Терапевтичне антитіло, яке звязується з b-амілоїдним пептидом

1. Терапевтичне антитіло, яке відрізняється тим, що являє собою антитіло або фрагмент зв'язування з антигеном та/або його похідне, яке зв'язується з  -амілоїдним пептидом і включає такі CDR: CDRH1: DNGMA (SEQ ID NO: 1), CDRH2: FISNLAYSI DYADTVTG (SEQ ID NO: 2), CDRH3: GTWFAY (SEQ ID NO: 3), в межах варіабельної ділянки людського важкого ланцюга, яка походить з сімейства гена VH3, і: CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID NO: 4), CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID NO: 5), CDRL3: SQTRHVPYT (SEQ ID NO: 6), в межах варіабельної ділянки людського легкого ланцюга, яка походить з послідовності амінокислот, показаної у GenPept CAA51135 (SEQ ID NO: 24). 2. Терапевтичне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що варіабельна ділянка людського важкого ланцюга походить з: 2 (19) 1 3 (іі) Положення 24 93 94 або (ііі) Положення 48 93 94 Залишок V V S Залишок 1 V S 8. Терапевтичне антитіло, яке відрізняється тим, що містить ланцюг VH, який має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 26, і ділянку VL, яка має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 32. 9. Терапевтичне антитіло, яке відрізняється тим, що містить ланцюг VH, який має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 28, і ділянку VL, яка має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 32. 10. Терапевтичне антитіло, яке відрізняється тим, що містить ланцюг VH, який має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 30, і ділянку VL, яка має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 32. 11. Терапевтичне антитіло, яке відрізняється тим, що являє собою антитіло або фрагмент зв'язування з антигеном та/або його похідне, яке зв'язується з  -амілоїдним пептидом 1-12 (SEQ ID NO: 15) з константою рівноваги KD, меншою ніж 100 пМ, і демонструє константу рівноваги KD зв'язування з  -амілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NO: 44), що в 1000 разів перевищує константу для пептиду 1-12 (SEQ ID NO: 15), обидві визначені за методом резонансу поверхневого плазмону з використанням пептиду, захопленого на мікрочипі стрептавідину. 12. Терапевтичне антитіло, яке відрізняється тим, що являє собою антитіло або фрагмент зв'язування з антигеном та/або його похідне, яке зв'язується з  -амілоїдним пептидом 1-40 з констан Галузь винаходу Даний винахід пов’язаний з антитілами, які зв'язуються з β-амілоїдним пептидом і, зокрема, людським β-амілоїдним пептидом. Даний винахід також стосується способів лікування захворювань або розладів, що відрізняються підвищеним рівнем β-амілоїдів або відкладенням β-амілоїдів, зокрема, хвороби Альцгеймера, вказаними антитілами, фармацевтичними композиціями, що містять вказані антитіла, і способів одержання. Інші аспекти даного винаходу будуть показані в описі нижче. Передумови винаходу Хвороба Альцгеймера (AD) являє собою розповсюджене, пов'язане з віком зниження пізнавальної здатності, яке вражає більше 12 мільйонів осіб у всьому світі (Citron M (2002) Nat. Neurosci 5, Suppl 1055-1057). Найбільш ранні стадії захворювання характеризуються прогресивною втратою пам'яті з пов'язаним зниженням пізнавальної здатності і порушеннями мови та поведінки. На пізні 94734 4 тою рівноваги KD менше 10 нМ, і демонструє константу рівноваги KD зв'язування з  -амілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NO: 44), що в 1000 разів перевищує константу для пептиду 1-12 (SEQ ID NO: 15), обидві визначені за методом аналізу резонансу поверхневого плазмону, описаним у Методі В Прикладів. 13. Терапевтичне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що має ізотип ІgG1. 14. Терапевтичне антитіло за будь-яким з попередніх пунктів, яке відрізняється тим, що істотною мірою не має функцій а) активації комплементу класичним шляхом; і b) залежної від антитіла клітинно-опосередкованої цитотоксичності. 15. Терапевтичне антитіло за п. 13, яке відрізняється тим, що залишки 235 і 237 замінені на аланін. 16. Терапевтичне антитіло за п. 1, яке відрізняється тим, що антитіло містить важкий ланцюг, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 34, 36 або 38, і легкий ланцюг, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 40. 17. Фармацевтична композиція, яка відрізняється тим, що містить терапевтичне антитіло за будьяким з попередніх пунктів. 18. Спосіб лікування пацієнта-людини, враженого захворюванням, пов'язаним з  -амілоїдними пептидами, який відрізняється тим, що включає стадію введення вказаному пацієнту терапевтично ефективної кількості терапевтичного антитіла за будь-яким з пп. 1-16. 19. Застосування терапевтичного антитіла за будь-яким з пп. 1-16 у виробництві лікарського засобу для лікування пов'язаного з  -амілоїдним пептидом захворювання. 20. Антитіло або його фрагмент, яке відрізняється тим, що містить ділянку VH, яка має послідовність: SEQ ID NO: 17, і ділянку VL, яка має послідовність: SEQ ID NO: 19. ших стадіях захворювання у пацієнтів розвивається глобальна амнезія і дуже зменшується моторна функція. Смерть звичайно відбувається через 9 років після встановлення діагнозу і часто пов'язана з іншими станами, звичайно пневмонією (Davis K. L. and Samules S. C. (1998) in Pharmacological Management of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S. J. and Coyle J. T. (McGrawHill, New York pp 267-316)). Існуючі методи лікування представляють симптоматичні підходи, зосереджені на зменшенні пошкодження пізнавальної здатності і полегшенні поведінкових симптомів, пов'язаних з етіологією прогресуючого захворювання. На практиці таке лікування забезпечує тільки короткочасне покращення пізнавальної здатності у випадку порушення пізнавальної функції, яке триває тільки до 2 років. Потенціал для терапії, яка впливає на це захворювання, уповільнює і можливо зупиняє прогресування захворювання, є величезним. Такі підходи запропонували радикальне і 5 тривале покращення якості життя пацієнтів і, що важливо, родичів, які доглядають за ними, а також зменшення величезних загальних витрат на медичну допомогу при даному захворюванні. Клінічний діагноз хвороби Альцгеймера заснований на комбінації фізичних і психічних випробувань, які визначають діагноз можливої або вірогідної хвороби Альцгеймера. Після смерті захворювання підтверджується неврологічними аналізами мозку, що забезпечують ефективну диференціацію, які включають відкладення Aβ в паренхімних бляшках і мозкових судинах, утворення між нейронами нейрофібрилярного сплетіння, втрату синапсів і субпопуляцій нейронів у специфічних ділянках мозку (Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl 53:141-145). Численні генетичні, гістологічні і функціональні докази свідчать, що β-амілоїдний пептид (Aβ) є ключовим у прогресуванні хвороби Альцгеймера (Selkoe, D. J. (2001 ) Physiological Reviews 81:741766). Відомо, що Aβ утворюється шляхом розщеплення бета-амілоїдного білка-прекурсора (також відомого як APP) аспартиловим протеолітичним ферментом, відомим як BACE1 (також відомий як β-секретаза, Asp2 або мемапсин-2) (De Strooper, B. and Konig, G. (1999) Nature 402: 471-472). На додаток до відкладень у паренхимі та судинах, вважається, що розчинні олігомерні форми Aβ сприяють початку AD і вони, можливо, спочатку вражають функцію нейронів, ослаблюючи синаптичну функцію (Lambert et. al. (1998) Proceedings of the National Academy of Science, U.S.A. 95: 64486453). Хоча нерозчинні амілоїдні бляшки знайдені на ранніх стадіях AD і в MCI, рівень розчинних агрегатів Aβ, які називаються олігомерами або Aβпохідними здатними до дифузії лігандами (ADDLs), також збільшується у таких осіб, і рівень розчинних Aβ краще співвідноситься з неврофібрилярною дегенерацією і втратою синаптичних маркерів, ніж амілоїдні бляшки (Naslund et. al. (2000) J Am Med Assoc 283: 1571-1577, Younkin, S. (2001 ) Nat. Med. 1 : 8-19). Високо амілоїдогенний Aβ42 і форми з вкороченими амінокислотними закінченнями Aβx42 являють собою домінуючі види Aβ, знайдені як у розсіяних, так і старечих бляшках (Iwatsubo, T (1994) Neuron. 13:45-53, Gravina, SA (1995) J. Biol. Chem. 270:7013-7016). Відносний рівень Aβ42 виявляється ключовим регулятором агрегації Aβ в амілоїдні бляшки, дійсно показано, що агрегація Aβ42 відбувається скоріше, ніж інших форм Aβ in vitro (Jarrett, JT (1993) Biochemistry.32:4693-4697), і тому Aβ42 включена як початкова молекула в патогенезі AD (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289- 292). Хоча Aβ42 являє собою незначний продукт метаболізму APP, незначні зсуви в його продукуванні пов'язані з великим впливом на відкладення Aβ, таким чином припускається, що одне тільки зменшення Aβ42 може бути ефективним шляхом лікування AD (Younkin SG, (1998) J. Physiol. (Paris). 92:289-292). На підтвердження цього повідомляється, що мутації в амілоїдному прекурсорному білку (APP) і генах передчасної старості в основному збільшують відносний рівень Aβ42 і таким чином скорочують час до початку 94734 6 захворювання Альцгеймера (AD) (Selkoe D.J., Podlisny M. B. (2002) Annu. Rev. Genomics Hum. Gemet. 3:67-99). Однак слід зазначити, що швидкість відкладення також залежить від катаболізму і виведення Aβ. Тваринні моделі відкладення амілоїдів генеруються надмірною експресією мутантних людських трансгенів у мишах. У мишей з надмірно вираженим єдиним людським транс геном APP звичайно розвиваються мозкові відкладення βамілоїдів, подібні до бляшок, з 12 місяців від народження (Games D. et al., (1995) Nature 373: 523527; Hsiao K. et al., (1996) Science 274: 99-102)), тоді як у мишей, які мають як мутантний людський APP, так і пресенілін-1 (PS-1), звичайно, розвиваються мозкові відкладення β-амілоїдів, подібні до бляшок, починаючи з 2 місяців від народження (Kurt M.A. et al., (2001) Exp. Neurol. 