Аналоги 1-дезаміно-8-d-аргінілвазопресину

1. Аналоги 1-дезаміно-8-D-аргінілвазопресину, що мають наступну загальну формулу: Mpa-Tyr-Phe-X-Y-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2, де Mpa являє собою радикал 3-меркаптопропіонової кислоти з формулою SH-CH2-CH2-COOH; Х являє собою амінокислоту вибрану з групи, що включає аланін, аспарагін, глутамін, ізолейцин, лейцин і валін, а Y являє собою амінокислоту вибрану з групи, що включає аспарагін, глутамін, ізолейцин, лейцин і валін, за умови: якщо X являє собою аспарагін або глутамін, то Y не є глутаміном. 2. Аналог 1-дезаміно-8-D-аргінілвазопресину за п. 1, який відрізняється тим, що X являє собою аланін, a Y вибраний з групи, що включає глутамін, ізолейцин, лейцин і валін. 3. Аналог 1-дезаміно-8-D-аргінілвазопресину за п. 1, який відрізняється тим, що X являє собою аспарагін і Y вибраний з групи, що включає ізолейцин, лейцин і валін. 4. Аналог 1-дезаміно-8-D-аргінілвазопресину за п. 1, який відрізняється тим, що X являє собою глутамін, a Y вибраний з групи, що включає ізолейцин, лейцин і валін. 2 (19) 1 3 88441 4 являє собою ізолейцин, a Y вибраний з групи, що включає глутамін, ізолейцин, лейцин і валін. 13. Аналог 1-дезаміно-8-D-аргінІлвазопресину за п. 8, який відрізняється тим, що X являє собою лейцин, a Y вибраний з групи, що включає глутамін, ізолейцин, лейцин і валін. 14. Аналог 1-дезаміно-8-D-аргінілвазопресину за п. 8, який відрізняється тим, що X являє собою валін, a Y вибраний з групи, що включає глутамін, ізолейцин, лейцин і валін. За цією заявкою заявлено пріоритет відповідно до патентної заявки Ρ 02-0105123 (AR), що зареєстрована 27 грудня 2003 p. Ця заявка відноситься до аналогів 1-дезаміно8-D-аргинилвазопресину, зокрема, до аналогів 1дезаміно-8-D-аргинилвазопресину, що містять заміщення в позиціях 4 і 5. 1-дезаміно-8-D-аргинилвазопресин (десмопресин) є олігопептидом 8 амінокислот. Дме. патент США 3,497, 491 (Zaoral et al.); Huguenin et al., Helv. Chi. Acta, 49: 695 (1966); Zaoral et al., Coll. Czech. Chem. Commun., 32: 1250 (1967). Антидіуретична активність цього пептиду відома фахівцям. Див. Vavra et al., Lancet, 1: 948 (1968). десмопресин використають для лікування неадекватної секреції антидіуретичного гормону (diabetis insipidus) і дитячого енурезу. Фахівцям відомі також гемостатичні й профібринолітичні властивості цього олігопептиду. Введення десмопресину зв'язують із підвищенням плазматичних рівнів коагуляційного фактора VIII, фактора Фон Вилебранда й тканинного активатора плазминогену. Див. Manucci et al., Br.J. Haemotol, 30: 81-93 (1975). Ці властивості десмопресину дозволяють застосовувати його при деяких порушеннях коагуляції, зокрема, при хірургічному лікуванні пацієнтів у випадку небезпеки крововиливу. Пізніше відкрили також протипухлинну дію десмопресину. Застосування цього олігопептиду зв'язували зі зниженням метастатичної колонізації в органах, вилучених від циркулюючих ракових клітин, та інгибіруванням розвитку метастазів у регіонарних лімфатичних вузлах після хірургічних процедур. Див. AR P990100736; ЕР 1,031,352; US200220013262 (Alonso et al.); Alonso et al., Breast Cancer Res. Treat, 57: 271-275 (1999); Gixonetal, J. Surg. Oncol, 81; 38-44 (2002). Фахівцям відомо також про існування аналогів десмопресину, що мають біологічну активність рівну, або більш високу, ніж у десмопресину. Такі аналоги одержують, наприклад, у результаті метилування або заміщення однієї або декількох амінокислот з пептидного ланцюга десмопресину або його попередника - вазопресину. Див. Loukoti, J. Pept, Sci 6(3): 123-9 (2000); Kihlberg et al., J. Med. Chem., 38 (1): 161-9 (1995); Barth et al, EurJ. Pharmacol, 232(2-3): 223-6 (1993); Barth, J. Recept. Res., 13(1-4): 305-11 (1993); Lammek et al., J. Med. Chem., 32 (I): 244-7 (1989); US 4,876,243 (Marshall et al.). Однак дотепер не описане одночасне заміщення амінокислот у позиціях 4 і 5 пептидного ланцюга десмопресину в сполученні з видаленням дисульфідного зв'язку в позиціях 1 і 6. Задачею цього винаходу є аналоги 1дезаміно-8-D-аргинилвазопресину, не відомі раніше. Деякі з описаних отут олігопептидів проявляють високу здатність інгибірування міграції метастазів і канцерогенних клітин. Додатковими позитивними якостями описаних тут олігопептидів є простота їхнього синтезу й відносно низька вартість одержання. Олігопептиди згідно цьому винаходу синтезували способом Хогтена (спосіб чайних пакетиків). Див. Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 52: 513135 (1985); Houghten et al, Int. J. Peptide Protein Res., 27: 673-678 (1985); US 5, 486,596 (Prochazka et al.). При використанні способу Хогтена синтез пептидів виконують за допомогою мініатюрних пористих пакетиків, які виготовлені з поліпропілену (чайні пакетики) і містять амінокислоти, що зв'язані зі смолою. Пакетики занурюють у розчини, що містять активовані амінокислоти, щоб викликати з'єднання амінокислот, що є присутніми в розчині, з амінокислотами, що зв'язані зі смолою. На цій стадії процесу амінокислоти, зв'язані зі смолою, вимиваються й звільняються від захисту, що сприяє їхньому з'єднанню з активованими амінокислотами, які знаходяться в розчині. Поліпропіленовий пакетик витягають із першого реакційного розчину й занурюють у другий розчин, що містить інші активовані амінокислоти, щоб таким чином увести в пептидний ланцюг додаткові амінокислоти. Процес повторюють кілька разів, щоб одержати необхідний пептид. Цей спосіб, а також його видозміни відомі фахівцям. Дів. Grant, G., Ed., "Synthetic Peptides" (W. Η. Freeman & Co., New York, 1992) cтop.78-142. В одному з варіантів реалізації цього винаходу аналоги і-дезаміно-8-Dаргинілвазопресину мають наступну загальну формулу: В інших варіантах реалізації цього винаходу аналоги 1-дезаміно-8-D-аргинілвазопресин містять дисульфід ний зв'язок між групою Гра в позиції 1 і цистеїном у позиції 6. У цих випадках аналоги 1дезаміно-8-D-аргинілвазопресину мають наступну загальну формулу: X являє собою переважно слабку полярну або неполярну амінокислоту. Найбільш переважно амінокислота є аспарагіном або глютаміном, якщо використають слабку полярну амінокислоту, або аланіном, валіном, лейцином або ізолейцином, 5 якщо використають неполярну амінокислоту. Υ являє собою переважно слабку полярну або неполярну амінокислоту. Найбільш переважно амінокислота є аспарагіном або глутаміном, якщо використають слабку полярну амінокислоту, або аланіном, валіном, лейцином або ізолейцином, якщо використають неполярну амінокислоту. Використовуване в цьому описі позначення "Мра" являє собою радикал 1-меркаптопропіонової кислоти з формулою SH-CH2-CH2-COOH. Загальні процедури Пептиди, згідно цьому винаходу, синтезували відповідно до описаних нижче процедур: 1. Синтез Пептиди синтезували за допомогою смоли метилбензилгідриламіну з використанням методики Вос/Веnсіl відповідно до наступного протоколу: 1. Пористі пакетики з поліпропілену заповнили метилбензилгідриламіновою смолою. Потім пакетики помістили в колбу Nalgen™ і додали діхлорметан до їхнього повного покриття. Потім колбу Nalgen™ струшували протягом п'яти хвилин, щоб забезпечити насичення смоли. Екстрагували розчин діхлорметану. 2. Поліпропіленові пакетики з попередньої операції три рази промили діхлорметаном, що містить 5% діізопропіламіну. Кожне промивання тривало дві хвилини. Потім поліпропіленові пакетики три рази промили діхлорметаном, щораз протягом 1 хвилини, щоб видалити надлишок діізопропіламіну. 3. Поліпропіленові пакетики з попередньої операції помістили в колбу Nalgen™, що містить розчин відповідної амінокислоти в діхлорметані. Потім додали діізопропілкарбодимід у кількості, рівній розчиненій у діхлорметані, щоб активувати з'єднання амінокислоти, розчиненій у метилбензилгідриламіновій смолі. Колбу Nalgen™ струшували протягом 1 години до закінчення реакції. 4. Реакційний розчин із попередньої операції видалили. Поліпропіленові пакетики з попередньої операції двічі промили Ν,Ν-діметилформамідом, щораз - протягом 1 хвилини, щоб видалити надлишок амінокислот і інших вторинних продуктів. 5. Поліпропіленові пакетики з попередньої операції двічі промили діхлорметаном, щораз протягом 1 хвилини, щоб видалити надлишок Ν,Νдіметилформаміду. Захисну групу Ν-α-тербутилоксикарбонілу (N-a-t-Boc) видалили кислотним лізисом за допомогою 55% розчину трифтороцтової кислоти в діхлорметані. Поліпропіленові пакетики витримали в розчині трифтороцтової кислоти протягом 30 хвилин. В результаті реакції одержали сіль α-аміногрупи. 6. Поліпропіленові пакетики з попередньої операції послідовно промили: а) діхлорметаном, однократно - протягом однієї хвилини, б) ізопропанолом - двічі, щораз протягом однієї хвилини, в) діхлорметаном, однократно - протягом однієї хвилини. Вищеописаний протокол повторили для кожної амінокислоти таким чином, щоб згідно цьому винаходу одержати аналоги десмопресину. 2. Екстракція 88441 6 Пептиди, синтезовані відповідно до попередньої процедури, відокремили від смоли метилбензилгідриламіну відповідно до наступного протоколу: 1. Пептидний зв'язок зі смолою з попередньої процедури піддали дії фтористоводневої кислоти в присутності анізолу при 0°С протягом однієї години, щоб відокремити зазначений пептид від смоли. 2. Фтористоводневу кислоту видалили з реакційної суміші потоком азоту при 0°С протягом однієї години. 