобможе розглядатися як такий, що має гломерулото терапевтичних агентів ΙΦΗ-b, або проводитися нефрит або хронічну ниркову недостатність чи їх більш тривало шляхом внутрішньовенного або ризик або ризик необхідності в замісній нирковій внутрішньочеревинного введення з резервуара, терапії, якщо у суб'єкта кількість функціональних який є зовнішнім (наприклад, в. в. мішок) або внутнефронових одиниць складає менш ніж приблизно рішнім (наприклад, біоеродований імплантат або 50% від кількості функціональних нефронових імплантований насос). У способі згідно з винахоодиниць, яка є у здорового, але в інших відношендом терапевтичні агенти ΙΦΗ-b переважно вводять нях схожого суб'єкта. Як вказано вище, ризик ввапарентерально. Термін «парентеральний», що жається великим по мірі подальшого зниження застосовується тут, включає аерозольний, підшкікількості функціональних нефронів. Таким чином, рний, внутрішньовенний, внутрішньом'язовий, внусуб'єкт розглядають як такий, що має зростаючий трішньосуглобовий, внутрішньосиновіальний, внуризик, якщо суб'єкт має кількість функціональних трішньогрудинний, внутрішньооболонковий, 45 88440 46 внутрішньопечінковий, всередину ушкодження і заміщений пальмітоїльними залишками. ΙΦΗ-bs внутрішньочерепний способи ін'єкції або інфузії. або їх варіанти можуть бути також приєднані до Агенти винаходу можуть вводитися індивідуубілків, таких як, наприклад, рецепторні білки і альму за допомогою будь-яких відповідних засобів, бумін. Більш того, ΙΦΗ-bs або їх варіанти можуть переважно прямо (наприклад, локально, у вигляді бути також приєднані до класу біодеградованих ін'єкції або місцевого нанесення на локус тканині) полімерів, придатних для контрольованого досягабо системно (наприклад, парентерально або пенення вивільнення ліків, наприклад, полімолочної рорально). Коли агент призначений для парентекислоти, поліепсилон-капролактону, полігідроксирального введення, такого як внутрішньовенне, масляної кислоти, поліортоефірів, поліацеталей, підшкірне або внутрішньом'язове введення, агент полідигідропіранів, поліціаноакрилатів та поперепереважно включає частину водного розчину. Розчно-зшитих або амфіпатичних блок-сополімерів чин є фізіологічно прийнятним, так що в доповненгідрогелей. ня до доставки бажаного агента суб'єкту розчин не Згідно з винаходом, фармацевтичні композиції надає в інших відношеннях несприятливої дії на можуть знаходитися в формі стерильного препаелектролітний і/або об'ємний баланс у суб'єкта. рату для ін'єкцій, наприклад, стерильної водної Водне середовище для агента, таким чином, може або маслянистої суспензії для ін'єкцій. Дана сувключати нормальний фізіологічний сольовий розспензія може бути складена згідно зі способами, чин (наприклад, 0,9% NaCl, 0,15Μ, pΗ 7-7,4). відомими в даній галузі техніки, із застосуванням Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b переважно вводять прийнятних диспергуючих або зволожуючих агену вигляді стерильної фармацевтичної композиції, тів та суспендуючих агентів. Стерильний препарат що містить фармацевтично прийнятний носій, який для ін'єкцій може бути також стерильним розчином може бути будь-яким з безлічі добре відомих носіабо суспензією для ін'єкцій в нетоксичному, паренїв, таких як вода, сольовий розчин, забуферений терально прийнятному розріджувачі або розчиннифосфатом сольовий розчин, декстроза, гліцерин, ку, наприклад, у вигляді розчину в 1,3-бутандіолі. етанол і тому подібне, або їх поєднанням. ТерапеСеред прийнятних носіїв і розчинників, які можуть втичні агенти ΙΦΗ-b можуть бути одержані в комбути застосовані, знаходяться вода, розчин Рінгепозиції, що включає один або більше інших білків, ра і ізотонічний розчин хлориду натрію. Крім того, наприклад, для стабілізації терапевтичного агента як розчинник або суспендуюче середовище традиційно застосовують стерильні, тверді масла. Для ΙΦΗ-b. Наприклад, терапевтичні агенти ΙΦΗ-b моданої мети може бути застосоване будь-яке м'яке жуть бути змішані з альбуміном. нелетке масло, включаючи синтетичні моно- або Фармацевтичні композиції можуть включати дигліцериди. Для одержання препаратів для ін'єктерапевтичний агент ΙΦΗ-b разом з будь-яким фацій придатні такі жирні кислоти, як олеїнова кислормацевтично прийнятним носієм. Термін "носій", та і її гліцеридні похідні, а також природні фармащо застосовується тут, включає прийнятні ад'ювацевтично прийнятні масла, такі як оливкова олія нти та розчинники. Фармацевтично прийнятні носії, або касторове масло, особливо в їх поліоксиетиякі можуть застосовуватися в фармацевтичних льованому варіанті. Дані масляні розчини або сукомпозиціях даного винаходу, включають, але не спензії можуть також містити довголанцюговий обмежуються цим, іонообмінники, оксид алюмінію, спиртовий розріджувач або диспергуючий агент. стеарат алюмінію, лецитин, білки сироватки, такі Фармацевтичні композиції, що включають теяк альбумін сироватки людини, буферні речовини, рапевтичні агенти ΙΦΗ-b, можна також вводити такі як фосфати, гліцин, сорбінову кислоту, сорбат