171:59-71; McGowan E. et al., (1999) Neurolbiol. Dis. 6:231244). Стає все більш очевидним, що транспорт екзогенних Aβ між центральною нервовою системою (ЦНС) і плазмою відіграє роль у регулюванні рівня амілоїдів у мозку (Shibata, et al (2000) J Clin Invest 106 : 1489-1499), із СМР Aβ, що швидко транспортується із СМР до плазми. Таким чином активна вакцинація пептидами Aβ або пасивне введення специфічних антитіл Aβ забезпечує швидке зв'язування периферичних Aβ, що змінює динамічну рівновагу між плазмою, СМР і, кінець кінцем, ЦНС. Дійсно, на цей час існують численні дослідження, які продемонстрували, що обидва вказані підходи можуть знизити рівні Aβ, зменшити патологію Aβ і забезпечити збільшення пізнавальної здатності на різних трансгенних моделях амілоїдозу. Обмежені дослідження також проведені на вищих видах. Карибські зелені мавпи (16-10 років) були імунізовані пептидом Aβ за 10 місяців. Рівень Aβ40 збільшився в 2-5 разів у плазмі, яка досягала максимуму в 251 d, поки СМР рівень Aβ40 і Aβ42 істотно зменшився до 100d і повернувся у напрямку до базового з того часу. Дане зменшення в СМР супроводжувалося істотним зменшенням навантаження бляшки (Lemere, CA (2004) Am J Pathology 165:283-297). Подібне зростання рівня Aβ у плазмі також було виявлене після імунізації старих (15-20 років) макак-резусів (Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disord 18:44:46). Першим засобом імунотерапії, спрямованим на амілоїд мозку, була Elan/Wyeth's AN-1792, активна вакцина. Дане лікування було завершене після розвитку клінічних ознак, що відповідають менінгоенцефаліту. Аналізи підгрупи свідчили, що лікування уповільнює зниження пізнавальної функції (Nature Clin Pract Neurol (2005) 1:84-85). Посмертне дослідження пацієнтів також продемонструвало докази очищення від бляшок (Gilman S. et al, (2005) Neurology 64 (9) 1553-1562). Показано, що Bapineuzumab (AAB-001, Elan/Wyeth), пасивна терапія MAb, істотно покращувало показники пізнавальної здатності в дослідженні безпечності фази І. Інші захворювання або розлади, що відрізняються підвищеним рівнем β-амілоїдів або відкладеннями β-амілоїдів, включають легке порушення 7 пізнавальної здатності (MCI, Blasko I (2006) Neurobiology of aging "Conversion from cognitive health to mild cognitive impairment and Alzheimer's disease: Prediction by plasma amyloid beta 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine" in press, e-published 19 Oct 2006), спадкову мозкову кровотечу з β-амілоїдами голландського типу, мозкову β-амілоїдну ангіопатію і різні типи дегенеративних недоумств, наприклад, пов'язані з хворобою Паркінсона, прогресуючим над-ядерним паралічем, кірковою основною дегенерацією і хворобою Альцгеймера за типом дифузного тіла Люіса (Mollenhauer B (2007) J Neural Transm epublished 23 Feb 2007, van Oijen, M Lancet Neurol. 2006 5:655-60) і синдрому Дауна (Mehta, PD (2007) J Neurol Sci. 254:22-7). Короткий опис винаходу У варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, яке зв'язується з β-амілоїдним пептидом 112 (SEQ ID NО:15) з константою рівноваги KD меншою ніж 100 пМ, але не зв'язується з βамілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NО:44), обидва визначення проведені методом резонансу поверхневого плазмону з використанням пептида, захопленого на мікрочипі стрептавідину. В іншому варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, яке зв'язується з β-амілоїдним пептидом 1-12 (SEQ ID NО:15) з константою рівноваги KD меншою ніж 100 пМ, і демонструє значення константи рівноваги KD для зв'язування з βамілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NО:44), у 1000 разів більше, ніж для пептиду 1-12 (SEQ ID NО:15), обидва визначення проведені методом резонансу поверхневого плазмону з використанням пептида, захопленого на мікрочипі стрептавідину. В іншому варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, яке зв'язується з β-амілоїдним пептидом 1-12 (SEQ ID NО:15) з константою рівноваги KD меншою ніж 100 пM, і демонструє значення константи KD для зв'язування з β-амілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NО:44), у 10000 разів більше, ніж для пептиду 1-12 (SEQ ID NО:15), обидва визначення проведені методом резонансу поверхневого плазмону з використанням пептида, захопленого на мікрочипі стрептавідину. В одному аспекті аналіз резонансу поверхневого плазмону з використанням пептида, захопленого на мікрочипі стрептавідину, являє собою аналіз резонансу поверхневого плазмону, описаний у Прикладі нижче. В іншому аспекті аналіз резонансу поверхневого плазмону з використанням пептида, захопленого на мікрочипі стрептавідину, являє собою Метод А(і), описаний для аналізу SPR ТМ Biacore нижче. В альтернативному варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, зв'язується з βамілоїдним пептидом 1-40 з константою рівноваги 94734 8 KD меншою ніж 10 нМ, 1-40 з константою рівноваги KD меншою ніж 10 нM, але не зв'язується з βамілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NО:44), обидва визначення проведені за допомогою аналізу резонансу поверхневого плазмону, описаного нижче в Методі В Прикладів. В іншому альтернативному варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, яке зв'язується з βамілоїдним пептидом 1-40 з константою рівноваги KD меншою ніж 10 нM, і демонструє значення константи KD для зв'язування з β-амілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NО:44), у 1000 разів більше, ніж для пептиду 1-12 (SEQ ID NО:15), обидва визначення проведені за допомогою аналізу резонансу поверхневого плазмону, описаного нижче в Методі В Прикладів. В іншому альтернативному варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, яке зв'язується з βамілоїдним пептидом 1-40 з константою рівноваги KD меншою ніж 10 нM, і демонструє значення константи KD для зв'язування з β-амілоїдним пептидом 2-13 (SEQ ID NО:44), у 10000 разів більше, ніж для пептиду 1-12 (SEQ ID NО:15), обидва визначення проведені за допомогою аналізу резонансу поверхневого плазмону, описаного нижче в Методі В Прикладів. У варіанті даного винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом, що зв'язується з антигеном, та/або його похідним, яке зв'язується з β-амілоїдним пептидом і містить такі CDR: CDRH1: DNGMA (SEQ ID NО:1 ) CDRH2: FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID NО:2) CDRH3: GTWFAY (SEQ ID NО:3) в межах варіабельної ділянки людського важкого ланцюга, який походить з сімейства гена VH3 і: CDRL1: RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID NO:4) CDRL2: KVSNRFS (SEQ ID NО:5) CDRL3: SQTRHVPYT (SEQ ID NО:6) в межах варіабельної ділянки людського легкого ланцюга, який походить від послідовності амінокислот, показаної в статті GenPept CAA51135 (SEQ ID NО:24). В даній специфікації терміни "CDR", "CDRL1", "CDRL2", "CDRL3", "CDRH1", "CDRH2", "CDRH3" відповідають системі нумерації Kabat, як встановлено в Kabat et al; Sequences of proteins of Immunological Interest NIH, 1987. Таким чином наступне визначає CDR у відповідності до винаходу: CDR: Залишки CDRH1: 31-35B CDRH2: 50-65 CDRH3: 95-102 CDRL1: 24-34 CDRL2: 50-56 CDRL3: 89-97 Родина генів VH3 і пов'язана номенклатура генів імуноглобулінів описана в Matsuda et al (Journal of Experimental Medicine, 188:2151-2162, 1998) і Lefranc & Lefranc (The Immunoglobulin Factsbook. 9 2001. Academic Press: London). У конкретному варіанті варіабельна ділянка людського важкого ланцюга походить з: - V гена, вибраного з наступної підмножини членів родини VH3: VH3-48, VH3-21, VH3-11, VH37, VH3-13, VH3-74, VH3-64, VH3-23, VH3-38, VH353, VH3-66, VH3-20, VH3-9 & VH3-43 - V гена, вибраного з наступної підмножини членів родини VH3: VH3-48, VH3-21 & VH3-11 - Гена VH3-48 або його алеля. Послідовність на початку Genbank M99675 являє собою алель гена VH3-48. M99675 являє собою послідовність нуклеотидів Genbank геномного відрізку ДНК, який містить два екзона, які складають людський ген важкого ланцюга VH3-48 (SEQ ID NО:22) і кодують послідовність амінокислот варіабельної ділянки, наведену в SEQ ID NО:21. У конкретному аспекті структура людського важкого ланцюга акцептора походить від M99675. Для відтворення повної V-ділянки структура 4 повинна додаватися до зародкової лінії, яка кодує V-ген M99675. Придатні послідовності структури 4 включають таку, що кодується людським міні геном JH4 (Kabat): YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 23), чотири початкові залишки якого попадають у межі ділянки CDR3, яка замінена CDR, що надходить від донорського антитіла. Фахівцю в даній галузі буде зрозуміло, що ген V зародкової лінії і ген J не включають кодуючі послідовності для повного важкого ланцюга CDR3. Однак, в антитілах за винаходом послідовність CDR3 забезпечена донорським імуноглобуліном. Відповідно, комбінація гена VH, наприклад, VH3-48, мініген JH, наприклад, JH4, і набір важких ланцюгів CDR, наприклад, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 і SEQ ID NO: 3 (зібраний таким чином, щоб імітувати зрілу, повністю реорганізовану варіабельну ділянку важкого ланцюга) достатній, щоб визначити варіабельну ділянку важкого ланцюга за винаходом, наприклад, представлену в SEQ ID NO: 26, 28, 30. Варіабельна ділянка, кодована Genpept ID CAA51134, має послідовність амінокислот, наведену в SEQ ID NO: 24. Послідовність структури варіабельної ділянки легкого ланцюга, відома за GenPept ID CAA51134, являє собою відняту послідовність амінокислот повністю реорганізованої варіабельної ділянки легкого ланцюга та ідентична іншій послідовності амінокислот з такою ж структурою в базі даних: інвентарний номер Genpept S40356, і описаній в Klein, R., et al., Eur. J. Immunol. 23 (12), 3248-3262 (1993). ДНК, що кодує послідовність CAA51134, доступна як інвентарний номер Genbank X72467, дана як SEQ ID NO: 25. У конкретному аспекті винаходу структура людського важкого ланцюга акцептора походить від M99675 і мінігена JH4, і структура людського легкого ланцюга акцептора походить від CAA51135, необов'язково містить один або більше, наприклад, від одного до чотирьох, частіше від одного до трьох, замісників амінокислотних залишків, на базі відповідних залишків, знайдених в 94734 10 донорській ділянці VH, що має послідовність: SEQ ID NO: 17, і ділянці VL, що має послідовність: SEQ ID NO: 19, які зберігають повну або майже повну спорідненість зв'язування донорського антитіла по відношенню до β-амілоїдного пептиду. «Майже повна спорідненість зв'язування» означає, що терапевтичне антитіло демонструє як мінімум десятиразове зменшення спорідненості зв'язування в порівнянні з донорським антитілом. В більш конкретному аспекті структура людського важкого ланцюга акцептора, що походить від M99675 і JH4, містить від одного до чотирьох замісників залишків амінокислот, вибраних з положень 24, 48, 93 та/або 94 (нумерація Kabat). В більш конкретному аспекті винаходу структура людського важкого ланцюга акцептора, що походить від M99675 і JH4, включає такі залишки (або їх консервативні замісники): (i) Положення Залишок 93 V 94 S Або (іі) Положення Залишок 24 V 93 V 94 S Або (iii) Положення 48 93 94 Залишок І V S В одному варіанті винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, що містить ланцюг VH, який має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 26, 28 або 30, і ділянку VL, яка має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 32. В іншому варіанті винаходу запропоноване терапевтичне антитіло, яке включає важкий ланцюг, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 34, 36 або 38, і легкий ланцюг, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 40. В іншому варіанті винаходу запропонована фармацевтична композиція, що містить терапевтичне антитіло у відповідності до винаходу. У подальшому варіанті винаходу запропонований спосіб лікування пацієнта-людини, захворювання якого пов'язане з β-амілоїдним пептидом, який включає стадію введення вказаному пацієнту терапевтично ефективної кількості терапевтичного антитіла у відповідності до винаходу. Також запропоноване застосування терапевтичного антитіла у відповідності до винаходу у виробництві лікарських засобів для лікування захворювання, пов'язаного з β-амілоїдним пептидом. В іншому варіанті винаходу запропонований спосіб одержання терапевтичного антитіла у відповідності до винаходу, який спосіб включає експресію