3. Смолу й пептид із попередньої операції двічі промили діетиловим ефіром. 4. Пептид екстрагували з реакційної суміші з попередньої операції 10% розчином оцтової кислоти. Процес повторили двічі. 5. Екстрагуючи розчини з попередньої операції, що містять пептид, ліофилізували. 6. Пептид зберігали в атмосфері азоту. Вищеописаний протокол, згідно цьому винаходу, повторили для кожного з пептидів. 3. Очищення Пептиди, отримані відповідно до попередньої процедури очистили за допомогою зворотньофазної високоефективної рідинної хроматографії, використовуючи колонкові З18. У якості розчинників використали: а) водяний розчин, що містить 0,1% трифтороцтової кислоти й б) розчин ацетонітрилу, що містить 0,1% трифтороцтової кислоти. Після очищення відповідно до даної процедури пептиди ліофилізували. Вищеописаний протокол згідно до цього винаходу повторили для кожного з пептидів. 4. Утворення дисульфідного зв'язку Лінеаризовані пептиди, отримані відповідно до попередньої процедури, розчинили у воді до одержання початкового реакційного розчину з концентрацією 5мг/мол. У реакційний розчин повільно додали 1Μ розчину NH4HCO3 до одержання слабко лужної концентрації із рН 7,5. Потім у реакційний розчин при легкому перемішуванні додали 1,5% розчин Н2О2. Отриманий реакційний розчин періодично аналізували за допомогою масспектроскопії, щоб визначити ступінь утворення дисульфідних зв'язків. Після утворення дисульфідних зв'язків кислотність реакційного розчину змінили до рН 4 за допомогою СН3СООН. Пептиди з дисульфідними зв'язками, отримані в результаті цієї процедури, очистили способом зворотньофазної високоефективної рідинної хроматографії. Вищеописаний протокол згідно до цього винаходу повторили для кожного з пептидів. Приклад 1 Аналоги 1-дезаміно-8-D-аргинилвазопресину без дисульфідних зв'язків між позиціями 1 і 6 Відповідно до загальних процедур 1, 2 і 3 синтезували наступні аналоги десмопресину: 1) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аланил-L-аспарагианил-Lаспарагил-L-цистеїл-L-пропил-D-аргил-Lгліцинамид: 7 88441 8 2) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аланил-L-глутамил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 15) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-глутамінил-L-валил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 3) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аланил-L-ізолейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 16) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-изолейцил-L-аспарагил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 4) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аланил-L-лейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 17) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-изолейцил-L-глутамінил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 5) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аланил-L-валил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 18) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-изолейцил-L-изолейцил-L-цистеїлL-пропил-D-аргал-L-гліцинамид: 6) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аспарагил-L-аспарагил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 19) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-изолейцил-L-лейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 7) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аспарагил-L-глутамінил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 8) 3-мepкaптoпpoпіoнил-L-тиpoзил-Lфeнiлaлaнил-L-acпapaгил-L-изoлeйцил-L-циcтeїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 9) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аспарагил-L-лейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 20) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-изолейцил-L-валил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 21) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-лейцил-L-аспарагил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргал-L-гліцинамид: 22) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-лейцил-І-глутамінил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 10) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-аспарагил-L-валил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 23) 3-меркаптоіфопиіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-лейцил-L-изолейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 11) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-глутамінил-L-аспарагил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 24) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-лейцил-L-лейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 12) 