перорально. Наприклад, їх можна вводити в будькалію, суміші часткових гліцеридів насичених росякій перорально прийнятній лікарській формі, линних жирних кислот, воду, солі або електроліти, включаючи, але не обмежуючись цим, капсули, такі як протамінсульфат, динатрійфосфат, дикатаблетки, водні суспензії або розчини. У випадку лійфосфат, хлорид натрію, солі цинку, колоїдний таблеток для перорального застосування носії, які оксид кремнію, трисилікат магнію, полівінілпіролізазвичай застосовують, включають лактозу та кудон, речовини на основі целюлози, поліетиленглікурудзяний крохмаль. Зазвичай також додають коль, карбоксиметилцелюлоза натрію, поліакрилазмащувальні агенти, такі як стеарат магнію. Для ти, воски, поліетилен-поліоксипропілен-блокперорального введення у формі капсул прийнятні полімери, поліетиленгліколь та жир вовни. розріджувачі включають лактозу та висушений ΙΦΗ-b або його варіанти можна також вводити кукурудзяний крохмаль. Коли для перорального у формі ліпосомних систем доставки, таких як малі застосування необхідні водні суспензії, активний одношарові пухирці, великі одношарові пухирці та інгредієнт з'єднують з емульгувальними та субагатошарові пухирці. Ліпосоми можуть бути утвоспендуючими агентами. При бажанні, можуть бути рені з безлічі фосфоліпидів, що містять холестетакож додані деякі підсолоджувачі, віддушки або рин, стеариламін або фосфатидилхоліни. У деяких барвники. Можуть застосовуватися також місцеві здійсненнях плівку з ліпідних компонентів гідрують черезшкірні пластири. водним розчином ліків з утворенням ліпідного шаУ переважному здійсненні ΙΦΗ-b або його вару, що заключають ліки в капсулу, [як описано в ріант вводять у вигляді рідкої композиції, що вклюпатенті США №5262564]. чає стабілізуючий агент. Стабілізуючий агент може ΙΦΗ-bs або їх варіанти можуть бути також признаходитися в кількості від 0,3% до 5% від маси єднані до розчинних полімерів як спрямовувані ΙΦΗ-b або його варіанту. Стабілізуючий агент може носії ліків. Такі полімери можуть включати полівіявляти собою амінокислоту, таку як кисла амінокинілпіролідон, пірановий співполімер, полігідроксислота (наприклад, глутамінова кислота і аспарагіпропілметакриламідфенол, полігідроксіетиласпанова кислота), або аргінін або гліцин. Якщо стабінамідфенол або поліетиленоксидполілізин, 47 88440 48 лізуючий агент являє собою аргінін-НСІ, його конриду натрію і 70мМ гліцину; (с) 150мМ аргінін-НСІ і центрація повинна переважно знаходитися в діа15мг/мл альбуміну сироватки людини; (d) 150мМ пазоні від 0,5% (мас/об.) до 5%, і найбільш переаргінін-НСІ і 0,1% Pluronic F-68; (e) 140мМ хлориду важно 3,13% (еквівалентно 150мМ аргінін-НСІ). натрію; (f) 140мМ хлориду натрію і 15мг/мл альбуЯкщо стабілізуючий агент являє собою гліцин, йоміну сироватки людини; і (g) 140мМ хлориду наго концентрація повинна переважно знаходитися в трію і 0,1% Pluronic F-68; діапазоні від 0,5% (мас/об.) до 2,0%, і найбільш (іі) рідина з рН 5,0, яка включає ΙΦΗ-b або його переважно 0,52% (еквівалентно від 66,7мМ до варіант, 170мМ L-глутамінову кислоту і 150мМ 266,4мМ, і найбільш переважно 70мМ). Якщо стагідроксид натрію, рідину, яка переважно раніше не білізуючий агент являє собою глутамінову кислоту, була ліофілізована; і його концентрація повинна переважно знаходити(ііі) 20мМ фосфатний буфер з рН 7,2, причому ся в діапазоні від 100 до 200мМ, і найбільш перебуфер переважно раніше не був ліофілізований, важно 170мМ (що еквівалентно мас/об відсоткам в де буфер включає ΙΦΗ-b і щонайменше один інгдіапазоні від 1,47% до 2,94%, і найбільш переважредієнта, вибраному з: (а) 140мМ аргінін-НСІ і (b) но 2,5% мас/об.). Переважний діапазон концент100мМ хлориду натрію і 70мМ гліцину. рацій ΙΦΗ-b або його варіанту в рідких складах Переважні композиції також включають поліскладає від приблизно 30мкг/мл до приблизно сорбат, наприклад, 0,005% полісорбат 20. 250мкг/мл. Переважний діапазон концентрацій ΙΦΗ-b можуть бути складені у формі сухого складає від 48 до 78мкг/мл, і найбільш переважпорошку, який може бути, але може і не бути соною концентрацією є приблизно 69мкг/кг. У термілюбілізований або суспендований перед введеннах Міжнародних Стандартних величин внутрішній ням суб'єкту. Зокрема, було показано, що ΙΦΗ-bs, стандарт Biogen був стандартизований по відноприєднані до полімеру, наприклад, ПЕГ, особливо шенню до Міжнародного Стандарту WHO для інстабільні в сухій формі [див., наприклад, WO терферону, Природний #Gb-23-902-531, так що 00/23114 і PCT/US/95/06008]. діапазон концентрацій в IU (для 0,5мл об'єму для Фармацевтичні композиції даного винаходу ін'єкції) складає від приблизно 6 IMU до 50 IMU, і можуть також вводитися за допомогою назального найбільш переважна концентрація дорівнює 12 аерозолю або інгаляції із застосуванням розпилюIMU. вача, інгалятора сухого порошку або інгалятора з Переважно, щоб амінокислотним стабілізуюдозою, що відмірюється. Такі композиції одержучим агентом був аргінін, який включають в його ють згідно зі способами, добре відомими в галузі кислотній