полінуклеотиду, що кодує антитіло, в клітині-хазяїні. В іншому варіанті винаходу запропонований 11 полінуклеотид, що кодує важкий ланцюг терапевтичного антитіла, який включає ланцюг VH, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 26, 28 або 30. В іншому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує легкий ланцюг терапевтичного антитіла, який включає ділянку VL, що має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 32. В іншому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує важкий ланцюг терапевтичного антитіла, який має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 34, 36 або 38. В іншому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує легкий ланцюг терапевтичного антитіла, який має послідовність, наведену в SEQ ID NO: 40. У конкретнішому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує важкий ланцюг терапевтичного антитіла, де полінуклеотид містить послідовність, наведену в SEQ ID NO: 35, 37, 39 або 42. В іншому конкретнішому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує легкий ланцюг терапевтичного антитіла, де полінуклеотид містить послідовність, наведену в SEQ ID NO: 41 або 43. У конкретному варіанті терапевтичне антитіло, яке є антитілом або фрагментом та/або його похідним, демонструє істотною мірою відсутність функцій а) активації комплементу класичним шляхом; і б) опосередкування антитіло-залежної клітинної цитотоксичності. В іншому варіанті винаходу запропоноване антитіло або його фрагмент, що включає ділянку VH, яка має послідовність: SEQ ID NO: 17, і ділянку VL, яка має послідовність: SEQ ID NO: 19. В іншому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує важкий ланцюг антитіла або його фрагмент, що включає ділянку VH, яка має послідовність SEQ ID NO: 17, зокрема, полінуклеотид SEQ ID NO: 18. В іншому варіанті винаходу запропонований полінуклеотид, що кодує легкий ланцюг антитіла або його фрагмент, що включає ділянку VL, яка має послідовність SEQ ID NO: 19, зокрема, полінуклеотид SEQ ID NO: 20. Детальний опис винаходу 1. Структури антитіл 1.1 Інтактні антитіла Інтактні антитіла звичайно являють собою гетеромультимерні глікопротеїни, що містять як мінімум два важких і два легких ланцюги. За винятком IgM, інтактні антитіла являють собою гетеротетрамерні глікопротеїни розміром приблизно 150 кДа, що складаються з двох ідентичних легких (L) ланцюгів і двох ідентичних важких (H) ланцюгів. Звичайно кожний легкий ланцюг зв'язаний з важким ланцюгом одним ковалентним дисульфідним зв'язком, тоді як кількість дисульфідних зв'язків між важкими ланцюгами різних ізотипів імуноглобуліну варіює. Кожен важкий і легкий ланцюг також містить внутрішньоланцюгові дисульфідні містки. Кожен важкий ланцюг містить на одному кінці варіабельну ділянку (VH), за якою слідує цілий ряд константних ділянок. Кожен легкий лан 94734 12 цюг містить варіабельну ділянку (VL) і константну ділянку на іншому кінці; константна ділянка легкого ланцюга вирівняна з першою константною ділянкою важкого ланцюга, і варіабельна ділянка легкого ланцюга вирівняна з варіабельною ділянкою важкого ланцюга. Легкі ланцюги антитіл від більшості видів хребетних можуть бути віднесені до одного з двох типів, які називаються Капа і Лямбда, на базі послідовності амінокислот константної ділянки. В залежності від послідовності амінокислот константної ділянки важких ланцюгів, людські антитіла можуть бути віднесені до п'яти різних класів, IgA, IgD, IgE, IgG і IgM. IgG і IgA можуть далі поділятися на підкласи IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4; та IgA1 і IgA2. Існують варіанти видів від мишей і щурів, що містять як мінімум IgG2a, IgG2b. Варіабельна ділянка антитіла визначає специфічність зв'язування антитіла з певними ділянками, що демонструють специфічну варіабельність і називаються ділянками визначення комплементарності (CDR). Більш консервативні частини варіабельної ділянки називаються структурними ділянками (FR). Кожна варіабельна ділянка інтактних важких і легких ланцюгів містить чотири FR, з’єднані трьома CDR. CDR в кожному ланцюгу утримуються разом поблизу ділянок FR і з CDR від іншого ланцюга сприяють утворенню місця зв'язування антитіл з антигеном. Константні ділянки безпосередньо не залучаються до зв'язування антитіла з антигеном, але виявляють різні ефекторні функції, наприклад, участь у залежній від антитіла клітинно-опосередкованій цитотоксичності (ADCC), фагоцитозі через зв'язування з рецептором Fcγ, швидкості напіввиведення/кліренсу через рецептор Fc новонароджених (FcRn) і залежній від комплементу цитотоксичності через компонент C1q каскаду комплементу. Людська константна ділянка lgG2 має недостатню здатність активувати комплемент класичним шляхом або опосередковувати залежну від антитіл клітинну цитотоксичність. Константна ділянка lgG4 має недостатню здатність активувати комплемент класичним шляхом і лише слабко опосередковує залежну від антитіл клітинну цитотоксичність. Антитіла, що по суті мають дефіцит таких ефекторних функцій, можуть називатися ―нездатними до лізису‖ антитілами. 1.1.1 Людські антитіла Людські антитіла можуть бути продуковані рядом способів, відомих спеціалістам у даній галузі. Людські антитіла можуть бути отримані способом гібридоми, в якому застосовують людську мієлому або лінії клітин гетеро мієломи миші або людини, див. Kozbor J. Immunol 133, 3001, (1984) та Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp 51-63 (Marcel Dekker Inc, 1987). Альтернативні способи включають застосування бібліотек фага або трансгенних мишей, в обох використовують набори людських V ділянок (див. Winter G, (1994), Annu. Rev. lmmunol 12,433-455, Green LL (1999), J. Immunol. Methods 231, 11-23). Існують декілька порід трансгенних мишей, у яких місцеположення імуноглобуліну миші замінені людськими сегментами гена імуноглобуліну (див. Tomizuka K, (2000) PNAS 97, 722-727; Fishwild D.M 13 (1996) Nature Biotechnol. 14, 845-851, Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15,146-156). Після антигенної стимуляції такі миші здатні виробляти набір людських антитіл, з яких можуть бути вибрані цільові антитіла. Особливо слід відзначити систему Trimera (див. Eren R et al., (1998) Immunology 93:154-161), де людські лімфоцити пересаджені опроміненим мишам, Система Відбору Антитіла Лімфоцита (SLAM, див. Babcook et al, PNAS (1996) 93:78437848), де людські (або інших видів) лімфоцити ефективно об'єднані в процедурі генерації антитіла in vitro, після якої провели обмежуюче розведення і процедуру відбору і Xenomouse ІІ (Abgenix Inc). Альтернативний підхід доступний від Morphotek Inc, де застосовують технологію Morphodoma. Технологія показу фага може застосовуватися для одержання людських антитіл (та їх фрагментів), див. McCafferty; Nature, 348, 552-553 (1990) і Griffiths AD et al (1994) EMBO 13: 3245-3260. У відповідності до цієї техніки гени ділянки антитіла V клонують у структурі в більшому або меншому шарі гена білка волоконного бактеріофага, наприклад, M13 або fd і показують (звичайно з допомогою допоміжного фага) як функціональні фрагменти антитіла на поверхні частинки фага. Відбір, заснований на функціональних властивостях антитіла, призводить до виділення гена, що кодує антитіло, яке виявляє такі властивості. Техніка показу фага може застосовуватися для вибору антитіл, специфічних до антигену, з бібліотек, отриманих з людських клітин B, одержаних від осіб із захворюванням або розладом, описаним вище, або альтернативно від не імунізованих людських донорів (див. Marks; J. Mol. Bio. 222, 581-597, 1991). Якщо потрібне інтактне людське антитіло, яке містить ділянку Fc, необхідно переробити показаний одержаний фрагмент фага в ссавцеві вектори експресії, що включають бажані константні ділянки і встановлюють стабільні лінії експресуючих клітин. Техніка дозрівання спорідненості (Marks; Bio/technol 10, 779-783 (1992)) може використовуватися для покращення спорідненості зв'язування, де спорідненість первинного людського антитіла покращують послідовною заміною V ділянок ланцюга H і L варіантами, які зустрічаються в природі, і відбором на підставі покращеної спорідненості зв'язування. Також існують варіанти даної техніки, наприклад, "віддруковування епітопа", див. WO 93/06213. Див. також Waterhouse; Nucl.Acids Res 21, 2265-2266 (1993). 1.2 Химерні та гуманізовані антитіла Застосування інтактних нелюдських антитіл у лікуванні людських захворювань або розладів приносить з собою добре відомі проблеми потенційної імуногенності, особливо при повторному введенні антитіла, яке імунною системою пацієнта може розпізнаватися як чужорідне нелюдське інтактне антитіло і викликати реакцію нейтралізації. На додаток до розробки повністю людських антитіл (див. вище) різні методи були розроблені за минулі роки з метою подолання вказаних проблем і загального зменшення вмісту нелюдських послі 94734 14 довностей амінокислот в інтактному терапевтичному антитілі при збереженні відносної простоти одержання нелюдських антитіл від імунізованої тварини, наприклад, миші, щура або кролика. Широко застосовують два підходи для досягнення цього. Перший являє собою химерні антитіла, які загалом містять нелюдську варіабельну ділянку (гризуна, наприклад, миші), приєднану до людської константної ділянки. Внаслідок того, що місцеположення прикріплення антигену до антитіла знаходиться в межах варіабельних ділянок, химерне антитіло зберігає свою спорідненість зв'язування з антигеном, але набуває ефекторних функцій людської константної ділянки, і таким чином може виконувати ефекторні функції, наприклад, описані вище. Химерні антитіла звичайно одержують з застосуванням методів рекомбінантної ДНК. ДНК, що кодує антитіла (наприклад, кДНК), ізольована і впорядкована з допомогою звичайних процедур (наприклад, олігонуклеотидних зондів, здатних до специфічного зв'язування з генами, що кодують варіабельні ділянки ланцюгів H і L антитіла за винаходом, наприклад, ДНК SEQ ID NO: 18 і 20, описані вище). Клітини гібридоми використовують як типове джерело такої ДНК. Виділену ДНК розміщують у векторах експресії, які потім трансфікують в клітини-хазяї, наприклад, E. coli, клітини COS, клітини CHO, клітини PerC6 або клітини мієломи, які інакше не продукують білок імуноглобуліну, щоб забезпечити синтез антитіла. ДНК може бути модифікована заміною послідовності, що кодує людські ланцюги L і H, на відповідні нелюдські (наприклад, мишачі) константні ділянки H і L, див. наприклад, Morrison, PNAS 81, 6851 (1984). Тому в іншому варіанті винаходу запропоноване химерне антитіло, що містить ділянку VH, яка має послідовність: SEQ ID NO: 17, і ділянку VL, яка має послідовність: SEQ ID NO: 19, приєднану до людської константної ділянки (яка може бути IgG ізотипу, наприклад, IgG1). Другий підхід включає одержання гуманізованих антитіл, де вміст нелюдських антитіл зменшений шляхом гуманізації варіабельних ділянок. Два методи гуманізації здобули популярність. Перший являє собою гуманізацію щепленням CDR. CDR утворюють петлі близько до N-кінця антитіла, де вони формують поверхню, вставлену в каркас, утворений