3-меркаптопротонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-глутамінил-L-глутамінил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 25) 3-меркаптопротонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-лейцил-L-валил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 13) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-глутамінил-L-изолейцил-L-цистеїлL-пропил-D-аргил-L-гліцинамид: 26) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-валил-L-аспарагил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 14) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-глутамінил-L-лейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 27) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-валил-L-глутамінил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 28) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-валил-L-изолейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 9 29) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-валил-L-лейцил-L-цистеїл-Lпропил-D-аргил-L-гліцинамид: 30) 3-меркаптопропіонил-L-тирозил-Lфенілаланил-L-валил-L-валил-L-цистеїл-L-пропилD-аргил-L-гліцинамид: Приклад 2 Аналоги 1-дезамін-8-D-аргинилвазопресину із дисульфідними зв'язками між позиціями 1 і 6 Відповідно до загальних процедур 1, 2, 3 і 4 синтезували наступні аналоги десмопресину: 1) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАланил-5-L-аспарагил-8-D-аргинилвазопресин: 2) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАланил-5-L-глутамінил-8-D-аргинилвазопресин: 3) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАланил-5-L-изолейцил-8-D-аргинилвазопресин: 4) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАланил-5-L-лейцил-8-D-аргинилвазопресин: 5) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАланил-5-L-валил-8-D-аргинилвазопресин: 6) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАспарагил-5-L-аспарагил-8-D-аргинилвазопресин: 7) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАспарагил-5-L-глутамінил-8-D-аргинилвазопресин: 8) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАспарагил-5-L-изолейцил-8-D-аргинилвазопресин: 9) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАспарагил-5-L-лейцил-8-D-аргинилвазопресин: 10) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LАспарагил-5-L-валил-8-D-аргинилвазопресин: 88441 10 11) 1-(3-меркаптопропіоновая Глутаминил-5-L-глутаминил-8-Dаргинилвазопресин: кислота)-4-L 12) 1-(3-меркаптопропіонова Глутаминил-5-L-изолейцил-8-Dаргинилвазопресин: кислота)-4-L 13) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LГлутаминил-5-L-лейцил-8-D-аргинилвазопресин: 14) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LГлутаминил-5-L-валил-8-D-аргинилвазопресин: 15) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LИзолейцил-5-L-аспарагил-8-D-аргинилвазопресин: 16) 1-(3-меркаптопропіонова Изолейцил-5-L-глутаминил-8-Dаргинилвазопресин: кислота)-4-L 17) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LИзолейцил-5-L-изолейцил-8-D-аргинилвазопресин: 18) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LИзолейцил-5-L-лейцил-8-D-аргинилвазопресин: 19) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LИзолейцил-5-L-валил-8-D-аргинилвазопресин: 20) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LЛейцил-5-L-аспарагил-8-D-аргини лвазопресин: 21) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LЛейцил-5-L-глутамінил-8-D-арганилвазопресин: 22) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LЛейцил-5-L-изолейцил-8-D-аргинилвазопресин: 11 88441 12 27) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LВалил-5-L-изолейцил-8-D-аргинилвазопресин: 23) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LЛейцил-5-L-лейцил-8-D-аргинилвазопресин: 24) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LЛейцил-5-L-валил-8-D-аргинилвазопресин: 28) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LВалил-5-L-лейцил-8-D-аргинилвазопресин: 29) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LВалил-5-L-валил-8-D-аргинилвазопресин: 25) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LВалил-5-L-аспарагил-8-D-аргинилвазопресин: 26) 1-(3-меркаптопропіонова кислота)-4-LВалил-5-L-глутамінил-8-D-аргинилвазопресин: Комп’ютерна верстка А. Рябко Цей винахід описаний з деякими подробицями й наведеними прикладами, які сприяють його розумінню й відтворюваності. Фахівці можуть внести певні зміни у форму й деталі без відхилення від справжнього завдання й області поширення винаходу відповідно до формули цього винаходу. Всі цитовані публікації повністю включаються в даний опис винаходу як посилання. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601