формі (аргінін-НСІ) в розчинах з рН притехніки фармацевтичних складів, і можуть бути близно 5,0. Відповідно, переважними є полііонні одержані у вигляді розчинів в сольовому розчині із наповнювачі. Переважно, щоб рідка композиція застосуванням бензилового спирту або інших признаходилася в посудині, наприклад, шприці, в якойнятних консервантів, стимуляторів абсорбції для му посудина має поверхню, що знаходиться в конпідвищення біологічної доступності, фторвуглеців такті з рідиною, яка покрита речовиною, інертною і/або інших традиційних солюбілізуючих або диспо відношенню до ΙΦΗ-b, наприклад, силіконом пергуючих агентів. Згідно з іншим здійсненням, або політетрафторетиленом. Ще більш переважні композиції, що містять сполуки даного винаходу, композиції, що мають рН від 4,0 до 7,2. Переважможуть також включати додатковий агент, вибрано, щоб розчин, що включає стабілізуючий агент, ний з групи, що складається з кортикостероїдів, не був ліофілізований і не зазнавав дії газу, що протизапальних агентів, імуносупресорних агентів, містить кисень, під час одержання та зберігання. агентів, що гальмують метаболізм, та імуномодуБуфери органічних кислот та фосфату для заляторів. З'єднання всередині кожного з даних кластосування в даному винаході для підтримки рН в сів можуть бути вибрані з будь-яких, [перелічених діапазоні від приблизно 4,0 до приблизно 7,2 і пеу відповідних групових рубриках в "Comprehensive реважно від приблизно 4,5 до приблизно 5,5 і найMedicinal Chemistry", Pergamon Press, Pxford, pp. більш переважно 5,0, можуть бути традиційними 970,986 (1990), розкриття яких включене тут як буферами органічних кислот та їх солей, такими як посилання]. Конкретними сполуками є теофілін, цитратні буфери (наприклад, сумішшю мононатсульфасалазин та аміносаліцилати (протизапальні рійцитрат-динатрійцитрат, сумішшю лимонна кисагенти); циклоспорин, FK-506 та рапаміцин (імунолота-тринатрійцитрат, сумішшю лимонна кислотасупресорні агенти); циклофосфамід та метотрекмононатрійцитрат тощо), сукцинатні буфери (насат (агенти, що гальмують метаболізм); стероїди приклад, сумішшю бурштинова кислота(для інгаляції, перорального або місцевого застомононатрійсукцинат, сумішшю бурштинова кислосування) та інші інтерферони (імуномодулятори). та-гідроксид натрію, сумішшю бурштинова кислоПридатні для парентерального введення розта-динатрійсукцинат тощо), тартратні буфери, фучини можуть бути одержані будь-якими способами, маратні буфери, глюконатні буфери, оксалатні добре відомими в галузі фармацевтичної техніки, буфери, лактатні буфери, фосфатні буфери і аце[описаними, наприклад, в Remington's татні буфери, [як додатково розкрито в WO Pharmaceutical Sciences (Gennaro, Α., ed), Mack 98/28007]. Pub., 1990]. Типові склади, які можуть бути одержані, [як Парентеральне введення у вигляді ін'єкції заописано в WO 98/38007], включають: звичай застосовують для підшкірних, внутрішньо(і) 20мМ ацетатний буфер з рН 5,0, буфер, м'язових або внутрішньовенних ін'єкцій та інфузій. який переважно раніше не ліофілізували, де буНаприклад, коли застосовують підшкірну ін'єкцію фер включає ΙΦΗ-b і щонайменше один інгредієнт, для доставки 0,01-100мкг/кг, або більш переважно вибраний з (а) 150мМ аргінін-НСІ; (b) 100мМ хло0,01-10мкг/кг ΙΦΗ-b, наприклад, пегильованого 49 88440 50 зазвичай знаходяться в діапазоні між приблизно ΙΦΗ-b, протягом одного тижня можна вводити дві 0,01-100мкг/кг/день перорально, або більш переін'єкції по 0,005-50мкг/кг або більш переважно важно 0,01-10мкг/кг/день перорально. Композиції 0,005-5мкг/кг, відповідно, через 0 та 72 години. переважно пропонуються у формі таблеток з насіКрім того, в одному підході для парентерального чками, що містять 0,5-5000мкг, або більш перевавведення застосовують імплантацію системи з жно 0,5-500мкг активного інгредієнта. Для будьповільним вивільненням або постійним вивільненякого шляху введення можна застосовувати роздіням, яка забезпечує підтримку постійного рівня лені або одиничні дози. Наприклад, сполуки цього дози, [згідно з патентом США №3710795, включевинаходу можна вводити щодня або щотижня в ним тут як посилання]. одиничній дозі, або сумарну дозу можна вводити у Як повинно бути зрозуміло фахівцеві в даній вигляді дози, розділеної на дві, три або чотири галузі техніки, складені композиції містять терапечастини. втично ефективні кількості терапевтичних агентів Будь-яка з приведених вище фармацевтичних ΙΦΗ-b. Тобто, вони містять кількості, які забезпекомпозицій може містити 0,1-99,9%, 1-70% або, чують прийнятні для тканин нирок або інших припереважно, 1-50% активних сполук винаходу як йнятних тканин концентрації терапевтичного агенактивні інгредієнти. та ΙΦΗ-b протягом часу, достатнього для Перебіг хвороби і її відповідь на лікування ліпрофілактики, гальмування, затримки або пом'якками можуть бути відстежені за допомогою клінічшення постійної або прогресуючої втрати функції ного обстеження і лабораторних даних. Ефективнирок, або забезпечують терапевтичну ефективність терапії винаходу визначають