рамковими ділянками. Специфічність зв'язування антигену з антитілом переважно визначається топографією і хімічними характеристиками поверхні його CDR. Вказані особливості, в свою чергу визначаються конформацією індивідуальних CDR, відносною диспозицією CDR, і природою та диспозицією залишків бічних ланцюгів, які містять CDR. Істотне зменшення імуногенності може бути досягнуте трансплантацією тільки CDR не людських (наприклад, мишачих) антитіл ("донорських" антитіл) на придатну структуру людини ("структуру акцептора") і константні ділянки (див. Jones et al (1986) Nature 321, 522-525 and Verhoeyen M et al (1988) Science 239, 1534-1536). Однак, CDR, прищеплений у чистому вигляді, можливо, не приведе до повного збереження властивостей зв'язування з антигеном, і часто виявляється, що деякі залишки структури донорського 15 антитіла необхідно зберегти (іноді їх називають "зворотними мутаціями") в гуманізованій молекулі, якщо спорідненість зв’язування з антигеном має бути істотною мірою відновлена (див. Queen C et al (1989) PNAS 86, 10,029-10,033, Co, M et al (1991) Nature 351, 501-502). В даному випадку, людські V ділянки, що демонструють найбільшу гомологічність послідовності, (звичайно 60 % або більше) до нелюдського донорського антитіла, можуть бути вибрані з бази даних для того, щоб запропонувати людську структуру (FR). Виділення людських FR може проводитися або на базі людського консенсусу, або з індивідуальних людських антитіл. Якщо необхідно, ключові залишки донорського антитіла замінюють на структуру людського акцептора, щоб зберегти конформації CDR. Комп'ютерне моделювання антитіла можна використовувати, щоб допомогти ідентифікувати такі структурно важливі залишки, див. WO99/48523. Альтернативно, гуманізації можна досягти способом "маскування". Статистичний аналіз варіабельних ділянок важких і легких ланцюгів унікального людського і мишачого імуноглобуліну виявив, що точні зразки залишків, які вступають в контакт, є різними в людських і мишачих антитілах, і найбільш індивідуальні зовнішні положення мають виражену перевагу для невеликої кількості різних залишків (див. Padlan E. A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498 та Pedersen J.T. et al (1994) J. Mol. Biol. 235; 959-973). Таким чином, можна зменшити імуногенність нелюдського Fv, замінюючи залишки, які вступають в контакт, в його структурних ділянках, які відрізняються від залишків, які звичайно знаходять в людських антитілах. Оскільки антигенність білка може корелювати із доступністю поверхні, заміна зовнішніх залишків може бути достатньою, щоб зробити варіабельну ділянку миші "невидимою" для людської імунної системи (див. також Mark G. E. et al (1994) в Handbook of Experimental Pharmacology vol. 113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, SpringerVerlag, pp 105-134). Дана процедура гуманізації позначається як "маскування", оскільки тільки поверхня антитіла змінюється, підтримуючі залишки залишаються непорушеними. Подальші альтернативні підходи включають такі, як встановлено в WO04/006955 і процедурі Humaneering (Kalobios), в якій використовують бактеріальні системи експресії і продукують антитіла, які близькі до людської зародкової лінії за послідовністю (Alfenito-M Advancing Protein Therapeutics January 2007, San Diego, California). Фахівцям в даній галузі буде зрозуміло, що термін "похідне" призначений для визначення не тільки джерела в значенні фізичного походження матеріалу, але також для визначення матеріалу, який є структурно ідентичним матеріалу, але який не походить з даного джерела. Тому "залишки, знайдені в донорському антитілі" не обов'язково виділені з донорського антитіла. Добре відомо в даній галузі, що певні заміни амінокислот оцінюються як "консервативні". Амінокислоти поділяються на групи за властивостями бічних ланцюгів, і заміни в межах груп, які дозволяють зберегти повну або майже повну спорідне 94734 16 ність зв'язування терапевтичного антитіла за винаходом, називають консервативними замінами, див. табл. 1 нижче: Таблиця 1 Бічний ланцюг Гідрофобний Нейтральний гідрофільний Кислотний Основний Залишки, які впливають на орієнтацію ланцюга Ароматичний Члени met, ala, val, leu, ile cys, ser, thr asp, glu asn, gin, his, lys, arg gly, pro trp, tyr, phe 1.3 Антитіла з подвійною специфічністю Антитіло з подвійною специфічністю є похідним антитіла, яке володіє специфічністю зв'язування як мінімум по відношенню до двох різних епітопів і також складає частину винаходу. Способи одержання таких антитіл відомі в даній галузі. Традиційно рекомбінантне продукування антитіл з подвійною специфічністю засноване на одночасній експресії двох H-ланцюгових і L-ланцюгових пар імуноглобуліну, де два ланцюги H мають різну специфічність зв'язування, див. Millstein et al, Nature 305 537-539 (1983), WO93/08829 і Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659. З використанням випадкового асортименту ланцюгів H і L одержують потенційну суміш десяти різних структур антитіла, з яких тільки одна має бажану специфічність зв'язування. Альтернативний підхід включає приєднання варіабельних ділянок з бажаною специфічністю зв'язування до константної ділянки важкого ланцюга, що включає як мінімум частину шарнірної ділянки, ділянок CH2 і CH3. Переважно мати ділянку CH1, що містить сайт, необхідний для зв'язування з легким ланцюгом, присутній як мінімум в одному з продуктів злиття. ДНК, що кодує такі продукти злиття, і при бажанні ланцюг L вставляють в окремі вектори експресії і потім співтрансфікують в придатний організм хазяїна. Це можливо з метою вставки кодуючих послідовностей двох або всіх трьох ланцюгів в один вектор експресії. В одному з переважних підходів антитіло з подвійною специфічністю складається з ланцюга H з першою специфічністю зв'язування на одному плечі і пари ланцюгів H-L, яка забезпечує другу специфічність зв'язування на іншому плечі, див. WO94/04690. Див. також Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986. Доставка терапевтичних білків до мозку ускладнена присутністю гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ). Якщо бажано доставити антитіло за винаходом або фрагмент антитіла за винаходом крізь ГЕБ, запропоновані різноманітні стратегії збільшення такої доставки при необхідності. Для одержання необхідних поживних речовин і факторів з крові ГЕБ має деякі специфічні рецептори, які транспортують сполуки з циркулюючої крові до мозку. Дослідження показали, що деякі сполуки, подібні до інсуліну (див. Duffy KR et al (1989) Brain Res. 420:32-38), трансферину (див. Fishman JB et al (1987) J. Neurosci 18:299-304) та інсулін-подібні фактори росту 1 і 2 (див. Pardridge 17 WM (1986) Endocrine Rev. 7: 314-330 і Duffy KR et al (1986) Metabolism 37:136-140) перетинають ГЕБ шляхом опосередкованого рецептором трансцитозу. Рецептори для вказаних молекул, таким чином, забезпечують потенційні засоби доступу терапевтичних антитіл за винаходом до мозку, із застосуванням так званих "спрямованих" антитіл (див. Pardridge WM (1999) Advanced Drug Delivery Review 36:299-321). Наприклад, показано, що антитіло до трансферинового рецептора динамічно транспортується в паренхіму мозку (див. Friden PM et al (1991) PNAS 88:4771-4775 і Friden PM et al (1993) Science 259:373-377). Тому один з потенційних підходів являє собою продукування антитіла з подвійною специфічністю або фрагмента з подвійною специфічністю, наприклад, описаного вище, де перша специфічність спрямована і друга специфічність спрямована на транспортний рецептор, розміщений у ГЕБ, наприклад, друга специфічність спрямована на транспортний рецептор трансферину. 1.4 Фрагменти антитіла У деяких варіантах винаходу пропонується терапевтичне антитіло, яке є фрагментом, що зв'язується з антигеном. Такі фрагменти можуть бути функціональними фрагментами, що зв'язуються з антигеном, інтактних та/або гуманізованих та/або химерних антитіл, наприклад, фрагментами Fab, 1 Fd, Fab , F(ab')2, Fv, ScFv антитіл, описаних вище. Фрагменти, що мають недостатньо константних ділянок, мають невелику здатність активувати комплемент класичним шляхом або опосередковувати залежну від антитіл клітинну цитотоксичність. Традиційно такі фрагменти утворюються при протеолітичному розщепленні інтактних антитіл, наприклад, при папаїновому розщепленні (див. наприклад, WO 94/29348), але можуть вироблятися безпосередньо трансформованими рекомбінантним шляхом клітинами-хазяями. Щодо продукування ScFv див. Bird et al; (1988) Science, 242, 423426. Крім того, фрагменти антитіла можуть бути продуковані за допомогою різноманітних генноінженерних методів, як описано нижче. Схоже, що фрагменти Fv мають нижчу енергію взаємодії їх двох ланцюгів, ніж фрагменти Fab. Для стабілізації асоціації ділянок VH і VL вони зв'язані пептидними зв’язками (Bird et al, (1988) Science 242, 423-426, Huston et al, PNAS, 85, 58795883), дисульфідними містками (Glockshuber et al, (1990) Biochemistry, 29, 1362-1367) і мутаціями "опуклість в отворі" (Zhu et al (1997), Protein Sci., 6, 781-788). Фрагменти ScFv можуть бути продуковані за способами, добре відомими фахівцям в даній галузі, див. Whitlow et al (1991) Methods companion Methods Enzymol, 2, 97-105 і Huston et al (1993) Int.Rev. Immunol 10, 195-217. ScFv може бути продукований в бактеріальних клітинах, наприклад, E. coli, але частіше продукується в еукаріотних клітинах. Одним з недоліків ScFv є одновалентність продукту, яка перешкоджає збільшенню авідності за рахунок багатовалентного зв'язування, і їх короткий період напіввиведення. Спроби вирішення цих проблем включають двохвалентний (ScFv')2, одержаний з ScFV, що містить додатковий Скінцевий цистеїн, хімічним сполученням (Adams et 94734 18 al (1993) Can. Res 53, 4026-4034 and McCartney et al (1995) Protein Eng. 8, 301-314) або спонтанною сайт-специфічною димеризацією ScFv, що містить непарний С-кінцевий залишок цистеїну (див. Kipriyanov et al (1995) Cell. Biophys 26, 187-204). Альтернативно, можна стимулювати утворення мультимерів ScFv вкороченням пептидного лінкера між 3 і 12 залишками, щоб утворити "димерні" антитіла, див. Holliger et al PNAS (1993), 90, 64446448. Вкорочення лінкера надалі може призводити до утворення тримерів ScFV ("тримерних антитіл", див. Kortt et al (1997) Protein Eng, 10, 423-433) і тетрамерів ("тетрамерних антитіл", див. Le Gall et al (1999) FEBS Lett, 453, 164-168). Конструкція двовалентних молекул ScFV також може бути забезпечена генетичним злиттям з фрагментами димеризації білка з утворенням "мініантитіл" (див. Pack et al (1992) Biochemistry 31, 1579-1584) і "мінітіл" (див. Hu et al (1996), Cancer Res. 56, 30553061). ScFv-Sc-Fv тандеми ((ScFV)2) також можуть бути одержані зв'язуванням двох одиниць ScFv третім пептидним зв'язком, див. Kurucz et al (1995) J.lmmol.154, 4576-4582. Димерні антитіла з подвійною специфічністю можуть бути продуковані шляхом не ковалентної асоціації двох одиничних продуктів злиття ланцюгів, що складаються з ділянки VH одного антитіла, сполученої коротким лінкером з ділянкою VL іншого антитіла, див. Kipriyanov et al (1998), Int. J. Can 77, 763-772. Стабільність таких димерних антитіл з подвійною специфічністю може бути збільшена введенням дисульфідних містків або мутаціями "опуклість в отворі", як описано вище, або утворенням димерних антитіл з одним ланцюгом (ScDb), де два гібридні фрагменти ScFv сполучені пептидним зв'язком, див. Kontermann et al (1999) J. Immunol. Methods 226 179-188. Тетравалентні молекули з подвійною специфічністю доступні, наприклад, шляхом злиття фрагмента ScFv з ділянкою CH3 молекули IgG або з фрагментом Fab через шарнірну ділянку, див. Coloma et al (1997) Nature Biotechnol. 