за ступенем, в ність іншим чином. Як це повинно бути зрозумілим якому пом'якшуються раніше описані ознаки і симдля фахівця в даній галузі техніки, концентрація птоми стану, наприклад, хронічного гепатиту, і за сполук, описаних в терапевтичній композиції цього ступенем, в якому виключаються або істотно знивинаходу, повинна варіювати в залежності від ряжуються звичайні побічні ефекти інтерферону ду факторів, включаючи біологічну ефективність (тобто схожі з грипом симптоми, такі як лихоманка, вибраного агента, хімічні властивості (наприклад, головний біль, озноб, міалгія, втома тощо, і симпгідрофобність) сполук, що застосовуються, склад томи, пов'язані з центральною нервовою систенаповнювачів для сполуки, шлях введення та пемою, такі як депресія, парестезії, порушена увага редбачуване лікування, включаючи те, чи буде тощо). активний інгредієнт вводитися прямо в нирку або Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b можна вводити ниркову капсулу, або він буде вводитися системно. окремо або в поєднанні з іншими молекулами з Переважна доза для введення, очевидно, також відомою сприятливою дією в лікуванні описаних повинна залежати від таких змінних, як стан ткатут станів, наприклад, протизапальними ліками. нин нирок, міра втрати ниркової функції та загальПри застосуванні в поєднанні з іншими агентами ний стан здоров'я конкретного суб'єкта. Дози можможе виникнути необхідність у відповідній зміні на вводити безперервно або щодня, але в цей час доз терапевтичних агентів ΙΦΗ-b. переважно, щоб дози вводилися один, два або три Кількість активного інгредієнта, яка може бути рази на тиждень стільки часу, скільки продовжусполучена з речовинами-носіями для одержання ється задовільна відповідь (вимірювана, наприодиниці лікарської форми, зазвичай варіює в заклад, за стабілізацією і/або поліпшенням ниркової лежності від хазяїна, що піддається лікуванню і функції за допомогою відповідних медичних покаконкретного способу введення. Потрібно розуміти, зників і/або за показниками якості життя). Можуть однак, що конкретна доза і режим лікування для застосовуватися також менш часті дози, наприкожного конкретного хворого зазвичай залежать клад, щомісячні дози. Для суб'єктів, для яких в від безлічі факторів, включаючи активність конкреінших умовах були б потрібні постійні, двічі або тної сполуки, що застосовується, віку, маси тіла, тричі на тиждень сесії гемодіалізу, постійні, двічі загального стану здоров'я, статі, дієти, часу ввеабо тричі на тиждень внутрішньовенні або внутрідення, швидкості екскреції, поєднання ліків та рішньочеревинні інфузії не можна розглядати як шення лікаря-куратора та тяжкості підлягаючого занадто незручні. Крім того, для полегшення полікуванню конкретного захворювання. Кількість стійних інфузій може бути доцільною імплантація активного інгредієнта може також залежати від напівперманентного стенту (наприклад, внутріштерапевтичного або профілактичного агента, з ньовенного, внутрішньочеревинного або внутрішяким, якщо це має місце, спільно вводять інгредіньокапсулярного). єнт. Режим доз із застосуванням ΙΦΗ-b вибирають Ефективна доза і швидкість введення дози тевідповідно до безлічі чинників, включаючи тип, рапевтичних агентів ΙΦΗ-b зазвичай залежать від вигляд, вік, масу, стать і медичний стан хворого; безлічі факторів, таких як природа інгібітору, розтяжкість підлягаючого лікуванню стану; шлях ввеміри хворого, мета лікування, природа патології, дення; функцію нирок і печінки хворого; конкретну що підлягає лікуванню, конкретна фармацевтична сполуку, що застосовується, або її сіль. Враховукомпозиція та рішення лікаря-куратора. Придатні ють також активність сполук винаходу і чутливість рівні дози між приблизно 0,001 і приблизно хворого до побічних ефектів. Досвідчений лікар 100мг/кг маси тіла в день, переважно між приблизабо ветеринар може легко визначити і прописати но 0,1 і приблизно 50мг/кг маси тіла сполуки актиефективну кількість ліків, що потребується для вного інгредієнта. Найбільш переважно, щоб терапрофілактики, подолання або зупинок прогресупевтичний агент ΙΦΗ-b вводився в дозі між вання стану. Пероральні дози цього винаходу, переважно приблизно 0,1мг/кг маси тіла і приблизно 20мг/кг маси тіла, переважно в діапазоні між приблизно для пегильованих терапевтичних агентів ΙΦΗ-b, 51 88440 52 66мкг/тиждень або 132мкг/тиждень, відповідно) на 1мг/кг маси тіла і приблизно 3мг/кг маси тіла з інтиждень підшкірно. тервалами кожні 1-14 днів. Переважні дози складаються з ін'єкції приблизно 6 MIU на тиждень або У ще одному здійсненні ΙΦΗ-b являє собою тричі на тиждень. Оптимізація дозування може BETASERONÒ (від Berlex), ΙΦΗ-b, що містить мубути визначена, наприклад, шляхом введення тетацію cys-17 замість ser, одержаний в Е. coli. Дарапевтичних агентів ΙΦΗ-b з подальшою оцінкою ний неглікозильований ΙΦΗ-b є менш активним у концентрації терапевтичного агента ΙΦΗ-b в кропорівнянні з AVONEXÒ або REBIFÒ, обидва яких воносному руслі або локально. продукуються в клітинах СНО. Дози продаються у У найбільш переважному здійсненні потребувигляді доз 250мкг (8 MIU) як в ліофілізованих, так ючим цього суб'єктам вводять AVONEXÒ. AVONEX і в рідких складах для підшкірної ін'єкції через кож® є в продажу у вигляді ліофілізованого порошку, ні два дні. Іншим ΙΦΗ-b, що є у продажу, є що складається з наступного: BETAFERONÒ, який можна вводити підшкірно відСклад на 1мл дози: повідно до інструкцій виробника. 30мкг інтерферону-b-1а (6 мільйонів міжнароΙΦΗ-b або його варіант може також вводитися дних одиниць (МIU)) разом з розчинним рецептором ІФН типу І або його 50мМ фосфату натрію частиною, такою як ІФН-зв'язувальний ланцюг ре100мМ хлориду натрію цептора, [як описано, наприклад, в патенті США 15мг альбуміну сироватки людини №6372207]. Як описано в патенті, введення ІФН рН 7,2 типу І в формі комплексу з ІФН-зв'язувальним лаÒ Питома активність AVONEX інтерферону нцюгом рецептора поліпшує стабільність ІФН і становить 2x108одиниць/мг, тобто 200 MU антивізбільшує ефективність ІФН. Комплекс може бути русної активності на міліграм білка ΙΦΗ-b-Ia. Хвонековалентним комплексом або ковалентним комрий додає до порошку стерильну воду перед внутплексом. рішньом'язовою ін'єкцією 1мл один раз на Терапевтичні агенти ΙΦΗ-b можуть бути тестотиждень. AVONEXÒ можна також одержувати у вані на моделях гломерулонефриту у тварин. Мовигляді рідкого складу, що складається з наступноделі гломерулонефриту у ссавців, наприклад, у го: мишей, щурів, морських свинок, кішок, собак, 30мкг ΙΦΗ-b-Ia (б мільйонів міжнародних одиовець, кіз, свиней, корів, коней і відмінних від люниць (MIU)) дини приматів, можуть бути одержані шляхом ін20мМ ацетату (ацетату натрію і оцтової кислодукції прямого або посереднього ушкодження або ти) інсульту тканин нирок тварини. Моделі гломеруло150мМ аргініну HCl нефриту у тварин можуть бути одержані, напри0,005% полісорбату 20 клад, шляхом ін'єкції антитіл проти базальної води для ін'єкцій мембрани клубочків, як у разі тваринної моделі рН4,8 нефротоксичного нефриту (ΝΤΝ) у щурів, описаної Даний склад може бути вміщений в заздалев прикладах. Інші тваринні моделі можуть бути гідь наповнений шприц. Хворий може застосовуодержані шляхом ін'єкції антитіл проти Thy1, як вати шприц або вручну, або за допомогою автоіндодатково описано в прикладах. Ще один тип тважектору. Режим дозування становить 6 MUI (тобто ринних моделей одержують імунізацією аутологіч30мкг) внутрішньом'язово один раз на тиждень. ною базальною мембраною клубочків або одноВ іншому здійсненні ΙΦΗ-b являє собою Rebif, сторонньою обструкцією уретри (UUO). який постачається у вигляді ліофілізованого поТерапевтичні агенти ΙΦΗ-b можна оцінювати рошку і у вигляді рідкого складу. Ліофілізований за їх терапевтичною ефективністю в індукції клініпорошок складається з наступного: чно значущого поліпшення стандартного маркера Склад на дозу 2,0мл: ниркової функції при введенні ссавцевому суб'єкту З МШ ІФН-b-Іа (наприклад, хворій людині), що має ризик розвитку маніт гломерулонефриту або хронічної ниркової недоЛСА статності. Такі маркери ниркової функції добре Ацетат натрію відомі в медичній літературі і включають, але не рН 5,5 обмежуються цим, швидкість підвищення протеїПитома активність Rebif інтерферону станонурії, рівень BUN, швидкість підвищення креатинівить 2,7x108одиниць/мг, тобто 270 MU антивірусну сироватки, статичні вимірювання BUN, статичні ної активності на міліграм білка ΙΦΗ-b-Ia. Хворий вимірювання креатиніну сироватки, швидкість клудодає до порошку розчин хлориду натрію (0,9% бочкової фільтрації (ШКФ), відношення NaCl) перед підшкірною ін'єкцією тричі на тиждень. BUN/креатинін, концентрацію натрію (Na+) в сироСклад рідкого Rebif є наступним: ватці, відношення креатиніну в плазмі/сечі, відно6або 12 МIU ІФН-b-Іа шення сечовини в плазмі/сечі, осмолярність сечі, 4 або 2мг ЛСА добове утворення сечі і тому подібне [див., напри27,3мг маніту клад, Brenner and Lazarus (1994), in Harrison's 0,4мгацетату натрію Principles of internal Medicine, 13th edition]. вода для ін'єкцій Даний винахід додатково ілюструється настуРідкий склад може бути вміщений в заздалепними прикладами, які не треба тлумачити як такі, гідь наповнений шприц і введений із застосуванщо обмежують яким-небудь чином. Зміст всіх циням аутоінжекторного пристрою (Rebiject) або без тованих джерел (включаючи літературні посиланнього 3 рази (6 або 12 МIU, відповідних ня, видані патенти, опубліковані патентні заявки як 53 88440 54 цитовані за допомогою цього заявки) ясно включеданої форми ушкодження нирок, причому надзвині тут як посилання. чайно чутливими є щури Wistra-Kyoto (WKY). Дана При здійсненні цього винаходу зазвичай викотваринна модель додатково описана, [наприклад, ристовують, якщо це не вказано інакше, традиційні в Tarn et al. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. способи клітинної біології, клітинних культур, мо14:1658 і Alien et al. (1999) J. Immunol. 