15, 159-163. Альтернативно, тетравалентні молекули з подвійною специфічністю утворюють злиттям димерних антитіл з одним ланцюгом з подвійною специфічністю (див. Alt et al, (1999) FEBS Lett 454, 90-94. Менші тетравалентні молекули з подвійною специфічністю також можуть бути утворені за допомогою димеризації або тандемів ScFv-ScFv за допомогою лінкера, що містить фрагмент спіраль-петля-спіраль (мініантитіла DiBi, див. Muller et al (1998) FEBS Lett 432, 45-49), або молекули з одного ланцюга, що включає чотири варіабельні ділянки антитіла (VH і VL) в орієнтації, яка не допускає утворення внутрішньомолекулярних пар (тандемне димерне антитіло, див. Kipriyanov et al, (1999) J. Mol. Biol. 293, 41-56). Фрагменти F(ab')2 з подвійною специфічністю можуть бути утворені хімічним з'єднанням фрагментів Fab' або гетеродимеризацією за допомогою лейцинової ―блискавки‖ (див. Shalaby et al, (1992) J. Exp. Med. 175, 217-225 і Kostelny et al, (1992), J. Immunol. 148, 1547-1553). Також доступні ізольовані ділянки VH і VL, див. US 6, 248, 516; US 6, 291, 158; US 6, 172, 197. 1.5 Гетерокон’югатні антитіла Гетерокон’югатні антитіла являють собою по 19 хідні, які також утворюють варіант даного винаходу. Гетерокон’югатні антитіла складаються з двох ковалентно з’єднаних антитіл, утворених будьякими придатними способами поперечного зшивання. Див. США 4, 676, 980. 1.6 Інші модифікації. Вважається, що взаємодія між ділянкою Fc антитіла і різними Fc рецепторами (FcγR) опосередковує ефекторні функції антитіла, які включають залежну від антитіл клітинну цитотоксичність (ADCC), фіксацію комплементу, фагоцитоз і період напіввиведення/кліренс антитіла. Різноманітні модифікації ділянки Fc антитіл за винаходом можуть здійснюватися в залежності від бажаної ефекторної властивості. Зокрема, людські константні ділянки, яким по суті не вистачає функцій а) активації комплементу класичним шляхом; і б) опосередкування залежної від антитіл клітинної цитотоксичності, включають константну ділянку lgG4, константну ділянку lgG2 і константні ділянки IgG1, що містять специфічні мутації, наприклад, мутації в положеннях 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 та/або 322, розкриті в EP0307434 (WO8807089), EP 0629 240 (WO9317105) і WO 2004/014953. Окремо описано, що мутації в залишках 235 або 237 в межах ділянки CH2 константної ділянки важкого ланцюга (нумерація Kabat; Індексна система ЄС), зменшують зв'язування з FcγRI, FcγRII і зв'язування FcγRIII і, таким чином, зменшують залежну від антитіл клітинну цитотоксичність (ADCC) (Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51; 1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161- 12168). Надалі, в деяких звітах також описано залучення деяких з цих залишків до рекрутингу або сприяння залежній від комплементу цитотоксичності (CDC) (Morgan et al., 1995; Xu et al., Cell. Immunol. 2000; 200:16-26; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168). Залишки 235 і 237 видозмінювалися до залишків аланіну (Brett et al. Immunology 1997, 91; 346-353; Bartholomew et al. Immunology 1995, 85; 41-48; і WO9958679) щоб зменшити як опосередковані комплементом, так і FcγR-опосередковані ефекти. Антитіла, що містять вказані константні ділянки, можна називати ‖нелітичними‖ антитілами. Можна включити епітоп зв'язування ―рятувального‖ рецептора в антитіло, щоб збільшити період напіввиведення з сироватки, див. США 5,739,277. Існує п'ять визначених людських Fcγ рецепторів, FcγR (I), FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa і FcRn новонароджених. Shields et al, (2001) J. Biol. Chem 276, 6591-6604 продемонстрували, що розповсюджений набір залишків IgG1 залучений до зв'язування всіх FcγR, тоді як FсγRII і FcγRIII використовують окремі сайти поза межами даного звичайного набору. Одна група залишків IgG1 зменшувала зв'язування з усіма FcγR при заміні на аланін: Pro-238, Asp-265, Asp-270, Asn-297 і Pro-239. Всі знаходяться в ділянці IgG CH2 і збираються біля шарніра, який об’єднує CH1 і CH2. Тоді як FcγRI використовує тільки розповсюджений набір залишків IgG1 94734 20 для зв'язування, FcγRII і FcγRIII взаємодіють з окремими залишками на додаток до розповсюдженого набору. Зміна деяких залишків зменшувала зв'язування тільки з FcγRII (наприклад, Arg292) або FcγRIII (наприклад, Glu-293). Деякі варіанти показали збільшення зв'язування з FcγRIIабо FcγRIII, але не впливали на зв'язування з іншим рецептором (наприклад, Ser-267Ala підсилював зв'язування з FcγRII, але зв'язування з FcγRIII не змінювалося). Інші варіанти продемонстрували підсилення зв'язування з FcγRII або FcγRIII із зменшенням зв'язування з іншим рецептором (наприклад, Ser-298Ala поліпшив зв'язування з FcγRIII і зменшив зв'язування з FcγRII). Для FcγRIIIa кращі варіанти зв'язування IgG1 об'єднали заміни на аланін в Ser-298, Glu-333 і Lys-334. Вважається, що рецептор FcRn новонароджених залучений до захисту молекул IgG від деградації і таким чином збільшує період напіввиведення з сироватки і трансцитоз через тканини (див. Junghans R. P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 і Ghetie et al (2000) Annu. Rev. lmmunol. 18, 739-766). Визначено, що людські залишки IgG1, які взаємодіють безпосередньо з людським FcRn, включають Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 і His435. Терапевтичне антитіло за винаходом може об'єднувати будь-яку із згаданих вище модифікацій константної ділянки. У конкретному варіанті терапевтичне антитіло по суті має дефіцит функцій а) активації комплементу класичним шляхом; і б) опосередкування антитіло-залежної клітинної цитотоксичності. В більш конкретному варіанті даний винахід пропонує терапевтичні антитіла за винаходом, які містять будь-яку одну (або більше) змін залишків, деталізованих вище, щоб змінити функції періоду напіввиведення/кліренсу та/або ефектора, наприклад, ADCC та/або комплемент-залежну цитотоксичність та/або лізис комплементу. У подальшому аспекті даного винаходу терапевтичне антитіло містить константну ділянку ізотипу людського IgG1 із замінами на аланін (або інший розрив) у положеннях 235 (наприклад, L235A) і 237 (наприклад, G237A) (нумерація у відповідності з схеми ЄС, показана в Kabat). Інші похідні за винаходом включають варіанти глікозилювання антитіл за винаходом. Відомо, що глікозилювання антитіл в консервативних положеннях в їх константних ділянках має глибокий вплив на функції антитіла, особливо на функцію ефектора, наприклад, описані вище, див. Boyd et al (1996), Mol. Immunol. 32, 1311-1318. Розглядаються варіанти глікозилювання терапевтичних антитіл за даним винаходом, де один вуглеводний фрагмент або більше доданий, замінений, видалений або змінений. Введення фрагменту аспарагін-Х-серин або аспарагін-Х-треонін створює потенційний сайт для ферментного прикріплення вуглеводних фрагментів і, таким чином, може використовуватися для маніпуляції глікозилюванням антитіла. У Raju et al (2001) Biochemistry 40, 88688876 кінцевий вміст сіалової кислоти імуноадгезії TNFR-IgG був збільшений за допомогою процесу повторного введення галактози та/або сіалової кислоти із застосуванням бета-1, 4 21 галактосилтрансферази та/або альфа,2,3сіалілтрансферази. Вважається, що збільшення кінцевого вмісту сіалової кислоти збільшує період напіввиведення імуноглобуліну. Антитіла, сукупно з більшістю глікопротеїнів, звичайно утворюються в природі як суміш глікоформ. Дана суміш особливо помітна, коли антитіла продукуються в еукаріотних, особливо ссавцевих клітинах. Розроблені різні способи одержання певних глікоформ, див. Zhang et al Science (2004), 303, 371, Sears et al, Science, (2001) 291, 2344, Wacker et al (2002) Science, 298 1790, Davis et al (2002) Chem.Rev. 102, 579, Hang et al (2001) Acc.Chem. Res 34, 727. Тому винахід стосується великої кількості терапевтичних антитіл (які можуть бути IgG ізотипу, наприклад, IgG1), як описано в даному описі, що включає певну кількість (наприклад, 7 або менше, наприклад, 5 або менше, як наприклад, два або один) глікоформ вказаних антитіл. Похідні у відповідності до винаходу також включають терапевтичні антитіла за винаходом, зв'язані з небілковим полімером, наприклад, поліетиленгліколем (ПЕГ), поліпропіленгліколем або поліоксиалкіленом. З'єднання білків з ПЕГ являє собою встановлену техніку збільшення періоду напіввиведення білків, а також зменшення антигенності та імуногенності білків. Застосування ПЕГілювання з різною молекулярною масою і формами (лінійною або розгалуженою) досліджене з інтактними антитілами, а також з фрагментами 1 Fab , див. Koumenis I. L. et al (2000) Int.J.Pharmaceut. 198:83-95. Конкретний варіант включає фрагмент зв’язування антигену за винаходом без функцій ефектора а) активації комплементу класичним шляхом; і б) опосередкування антитіло-залежної клітинної цитотоксичності; (наприклад, фрагмент Fab або scFv) зв'язаний з ПЕГ. 2. Способи одержання Антитіла за даним винаходом можна продукувати в трансгенних організмах, наприклад, козах (див. Pollock et al (1999), J. Immunol. Methods 231:147-157), курчатах (див. Morrow KJJ (2000) Genet.Eng.News 20:1-55), мишах (див. Pollock et al ibid) або рослинах (див. Doran PM, (2000) Curr.Opinion Biotechnol. 11, 199-204, Ma JK-C (1998), Nat.Med. 4; 601-606, Baez J et al, BioPharm (2000) 13: 50-54, Stoger E et al; (2000) Plant Mol. Biol. 42:583-590). Антитіла також можна одержувати хімічним синтезом. Однак, антитіла за винаходом звичайно одержують з застосуванням технології культивування рекомбінантних клітин, добре відомої фахівцям в даній галузі. Полінуклеотид, що кодує антитіло, виділяють і вставляють у вектор відтворення, наприклад, плазмідний, для подальшого розповсюдження або експресії в клітиніхазяїні. Одна придатна система експресії являє собою глутамат-синтетазну систему (наприклад, ту, що продається Lonza Biologies), особливо, якщо клітина-хазяїн являє собою CHO або NSO (див. нижче). Полінуклеотид, що кодує антитіло, легко виділяють і впорядковують за допомогою звичних процедур (наприклад, олігонуклеотидних зондів). Вектори, які можна застосовувати, включають плазміди, віруси, фаги, транспозони, мініхромосоми, плазміди яких являють собою типовий варіант. 