162:5519]. лекулярної біології, трансгенної біології, мікробіоЗастосований в даному дослідженні ΙΦΗ-b явлогії, рекомбінантної ДНК та імунології, які знахоляв собою ΤΦΗ-b щура, що відповідає амінокислодяться в рамках даної ділянки техніки. Такі там 22-184 з GenBank з реєстраційним №Р70499. способи повністю пояснені в літературі. [Див., наΙΦΗ-b експресували в клітинах S-32 яєчників киприклад, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd тайського хом'ячка (СНО), адаптованих до росту в Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold суспензії і таких, що здійснюють секрецію в сереSpring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, довище. Клітини вирощували в середовищі, що Volumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); містить сироватку, в ферментерних культурах. Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed., 1984); Mullis ΙΦΗ-b очищували зі стандартизованого культураet al. U.S. Patent № 4683195; Nucleic Acid льного середовища із застосуванням послідовної Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); хроматографії на Pharmacia SP-сефарозі, блакитTranscription And Translation (B.D. Hames & S.J. ній сефарозі та смолах супероза 12, Biorad BioHiggins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Scale керамічному гідроксилапатиті та смолах BioFreshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells Scale S. Після цього ΙΦΗ-b інтенсивно діалізували And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A проти 25мМ цитрату/150мМ NaCl (pH 4,5) і стериPractical Guide To Molecular Cloning (1984); the лізували фільтрацією (0,2мкм). Препарат ΙΦΗ-b treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, мав >99% чистоту за даними денсітометрії забарInc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian влених кумасі невідновлювальних ДДС-Na ΠΑΓΕ Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold гелів. За результатами вимірювання на клітинах Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, RATEC щура було визначено, що питома активVols. 154 і 155 (Wu et al. eds.), Imrnunochemical ність становить приблизно 3x108одиниць/мг. Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and У даному прикладі ΝΤΝ індукували у 28 щурів Walker, eds., Academic Press, London, 1987); WKY, отриманих від Charles River Laboratories. Handbook Of Experimental Immunology, Volumes IЧотирьох щурів забивали на 14-й день для базової IV (D. M. Weir і С. С. Blackwell, eds., 1986); гістології, а інших рандомізували для отримання Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor або ΙΦΗ-b 3x105одиниць/день внутрішньочеревинLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]. но (в. ч.), або ΙΦΗ-b 6x105одиниць/день в. ч., або Приклади тільки розчинника. Ін'єкції проводили 6 днів на тиПриклад 1: ΙΦΗ-b викликає значне зниження ждень, і лікування продовжували до 30-го дня. протеїнурії при нирковій недостатності Протеїнурію вимірювали на 7-й день і потім щотиУ даному прикладі описується те, що ΙΦΗ-b жня. У щурів брали кров на 14-й день, 28-й день і значно знижує протеїнурію на тваринній моделі при забої. При забої нирки, легені, печінку та селеΝΤΝ (нефротоксичного нефриту) у щурів, яка явзінку фіксували в формаліні, а нирки швидко замоляє собою модель запалення, що є гістологічно рожували. близькою до серпоподібного гломерулонефриту Оцінювали наступні функціональні параметри, людини, що веде до хронічної ниркової недостатвизначені в даному і/або подальших прикладах. ності. Альбумінурію/протеїнурію: даний показник віЗахворювання індукують у щурів за допомогою дображає витік в клубочках і, в меншій мірі, недов. в. ін'єкції нефротоксичної (NTS) сироватки, яку статність канальцевого метаболізму фільтрованих отримують імунізацією кроликів препаратом ліофібілків. Інтерпретація таких даних може бути усклалізованої базальної мембрани клубочків (GBM). днена, оскільки вони є результуючою двох незаNTS швидко зв'язується з GBM, що веде до енерлежних змінних; підвищена проникність GBM веде гійної внутрішньоклубочкової запальної відповіді з до більшої протеїнурії, але знижена швидкість підвищенням рівня прозапальних цитокінів і молеклубочкової фільтрації знижує клубочкову протеїкул адгезії. Відбувається приплив лейкоцитів в нурію. клубочок. Потім в клубочках розвиваються ділянки Сечу збирали в метаболічних клітинах за 24 некрозу з відкладенням фібрину та руйнуванням години до забою. Концентрацію альбуміну сечі капілярних петель. Це веде до розвитку серпоповизначали рокетним імуноелектрофорезом. Кондібних структур - акумуляції клітин запалення та центрацію білка сечі визначали осадженням сульпроліферуючих епітеліальних клітин клубочка в фосаліциловою кислотою. просторі Боумена. Даний простір запалення відріСироватковий креатинін та кліренс креатиніну зняється втратою великої кількості білка з сечею. (СrСІ): Периферичну кров отримували при забої У клубочках розвивається прогресуюче рубцювандля визначення концентрації креатиніну сироватки ня з накопиченням колагену в пучок та фіброзною із застосуванням реактивів Olympus і аналізатора трансформацією серпоподібних структур. Потім