94734 22 Загалом такі вектори додатково включають сигнальну послідовність, джерело реплікації, один або більше маркерних генів, підсилюючий елемент, промотор і послідовності закінчення транскрипції, функціонально зв'язані з легким та/або важким ланцюгом полінуклеотиду, щоб полегшити експресію. Полінуклеотид, що кодує легкі і важкі ланцюги, може бути вставленим в окремі вектори і введеним (наприклад, перетворенням, трансфекцією, електропорацією або трансдукцією) в ту саму клітину-хазяїн конкурентно або послідовно, або при бажанні як важкий, так і легкий ланцюг можна ввести в один і той же вектор до такого введення. Фахівцям у даній галузі буде зрозуміло, що за рахунок надмірності генетичного коду також доступні полінуклеотиди, альтернативні показаним в даному описі, які будуть кодувати поліпептиди за винаходом. 2.1 Сигнальні послідовності Антитіла у відповідності до даного винаходу можуть продукуватися як гібридний білок з різнорідною сигнальною послідовністю, що містить специфічний сайт розщеплювання на N-кінці зрілого білка. Сигнальна послідовність повинна розпізнаватися і оброблятися клітиною-хазяїном. Для прокаріотних клітин-хазяїв сигнальною послідовністю може бути лужна фосфатаза, очищений фермент або стійкі до нагрівання лідерні ентеротоксини IІ. Для секреції в дріжджах сигнальні послідовності можуть являти собою лідерні інвертази дріжджів, лідерний фактор α або кислотні лідерні фосфатази, див. наприклад, WO90/13646. У системах клітин ссавців доступні вірусні лідери виділень, як наприклад, сімплексний сигнал gD лишаю і природні сигнальні послідовності імуноглобуліну (наприклад, людський важкий ланцюг Ig). Звичайно сигнальна послідовність зв’язана в структурі зчитування з полінуклеотидом, що кодує антитіло за винаходом. 2.2 Джерело реплікації Джерело реплікації добре відоме фахівцям у даній галузі з pBR322, є придатним для більшості грамнегативних бактерій, 2µ плазмід для більшості дріжджів, і різноманітного вірусного походження, наприклад, SV40, поліома, аденовірус, VSV або BPV для більшості ссавцевих клітин. Загалом, джерело SV40 компоненту реплікації не потрібне для об'єднаних ссавцевих векторів експресії. Однак, джерело SV40 може бути включене, оскільки воно містить ранній промотор. 2.3 Селекційний маркер Типові селекційні гени кодують білки, які (a) забезпечують резистентність до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампициліну, неоміцину, метотрексату або тетрацикліну або (б) поповнюють дефіцит ауксотрофних речовин або постачають поживні речовини, недоступні в комплексних середовищах, або (c) поєднують обидві властивості. Схема селекції може включати затримку росту клітин-хазяїв, які не містять вектора або векторів. Клітини, які успішно перетворені генами, що кодують терапевтичне антитіло у відповідності до даного винаходу, виживають завдяки, наприклад, резистентності до лікарських засобів, яку забезпечує одержаний разом з ними селекційний маркер. 23 Один з прикладів являє собою систему селекції DHFR, де трансформовані клітини генеруються в негативних штамах-хазяях DHFR (наприклад, див. Page and Sydenham 1991 Biotechnology 9: 64-68). У даній системі ген DHFR доставляється разом з послідовностями полінуклеотиду антитіла за винаходом і DHFR-позитивними клітинами, потім відбирається видаленням нуклеозиду. При необхідності інгібітор DHFR метотрексат також використовується для селекції трансформованих клітин з ампліфікацією гена DHFR. Функціональне зв’язування гена DHFR з антитілом, що кодує послідовності за винаходом або їх функціональні похідні, ампліфікація гена DHFR призводить до супутньої ампліфікації бажаних послідовностей цільового антитіла. Клітини CHO являють собою особливо цінну лінію клітин для даного відбору DHFR/метотрексатом і способів ампліфікації і відбору клітин-хазяїв із застосуванням системи DHFR, добре відомі фахівцям у даній галузі, див. Kaufman R.J. et al J. Mol. Biol. (1982) 159, 601-621, огляд див. у Werner RG, Noe W, Kopp K.Schluter M, "Appropriate mammalian expression systems for biopharmaceuticals", Arzneimittel-Forschung. 48(8):870-80, 1998 Aug. Наступний приклад являє собою систему експресії глутаматсинтетази (Bebbington et al Biotechnology 1992 Vol 10 p169). Придатний селекційний ген для застосування в дріжджах являє собою ген trp1; див. Stinchcomb et al Nature 282, 38, 1979. 2.4 Промотори Придатні промотори для експресії антитіл за винаходом функціонально зв'язують з ДНК/полінуклеотидом, що кодує антитіло. Промотори для прокаріотних хазяїв включають промотор phoA, бета-лактамазу і системи промоторів лактози, лужну фосфатазу, триптофан і гібридні промотори, наприклад, Tac. Промотори, придатні для експресії в клітинах дріжджів, включають 3фосфогліцераткіназу або інші гліколітичні ферменти, наприклад, енолазу, гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназу, гексокіназу, піруватдекарбоксилазу, фосфофруктокіназу, 6-фосфатізомеразу глюкози, 3-фосфогліцерат-мутазу і глюкокіназу. Промотори, які індукують дріжджі, включають алкогольдегідрогеназу 2, ізоцитохром C, кислотну фосфатазу, металотіонеїн і ферменти, відповідальні за метаболізм азоту або утилізацію мальтози/галактози. Промотори експресії в системах ссавцевих клітин включають промотори РНК полімерази IІ, зокрема, вірусні промотори, наприклад, поліому, оспу-дифтерит птахів і аденовіруси (наприклад, аденовірус 2), вірус бичачої папіломи, вірус пташиної саркоми, цитомегаловірус (зокрема, негайний ранній промотор гена), ретровірус, вірус гепатиту B, актин, промотор вірусу саркоми Рауса (RSV) і ранній або пізній Мавпячий вірус 40 і невірусні промотори, наприклад, альфа EF-1 (Mizushima and Nagata Nucleic Acids Res 1990 18(17):5322. Вибір промотору може бути заснованим на придатній взаємозамінності з клітиноюхазяїном, використаною для експресії. 2.5 Елемент гена-підсилювача При необхідності, наприклад, для експресії у вищих еукаріотах, додаткові елементи гена 94734 24 підсилювача можуть бути включені замість або разом із знайденими розташованими в промоторах, описаних вище. Придатні ссавцеві послідовності генів-підсилювачів включають елементи генів-підсилювачів глобіну, еластази, альбуміну, ембріонального білка, металотіонеїну та інсуліну. Альтернативно, можна застосовувати підсилюючий елемент з вірусу еукаріотної клітини, наприклад, ген-підсилювач SV40, ген-підсилювач раннього промотору цитомегаловірусу, генпідсилювач поліоми, ген-підсилювач бакуловірусу або мишачий сайт IgG2a (див. WO04/009823). Хоча такі гени-підсилювачі звичайно розміщуються на векторі на сайті вище промотору, вони можуть також бути розміщені в іншому місці, наприклад, в межах не трансльованої ділянки або нижче сигналу полі-А сайта. Вибір і розміщення генапідсилювача може бути заснованим на придатній сумісності з клітиною-хазяїном, використаною для експресії. 2.6 Сайт поліаденілювання/термінації В еукаріотних системах сигнали поліаденілювання функціонально зв'язуються з полінуклеотидом, що кодує антитіло за даним винаходом. Такі сигнали звичайно розміщуються біля 3' відкритої структури читання. У ссавцевих системах не обмежуючі приклади сигналів включають похідні гормонів росту, фактора-1 подовження альфа і вірусних (наприклад, SV40) генів або ретровірусних довгих кінцевих повторень. У системах дріжджів не обмежуючі приклади сигналів поліаденілювання/термінації включають похідні генів фосфогліцераткінази (PGK) і алкогольдегідрогенази 1 (ADH). У прокаріотних системах сигнали поліаденілювання звичайно не вимагаються і натомість звичайно використовують коротші і більш визначені термінаторні послідовності. Вибір послідовностей поліаденілювання/термінації може засновуватися на придатній сумісності з клітиною-хазяїном, використаною для експресії. 2.7 Інші способи/елементи для збільшення виходу На додаток до згаданого вище, інші особливості, які можна використовувати для збільшення виходу, включають елементи реконструкції хроматину, інтрони і модифікацію специфічного кодону клітини-хазяїна. Застосування кодону антитіла за даним винаходом може бути модифіковане з метою адаптації схильності кодону клітини-хазяїна до збільшення транскрипта та/або виходу продукту (наприклад, Hoekema A. et al Mol Cell Biol 1987 7(8):2914-24). Вибір кодонів може бути заснованим на придатній сумісності з клітиною-хазяїном, використаною для експресії. 2.8 Клітини-хазяї Придатні клітини-хазяї векторів клонування або експресії, що кодують антитіла за винаходом, являють собою прокаріотні, дріжджові або вищі еукаріотні клітини. Придатні прокаріотні клітини включають еубактерії, наприклад, ентеробактерії, такі як Escherichia наприклад, E. coli (наприклад, ATCC 31,446; 31,537; 27,325), Enterobacter, Erwinia, Klebsiella Proteus, Salmonella наприклад, Salmonella typhimurium, Serratia наприклад, Serratia marcescans і Shigella, також бацили, на 25 приклад, B. subtilis і B. licheniformis (див. DD 266 710), Pseudomonas, наприклад, P. aeruginosa і Streptomyces. З дріжджових клітин-хазяїв Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces (наприклад, ATCC 16,045; 12,424; 24178; 56,500), yarrowia (EP402, 226), Pichia Pastoris (EP183, 070, також див. Peng et al J. Biotechnol. 108 (2004) 185-192), Candida, Trichoderma reesia (EP244, 234), Пеніцилін, хазяї родів Tolypocladium і Aspergillus, наприклад, A. nidulans і A. niger, також розглядаються. Хоча клітини прокаріотних дріжджових хазяїв специфічно розглядаються у винаході, однак, звичайно клітини-хазяї за даним винаходом являють собою клітини хребетних тварин. Придатні клітинихазяї хребетних тварин включають ссавцеві клітини, наприклад, COS-1 (ATCC CRL 1650) COS-7 (ATCC CRL 1651), людська ембріональна ниркова лінія 293, PerC6 (Crucell), ниркові клітини маленького хом'яка (BHK) (ATCC CRL.1632), BHK570 (ATCC CRL 10314), 293 (ATCC CRL 1573), клітини яєчника китайського хом'яка CHO (наприклад, CHO-K1, ATCC CCL 61, лінію DHFR–клітин CHO, наприклад, DG44 (Urlaub et al, Somat Cell Mol Genet (1986) Vol 12 pp 555-566), особливо ті лінії клітин CHO, які пристосовані для культивування в суспензії, клітини Сертолі миші, ниркові клітини мавпи, ниркові клітини Африканської зеленої мавпи (ATCC CRL-1587), клітини HELA, ниркові клітини собак (ATCC CCL 34), клітини легені людини (ATCC CCL 75), Hep G2 і клітини мієломи або лімфоми, наприклад, NSO (див. US 5,807,715), Sp2/0, YO. Таким чином, в одному варіанті винаходу запропонована стабільно трансформована клітинахазяїн, яка містить вектор, що кодує важкий ланцюг та/або легкий ланцюг терапевтичного антитіла, як описано в даному винаході. Звичайно такі клітини-хазяї включають перший вектор, що кодує легкий ланцюг, і другий вектор, що кодує вказаний важкий ланцюг. Такі клітини-хазяї також можуть бути створені або пристосовані для зміни якості, функції та/або виходу антитіла за даним винаходом. Не обмежуючі приклади включають експресію специфічних ферментів модифікації (наприклад, глікозилювання) і супутніх білків. 