у Olympus AU600 (Olympus, Eastleigh, U.K.). Вимірющурів розвивається кінцева ниркова недостатвали також концентрацію креатиніну в сечі (Bayer ність. Таким чином, при даній моделі щури відпоRA-XT, Newbury, U.K.) для здійснення розрахунків відають на антитіла проти GBM гострим, але скокліренсу креатиніну. роминущим захворюванням нирок, і потім 100% Виживання. Кінцевою точкою даних дослітварин прогресує до ХНН чітко певним чином. Різджень є або несподівана смерть, або забій для ні лінії щурів володіють варіюючою схильністю до 55 88440 56 6х105одиниць/день в. ч. 6 днів на тиждень з 0-го по виявлення дистресу. Тварини оглядаються щодня 14-й день. Вісім щурів лікували RSA в. ч. 6 днів на непосвяченим, незалежним спостерігачем, і тватиждень з 0-го по 14-й день. Вісім щурів лікували рин, що гинуть, забивають за рішенням третьої сторони. На практиці приблизно половина тварин ΙΦΗ-b щура 6x105одиниць/день в. ч. 6 днів на тижв дослідженнях на виживання досягала кінцевої день з 0-го по 28-й день. Вісім щурів лікували RSA точки "забою". в. ч. 6 днів на тиждень з 0-го по 28-й день. Сечу Для грубої оцінки рубцювання клубочків, випазбирали в метаболічних клітинах на 7-й, 14-й, 21-й діння канальців, інтерстиційних запальних інфільі 28-й дні для вимірювання протеїнурії і креатину. У тратів та інтерстиційного фіброзу із застосуванням всіх щурів брали кров на 14-й день і при забої для умовних бальних шкал отримували зрізи, забарввизначення креатину сироватки. Половину щурів лені гематоксиліном та еозином. кожної групи забивали на 14-й день і половину - на Фіброз клубочків: за допомогою комп'ютера 28-й день. За годину до забою щурів на 28-й день встановлювали % площі кори нирок, забарвленої в вводили BrdU для оцінки клітинної проліферації. зелений колір за допомогою гістохімії MassonДля гістології в формаліні фіксували наступні ткаTrichrome, яка передбачає спосіб оцінки «наваннини: нирки, легені, печінку і селезінку. Зрізи нирок таження» колагеном в нирках. Для кількісної оцінфіксували в фіксаторі Саrnоу для забарвлення ки інтерстиційного фіброзу в клубочках зрізи ниBrdU. Нирки також швидко заморожували. Рубцюрок, поміщені в парафін, забарвлювали за вання клубочків, атрофію канальців та фіброз оцідопомогою стандартного триколірного способу нювали напівкількісно на забарвлених Н&Е зрізах. (Martius Yellow, Brilliant Crystal Scarlet і Aniline Результати, представлені на Фіг.4, вказують Blue). Для кількісної оцінки відкладення фібрину в на те, що ΙΦΗ-b викликає значне зниження протеїклубочках (наприклад, фібриноїдного некрозу) нурії на 14-й, 21-й і 28-й дні. Не було відмінностей зрізи нирок, поміщені в парафін, забарвлювали з в креатинiні сироватки та кліренсі креатиніну на допомогою Martius Yellow, який забарвлює фібрин 14-й і 28-й дні. Гістологічно було наявним значне в червоний/оранжевий колір. Зрізи досліджують зниження макрофагів клубочків (клітини ED1+) і при збільшенні Х200 за допомогою мікроскопа клітин CD8 + на 14-й день, але більша кількість Olympus BX40 (Olympus Optical, London, U.K.), на 28-й день. Відбувалося також значне зниження з'єднаного з цифровим фотонний фотоапаратом гладком 'язового актину в клубочках на 28-й день. (Photonic Science, East Sussex, U.K.). Зображення Таким чином, лікування ΙΦΗ-b впливало на протеїфіксували і аналізували за допомогою програми нурію, спричиняло зниження запалення, але не Image-Pro PlusÔ (Media Cybernetics, Silver Spring, надавало вираженої дії на рубцювання. MD). В іншому прикладі ΝΤΝ індукували у 16 щурів Кількісне визначення % площі кори нирок, заWKY, вісім з яких лікували ΙΦΗ-b щура барвленої коричневим кольором після імуноперок6x105одиниць/день в. ч. 6 днів на тиждень з 0-го по сидазного фарбування домену ED (А) фібронекти7-й день, а інших вісім щурів лікували лише носієм ну на зрізах нирок, мабуть, забезпечує розрізнення (альбуміном сироватки щура - RSA) в. ч. 6 днів на ХНН з різною функціональною тяжкістю. Схожим тиждень з 0-го по 7-й день. Щурів утримували в чином імуногістохімія колагену типу III дозволяє метаболічних клітках на 6-й і 7-й дні. Всіх щурів розрахувати % забарвленої площі кори нирок. забивали на 7-й день. За одну годину до забою Експресію альфа-гладком'язового актину щурам вводили BrdU для оцінки клітинної пролі(SNA) в клубочках вимірювали з допомогою імуферації. При забої в формаліні фіксували нирки, нофлуоресценції. Даний білок визначає популяцію легені, печінку і селезінку. Нирки фіксували в фік«міофібробластних» клітин в клубочках, які, як саторі Саrnоу для фарбування BrdU і швидко завважають, займають провідне місце в фіброзі клуморожували. Результати показують відсутність бочків. Кількісне визначення фарбування альфазначних відмінностей в протеїнурії, гістології клу(SМА) добре корелює з показниками фіброзу клубочків або кількості макрофагів або CD8 клітин в бочків Masson-trichome. клубочках. Однак показник фібриноїду на 7-й день Результати, які показані на Фіг.3, вказують на у тварин, що лікувалися ΙΦΗ-b, був нижчим, ніж у значне зниження