2.9 Способи культивування клітин. Клітини-хазяї, трансформовані векторами, що кодують терапевтичні антитіла за винаходом, можна культивувати будь-яким способом, відомим фахівцям у даній галузі. Клітини-хазяї можна культивувати в центрифужних пробірках, баклагах, струшуваних колбах, ролерних флаконах, хвильових реакторах (наприклад, System 1000 від wavebiotech.com) або системах порожніх волокон, але для продукування великого масштабу найкраще застосовувати бакові реактори з мішалками або мішечні реактори (наприклад, Wave Biotech, Somerset, New Jersey, США), особливо для суспензійних культур. Звичайно баки з мішалками пристосовані для вентилювання, з застосуванням, наприклад, розбризкувачів, дроселів або низьких роторів-ножиць. Для барботажних колон і реакторів з повітряними підйомниками можна застосову 94734 26 вати пряме вентилювання бульбашками повітря або кисню. Якщо клітини-хазяї культивують в середовищі, вільному від сироватки, його можна доповнювати агентом, який захищає клітини, наприклад, pluronic F-68, щоб допомогти попередити пошкодження клітин в результаті процесу вентилювання. В залежності від характеристик клітинихазяїна, можна застосовувати або мікроносії як субстрати росту для закріплення залежних ліній клітин, або клітини можуть бути пристосовані до культивування в суспензії (що є типовим). Для культивування клітин-хазяїв, особливо клітинхазяїв хребетних тварин, можна застосовувати різні оперативні методи, наприклад, серійний, підживлювану культуру, повторну серійну обробку (див. Drapeau et al (1994) Cytotechnology 15: 103109), розширений періодичний спосіб або перфузійну культуру. Хоча рекомбінантно трансформовані ссавцеві клітини-хазяї можна культивувати в середовищах, що містять сироватку, наприклад, у середовищі, яке містить сироватку телячого ембріону (FCS), краще культивувати такі клітини-хазяї в середовищі, вільному від сироватки, наприклад, показаному в Keen et al (1995) Cytotechnology 17: 153-163, або комерційно доступному середовищі, наприклад, ProCHO-CDM або UltraCHO (Cambrex NJ, США), доповненому при необхідності джерелом енергії, наприклад, глюкозою, і синтетичними факторами росту, наприклад, рекомбінантним інсуліном. Вільне від сироватки середовище для культивування клітин-хазяїв може вимагати адаптації клітин до росту в умовах середовища, вільного від сироватки. Один з підходів до адаптації полягає в культивуванні таких клітин-хазяїв у середовищі, яке містить сироватку, і повторну заміну 80 % середовища культури на вільне від сироватки середовище таким чином, що клітинихазяї вчаться адаптуватися до умов середовища, вільного від сироватки (див. наприклад, Scharfenberg K et al (1995) in Animal Cell technology: Developments towards the 21st century (Beuvery E. C. et al eds), pp 619-623, Kluwer Academic publishers). Антитіла за винаходом, секретовані в середовище, можуть бути добуті та очищені з середовища за допомогою різних методів, щоб забезпечити ступінь очищення, придатний для застосування за призначенням. Наприклад, застосування терапевтичних антитіл за винаходом для лікування людей звичайно вимагає як мінімум 95 % чистоти за даними SDS-PAGE у відновлювальних умовах, частіше 98 % або 99 % чистоти, в порівнянні з середовищами для культивування, що містять терапевтичні антитіла. В першу чергу, уламки клітин з середовища для культивування звичайно видаляють, застосовуючи центрифугування, яке завершується стадією очищення супернатанта за допомогою, наприклад, мікрофільтрації, ультрафільтрації та/або глибинного фільтрування. Альтернативно, антитіла можуть бути зібрані мікрофільтрацією, ультрафільтрацією або глибинним фільтруванням без попереднього центрифугування. Доступні різноманітні інші методи, наприклад, діаліз, і методи електрофорезу в гелі та хроматографії, наприклад, гідроксиапатит (HA), афінна 27 хроматографія (необов'язково включає системи зв’язування спорідненості, наприклад, полігістидин) та/або хроматографія гідрофобної взаємодії (HIC, див. US 5,429,746). В одному варіанті антитіла за винаходом після різних стадій очищення захоплюють, застосовуючи афінну хроматографію з Протеїном А або G, з подальшими стадіями хроматографії, наприклад, іонообмінною хроматографією та/або хроматографією HA, обміном аніонів або катіонів, ексклюзійною хроматографією та осадженням сульфатом амонію. Звичайно, різні стадії видалення вірусу також використовуються (наприклад, нанофільтрація з застосуванням, наприклад, фільтру DV-20). Після різноманітних стадій одержують очищений (звичайно моноклональний) препарат, що містить як мінімум 10 мг/мл або більше, наприклад, 100 мг/мл або більше антитіл за винаходом і, таким чином, утворюється варіант винаходу. Концентрація до 100 мг/мл або більше може бути одержана ультрацентрифугуванням. Відповідно такі препарати майже вільні від форм агрегатів антитіл за винаходом. Бактеріальні системи особливо підходять для експресії фрагментів антитіла. Такі фрагменти локалізовані між клітинами або в межах периплазми. Нерозчинні периплазматичні білки можуть бути добуті і знову згорнуті у форму активних білків у відповідності до методів, відомих фахівцям у даній галузі, див. Sanchez et al (1999) J. Biotechnol. 72, 13-20 та Cupit PM et al. (1999) Lett Appl Microbiol, 29, 273-277. 3. Фармацевтичні композиції Очищені препарати антитіл за винаходом (особливо моноклональні препарати) як описано вище, можуть бути введені у фармацевтичні композиції для застосування в лікуванні захворювань і розладів людини, наприклад, описаних вище. Звичайно такі композиції додатково містять фармацевтично прийнятний (тобто інертний) носій, як відомо і визнано належною фармацевтичною практикою, див. наприклад, Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th ed, (1980), Mack Publishing Co. Приклади таких носіїв включають стерилізований носій, наприклад, розчин солі, розчин Рингера або розчин глюкози, з доданими придатними буферами, наприклад, натрію ацетат тригідрат, до фармацевтично прийнятних значень pH, наприклад, pH у межах інтервалу від 5 до 8. Фармацевтичні композиції для ін'єкцій (наприклад, внутрішньовенних, внутрішньоочеревинних, внутрішньошкірних, підшкірних, внутрішньом'язових або інтрапортальних) або для безперервноїї інфузії, відповідно, вільні від видимих твердих частинок і можуть містити від 1 мг до 10 г терапевтичних антитіл, звичайно від 5 мг до 1 г, більш специфічно від 5 мг до 25 мг або 50 мг антитіл. Способи одержання таких фармацевтичних композицій добре відомі фахівцям у даній галузі. В одному варіанті фармацевтичні композиції містять від 1 мг до 10 г терапевтичних антитіл за винаходом у формі оди 94734 28 ничної дози, необов'язково разом з інструкціями із застосування. Фармацевтичні композиції за винаходом можуть бути ліофілізовані (висушені після заморожування) для повторного розведення перед введенням у відповідності до методів, добре відомих або зрозумілих фахівцям у даній галузі. Якщо варіанти винаходу включають антитіла за винаходом ізотипу IgG1, комплексони іонів металів, які включають мідь, наприклад, цитрат (наприклад, натрію цитрат) або ЕДТА або гістидин, можуть додаватися до фармацевтичної композиції для зменшення ступеня опосередкованої металами деградації антитіл даного ізотипу, див. EP0612251. Фармацевтичні композиції також можуть містити солюбілізатор, наприклад, основу аргініну, детергент/антиагрегувальний агент, наприклад, полісорбат 80, та інертний газ, наприклад, азот, щоб замінити кисень у вільному просторі флакона. Ефективні дози і схеми лікування для введення антитіла за винаходом загалом визначаються емпірично і залежать від різноманітних факторів, наприклад, віку, маси тіла і стану здоров’я пацієнта та захворювання або розладу, який підлягає лікуванню. Такі фактори знаходяться в межах компетенції лікуючого лікаря. Вказівки щодо вибору відповідних доз можна знайти, наприклад, у Smith et al (1977) Antibodies in human diagnosis and therapy, Raven Press, New York, але загалом дози будуть становити від 1 мг до 10 г. В одному варіанті схема введення для лікування пацієнта-людини складає від 1 мг до 1 г терапевтичного антитіла за винаходом, яке вводять підшкірно один раз на тиждень або кожні два тижні, або внутрішньовенною інфузією кожні 1 або 2 місяці. Таке дозування відповідає 0,014–140 мг/кг, наприклад, 0,014–14 мг/кг. Композиції за даним винаходом також можна застосовувати для профілактики. 4. Клінічне застосування. Визнано, що хвороби, які характеризуються підвищеним рівнем β-амілоїдів або відкладенням β-амілоїдів, включають хворобу Альцгеймера, м'яке порушення пізнавальної здатності, синдром Дауна, спадкову мозкову кровотечу з βамілоїдозом голландського типу, мозкову βамілоїдну ангіопатію і різні типи дегенеративних деменцій, наприклад, пов'язані з хворобою Паркінсона, прогресивним над-ядерним паралічем, кірковою основною дегенерацією і хворобою Альцгеймера за типом дифузного тіла Леві. Найбільш переважно, захворювання, що відрізняється підвищеним рівнем β-амілоїдів або відкладенням β-амілоїдів, являє собою хворобу Альцгеймера. Хоча даний винахід описаний, головним чином, стосовно лікування захворювань або розладів людини, даний винахід можна також застосовувати в лікуванні подібних захворювань або розладів у негуманоїдних ссавців. Приклади Методи 29 94734 30 Biacore/Biacore 3000 пристрій, який дозволяє вимірювання кінетики молекулярних взаємодій в реальному часі із застосуванням SPR SPR (резонанс поверхневого плазмону) - фізичний феномен, який застосовується в приладах Biacore для вимірювання змін маси на сенсорному чіпі CM5 сенсорний чіп Biacore із загальною кінцевою поверхнею, вкритою карбоксиметильованою декстриновою матрицею ELISA твердофазний імуноферментний аналіз SRU технологія біодатчика SRU BIND, що дозволяє контролювати біохімічні взаємодії без застосування мітки Integra CL міні-біореактори від IBS Integra Biosciences 1000 FMAT технологія флюорометричної мікрооб’ємної проби (Applied Biosystems) ABі8200 макро-конфокальна флуоресцентна клітинна система виявлення Applied Biosystems 8200 для FMAT FPLC ProSepA HiTrap рідинна хроматографія швидких білків колонки з Протеїном А для FPLC від GE Healthcare Матеріали ДМСО HEPES ЕДТА Трис HCI NaCI Tвін-20 BSA ФБР ПФА IMS DAB DMEM FCS Opti-MEM Lipofectamine Transfast Versene Glutamax Histoclear HBS-EP буфер диметилсульфоксид N-(2-гідроксиетил)піперазин-N'-(2-етансульфонова кислота) етилендіамінтетраоцтова кислота трис-(гідроксиметил)амінометан гідрохлорид хлорид натрію поліоксиетиленсорбітану монолаурат альбумін сироватки бика фосфатний буферний сольовий розчин параформальдегід промисловий етиловий спирт 3,3'-діамінобензидин модифіковане Дульбекко середовище Ігла сироватка телячого ембріону середовище Invitrogen/Gibco на базі модифікованого ессенціального середовища агент для трансфекції клітин на базі катіонних ліпідів від Invitrogen/Gibco агент для трансфекції ліпосом від Promega агент комплексного іона металу (етилендіамінтетраоцтова кислота) стабільна форма глютаміну, яка додається до середовища для культивування (добавка дипептиду L-аланіл-L-глутаміну) агент для очищення тканини TM універсальний буфер Biacore , який містить 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCI, 3 ммоль ЕДТА, 0,005 % поверхнево-активної речовини P20 Генерація моноклонального антитіла миші 2E7 Моноклональне антитіло миші 2E7 генерували шляхом традиційної імунізації мишей. Миші були імунізовані розчинним або зібраним β-амілоїдом 140 і 1-42, сформованим як ад’ювант Фрейда. Після