протеїнурії на 21-й і 28-й дні у контрольних тварин. Крім того, кількість проліфетварин, що піддавалися лікуванню обома дозами руючих клітин в клубочках була значно нижчою у ΙΦΗ-b. Не виявлено відмінностей в сироватковому тварин, що лікувалися ΙΦΗ-b, у порівнянні з конткреатиніні, кліренсі креатиніну, клубочковому або рольними тваринами (див. Фіг.5). тубулоінтерстиційному рубцюванні по відношенню Приклад 3: ΙΦΗ-b викликає значне зниження до "сліпого" зрізу Н&Е (тобто гістологічного рубцюпротеїнурії при нирковій недостатності на тваринвання); в кількості макрофагів або CD8 в клубочній моделі Thy гломерулонефриту ках; або відкладенні фібронектину ED (А) або коДаний приклад показує, що протеїнурія також лагену типу IV в клубочках. значно знижується під дією ΙΦΗ-b при мезангіальПриклад 2: ΙΦΗ-b значно знижує протеїнурію в ному проліферативному гломерулонефриті. гострій фазі ниркової недостатності Для даного прикладу застосовували тваринну Даний приклад показує, що в доповнення до модель Thy1 гломерулонефриту. Вона являє созниження протеїнурії на більш пізніх стадіях нирбою модель мезангіального проліферативного кової недостатності ΙΦΗ-b також знижує протеїнугломерулонефриту, який відрізняється підвищерію в гострій фазі ниркової недостатності. ною протеїнурією, проліферацією мезангіальних Для даного прикладу ΝΤΝ індукували у 32 щуклітин і накопиченням мезангіального матриксу. рів за допомогою ін'єкції 0,1мл NTS в. в., як описаДана модель залежить від того, що мезангіальні но вище. Вісім щурів лікували ΙΦΗ-b щура 57 88440 58 клітини експресують антигенний Thy1. Щурам Приклад 4: ΙΦΗ-b викликає значне зниження Lewis вводять однократну в. в. ін'єкцію моноклопротеїнурії на тваринній моделі пуроміцинамінонунального антитіла проти Thy1. Це веде до швидкоклеозидної нефропатії (PAN) го та відтворюваного опосередкованого комплеPAN індукували у 4 самців щурів Wistar по 200г ментом некрозу мезангіальних клітин клубочків кожний. Два щури отримували 20мг пуроміцинамі(мезангіолізису). Протеїнурія стає явною до 24 нонуклеозид (РА;) внутрішньочеревинно (в. ч.) на годин і продовжується щонайменше протягом 10 0-й день, і два щури отримували 20мг РА внутрішднів. Мезангіолізис зміняється фазою репарації, в ньосудинно (в. с.) на 0-й день. Щурів утримували в якій мезангіальні клітини проліферують, і відбуваметаболічних клітках на 3-4-й і 7-8-й дні. Всіх щурів ється утворення надлишку мезангіального матрикзабивали на 8-й день. Результати показали, що су. Це являє собою модель протеїнурії і проліфесередня величина протеїнурії становить 46 (мг/24 рації мезангіальних клітин. години) і 287 на 4-й і 8-й дні, відповідно, у щурів, Thy1 гломерулонефрит індукували у 16 щурів ін'єктованих в. ч., і 122 і 194 на 4-й і 8-й дні, відпоLewis і 4 щурів WKY шляхом ін'єкції 0,2мл відно, у щурів, ін'єктованих в. в. (2,5мг/кг) антитіла ER4 проти Thy1. Вісім щурів Дія ΙΦΗ-b на даній тваринній моделі була поLewis отримували ΙΦΗ-b щура 6х105одиниць/день казана таким чином. PAN індукували у щурів, як в. ч. 6 днів на тиждень з 0-го по 10-й день. Вісім вказано вище. Щури отримували 6x102, 6x103, щурів Lewis отримували носій (альбумін сироватки 6x104, 6x105 одиниць ΙΦΗ-b щура або тільки бущура - RSA) в. ч. 6 днів на тиждень з 0-го по 10-й фер. Результати, які показані на Фіг.9, вказують на день. Чотири щури WKY не отримували лікування, те, що введення ΙΦΗ-b значно знижує протеїнурію і прогресування захворювання відстежували з 0-го на 7-й і 14-й дні, навіть при найменшій дозі ΙΦΗ-b. по 10-й день. Щурів утримували в метаболічних Таким чином, результати даного прикладу клітках на 6-й і 7-й і 9-й і 10-й дні. Щурів забивали вказують на те, що ΙΦΗ-b знижує запалення при на 10-й день. За одну годину до забою щурам ввозахворюванні нирок, про що свідчить зниження дили BrdU для оцінки клітинної проліферації. При протеїнурії та проліферації клубочків, а також знизабої в формаліні фіксували нирки, легені, печінку ження клітин запалення, наприклад, макрофагів і та селезінку. Нирки фіксували в фіксаторі Сагпоу CD8+ клітин в клубочках. Таким чином, ΙΦΗ-b модля фарбування BrdU і швидко заморожували. же бути застосований для лікування, наприклад, Результати, показані на Фіг.6, вказують на те, профілактики гломерулонефриту, гострої і хронічщо протеїнурія значно знижувалася на 7-й і 10-й ної ниркової недостатності. дні. Не виявлено яких-небудь відмінностей в креаЕквіваленти тиніні сироватки, однак кліренс креатину виявляв Фахівці в даній галузі техніки повинні розуміти тенденцію до зниження в групі, яка піддавалася або бути здатні пересвідчитися при застосуванні лікуванню (Фіг.7). Не було відмінностей в ушколише звичайного експериментування, що є багато дженні клубочків, що оцінювалося за наявністю еквівалентів конкретних здійснень описаного тут мікроаневризмів клубочків. Однак гіперклітинність винаходу. Мається на увазі, що такі еквіваленти клубочків була значно знижена у щурів, що лікуваохоплюються наступною формулою винаходу. лися ΙΦΗ-b (Фіг.8). 59 88440 60