завершального підвищення без ад’юванту спленоцити об'єдналися з клітинами мієломи. Об'єднані клітини вирощували на планшетах з 96 лунками, з яких супернатанти гібридоми відбирали для потенційного відведення. Відібране антитіло 2E7, одержане імунізацією розчинним β-амілоїдом 1-40, було мишачого ізотипу lgG2a і демонструвало активність зв'язування з β-амілоїдом в аналізі витікання, описаному нижче, і спорідненість 36,1 пМ ТМ для β-амілоїда 1-40, при вимірюванні Biacor , Спосіб А(і) (Таблиця 10A). Побудова карти епітопів 2E7 Для точного зображення зв'язування антитіла 2E7 з β-амілоїдним пептидом застосували набір пептидів (A). Набір пептидів (A) складався з набору 31 12-мерного перекриваючого пептида, що охоплював повну послідовність β-амілоїдних 1-42 пептидів. Кожен послідовний пептид був ініційований у послідовній амінокислоті в межах βамілоїдного пептиду, таким чином зміщуючи послідовність, охоплену між послідовними пептидами, на одну амінокислоту. Всі пептиди в наборі (A) містили 3 зв’язані C-кінцеві амінокислоти (гліцинсерин-гліцин) і кінцевий залишок лізину, оброблений біотином. Крім того, всі пептиди, окрім пептиду Aβ1 DAEFRHDSGYEVGSGK-біотин (SEQ ID NO: 15) були ацетильовані на N-кінці. Другий набір пептидів (набір (B)) складався з послідовних видалень однієї C-кінцевої амінокислоти з пептиду, що містить амінокислоти від 1 до 10 β-амілоїдної послідовності. Всі пептиди в наборі (B) містили 3 31 94734 зв’язані C-кінцеві амінокислоти (гліцин-серингліцин) і кінцевий залишок лізину, оброблений біотином, але з додатковими залишками гліцину і 32 серину для заміни з метою видалених βамілоїдних амінокислот (Таблиця 2). Таким чином, всі пептиди в наборі (B) мали однакову довжину. Таблиця 2 Послідовності пептидів, оброблених біотином, (набір (B)), що містили вкорочені N-кінцеві фрагменти β-амілоїдів DAEFRHDSGYGSGGSK-біотин (SEQ ID NO: 7) DAEFRHDSG-GSGSGSK-біотин (SEQ ID NO: 8) DAEFRHDS-GSGGSGGK-біотин (SEQ ID NO: 9) DAEFRHD-GSGGSGGSK-біотин (SEQ ID NO: 10) DAEFRH-GSGGSGGSGK-біотин (SEQ ID NO: 11) DAEFR-GSGGSGGSGSK-біотин (SEQ ID NO: 12) DAEF-GSGGSGGSGGSK-біотин (SEQ ID NO: 13) DAE-GSGGSGGSGGSGK-біотин (SEQ ID NO: 14) Контроль зв'язування 2E7 з похідними від βамілоїдів пептидами за допомогою оптичних біодатчиків Планшети SRU Bind з 96 лунками, вкриті стрептавідином (SRU Biosystems), промивали фосфатним буферним розчином, який містить 1 % ДМСО, для видалення гліцерину і консерванту. Об'єм 50 мкл/лунку залишили для врівноваження до кімнатної температури для забезпечення константної базової лінії. Пептиди, оброблені біотином, були розбавлені приблизно до 0,3 мкг/мл у фосфатному буферному розчині, який містить 1 % ДМСО, по 50 мкл кожного додавали в лунки та інкубували приблизно 1 год. Лунки для відтворювання приготували, застосовуючи різні сектори планшета, і як мінімум одну контрольну лунку без пептидів застосовували в кожному секторі для віднімання одержаних даних. Після захоплення пептиду планшет промивали фосфатним буферним розчином, який містив 1 % ДМСО, залишаючи 50 мкл свіжого буфера на лунку для забезпечення нової базової лінії на програмі зчитування. Розпад пептиду з поверхні не спостерігався. Буфер далі замінювали на 40 мкл/лунку буфера, що містить досліджуване антитіло в концентрації 20–64 нM, протягом 2 годин. Виявлено, що антитіло 2E7 зв'язується тільки з пептидом, що містить амінокислоти 1–12 β-амілоїдних пептидів у наборі пептидів (А) (пептид Аβ1, SEQ ID NO: 15). Одержаний результат означає, що аспарагінова кислота в залишку 1 є критичною для зв’язування з цим пептидом. Для подальшої характеристики сайта зв'язування з антитілом 2E7 використовували набір пептидів (B). При застосуванні методології біодатчика SRU BIND антитіло 2E7 показало незначне зв'язування з пептидами, що містять амінокислоти 1–3 та 1–4 β-амілоїдного пептиду (SEQ ID NO: 14 і 13). Зв'язування з пептидом, що містить амінокислоти 1–7 β-амілоїдного пептиду (SEQ ID NO: 10), було порівнянне з пептидом, що містить амінокислоти Пептид A β2–13 1–12 β-амілоїдного пептиду (з набору пептидів (A)). Зв'язування з пептидами, які містять амінокислоти 1–5 або 1–6 β-амілоїдного пептиду (SEQ ID NO: 12 або 11), спостерігалося, але було слабкішим (за даними стабільності після додаткової стадії промивання), ніж зв'язування з пептидом, який містить амінокислоти 1–7 β-амілоїдного пептиду (SEQ ID NO: 10). Таким чином показано, що тільки залишки 1–7 β-амілоїдного пептиду необхідні для повного зв'язування, за результатами застосування даної методології. Аналіз методом резонансу поверхневого плазмону На додаток до експериментів, описаних вище, TM оптичний біодатчик Biacore 3000 застосували для контролю зв'язування антитіла 2E7 з відібраними пептидами, похідними від β-амілоїдної послідовності. Зв'язування вимірювали, вводячи ін'єкційним способом досліджувані антитіла до концентрації 64 нM протягом 5 хвилин над пептидами, захопленими на окремих мікрочіпах стрептавідину (130-230 RU (одиниць резонансу)). Рухомий буфер (HBS-EP), що містить 0,01 M HEPES pH 7,4, 0,15 M NaCl, 3 мM ЕДТА і 0,005 % поверхнево-активної речовини P20 при 25°C, застосовували із швидкістю потоку 20 мкл/хв. Всі аналізи проводили двічі проти холостої поверхні стрептавідину та холостих ін'єкцій. Аналіз здійснювали із застосуванням програмного забезпечення аналізу Biacore BIAevaluation версії 4.1. Результати відібраних пептидів у наборі (A) надалі підтвердили одержані дані SRU BIND, які показали, що 2E7 зв’язується тільки з пептидом, який містить амінокислоти 1–12 (SEQ ID NО: 15) β-амілоїдного пептиду з очевидною константою рівноваги KD приблизно 50 пМ. За тих самих умов 2Е7 не зв’язувався з пептидом, який містить амінокислоти 2–13 β-амілоїдного пептиду. AEFRHDSGYEVHGSGK-біотин (SEQ ID NО: 44) Експериментальний метод і застосовані умови дозволили виявлення молекул з вищою, а також нижчою спорідненістю — в такій же експериментальній установці, на протилежність 2E7 було пока 33 зано, що інший N-кінцевий епітоп β-амілоїдного пептиду, який розпізнає антитіла, зв'язується з пептидом 2–13 (SEQ ID NО: 44) з очевидною KD 7 нM. 2E7 не зв'язувався з виділеними пептидами в наборі (A) від середніх ділянок β-амілоїдного пептиду. В окремому експерименті β-амілоїдний пептид 1–40 був захоплений через його N-кінцевий залишок аспарагінової кислоти, оброблений біотином. Даний пептид був захоплений на вкритому TM стрептавідином мікрочипі Biacore , як було описано раніше. Антитіло 2E7, введене ін'єкційним способом в концентрації 66 нM протягом 1 хв, не могло зв'язуватися з даним пептидом. Таким чином, зроблено висновок, що описаний раніше Nкінцевий сайт зв'язування був замаскований методом лінкера і захоплювання, таким чином додатково підтвердили екстремальний N-кінець, який містить основний сайт зв'язування. Зв'язування з експресованим в клітині білкомпрекурсором амілоїду (APP) Амілоїд складається з пептидів, утворених протеолітичним розщепленням типу І трансмембранного білка-прекурсора, який називається білком-прекурсором амілоїду (APP). Оскільки APP містить великий позаклітинний домен, зв'язування з даним білком могло потенційно ініціювати залежну від антитіл реакцію клітинної цитотоксичності (ADCC). Для визначення зв'язування антитіла з повною довжиною APP на поверхні клітини провели аналіз, заснований на FMAT ABI8200. Трансфекція клітин HEK293T ДНК APP дикого типу Клітини HEK293T утримують в середовищі DMEM F12, яке містить 10 % (за об’ємом) FCS та 1 x Glutamax. Клітини висівають в колби для культи2 вування тканин на 75 см і вирощують до 60-80 % злиття (18-24 годин) перед трансфекцією. Для трансфекції змішують 9 мкг ДНК (або ДНК APP дикого типу (у векторі PCDNA3,1 (Invitrogen)), або тільки контрольний вектор) з 0,3 мл середовища Opti-MEM. 30 мкл агента для трансфекції Lipofectamine змішують з 0,3 мл середовища Opti-MEM, і дві суміші об'єднують. Об'єднані суміші інкубують при кімнатній температурі протягом 30 хвилин, після чого додають ще 4,8 мл середоTM вища Opti-MEM . Кінцеву суміш додають до кліTM тин (після промивання середовищем Opti-MEM ) протягом 5 годин, і далі додають 6 мл 10 % (об./об.) сироватки телячого ембріону в DMEM. Через 48 годин після трансфекції супернатант видаляють, і моношар промивають у Трилоні Б, а потім 3 мл хелатного агента Трилон Б додають до кожної колби, інкубують 5 хв при 37 °C, і окремі клітини осаджують у 200 г протягом 5 хв. Отриманий в результаті осад клітин повторно суспендують в 1 мл буфера для аналізу (2 % обробленої нагріванням сироватки, 0,5 % альбуміну бичачої сироватки, 0,1 % NaN3 у фосфатному буферному розчині з pH 7,4, фільтрують через фільтр з розміром отворів 0,2 мкм), для утворення однорідної суспензії клітин. TM Аналіз, заснований на FMAT ABI8200 Досліджувані антитіла (2E7, LN27 (Zymed) миші IgG до позаклітинного домену APP як позитив 94734 34 ний контроль, і антитіло G210, яке визнає форму x-40 β-амілоїдного пептиду як негативний контроль) розбавляють до 10 мкг/мл в стерильному фільтрованому буфері (2 % обробленої нагріванням сироватки, 0,5 % альбуміну бичачої сироватки, 0,1 % NaN3 у фосфатному буферному розчині, pH 7,2) на поліпропіленовому планшеті, а потім наступні шість серійних розведень 1:1 виконують на планшеті. Буфер для аналізу застосовують тільки як холостий розчин. 50 мкл суспензії клітин HEK293T трансфікують диким типом ДНК APP (Експеримент 1: 10000 клітин; Експеримент 2: 20000 клітини) додають до кожної з 96 лунок планшету, і 5 мкл розчину кожного антитіла додають до подвійних лунок. 50 мкл/лунку блакитного TM вихідного розчину анти-мишачого IgG F-MAT , (антитіло, мічене застосуванням блакитного монофункціонального реактивного набору барвників TM F-MAT з ABI, 4328408), розбавляють 1:500 (Експеримент 1) і 1:1000 (Експеримент 2) у буфері аналізу, потім додають до кожної лунки, планшет швидко струшують і залишають для осадження на 1 годину. Потім досліджують планшет, застосовуючи флуоресцентну макро-конфокальну систему виявлення клітин ABI 8200 (Applied Biosystems). Одержані дані підрахунків потім інтерпретували, застосовуючи програмне забезпечення електронних таблиць Excel. Якщо коротко, кількість фальшиво трансфікованих клітин віднімають від кількості клітин, трансфікованих повною довжиною APP, щоб одержати специфічний сигнал для кожного антитіла. Дві концентрації антитіл, які розташовані на лінійній частині кривої, вибрали (1,25 і 0,63 мкг/мл) і одержані підрахунки з корекцією на фон в цих концентраціях виражені як відсоток зв'язування антитіла LN27, і знайдено середнє значення для двох концентрацій антитіл. Отримані в результаті дані наведені в табл. 3 (% зв'язування LN27 ± SE). Таким чином, в межах даної системи аналізу, зв'язування 2E7 з APP на поверхні клітини не відрізняється від зв'язування негативного контрольного антитіла G210. Таблиця 3 Антитіло LN27 G210 2E7 Експеримент 1 100,0 ±7,1 5,5 ± 1,3 9,9 ±3,7 Експеримент 2 100,0 ±4,7 2,0 ± 1,6 2,2 ± 1,4 Зв'язування з пептидом, похідним від білкапрекурсора амілоїду Раніше описані дослідження зображення епітопа показали, що антитіло 2E7 зв'язується з Nкінцем β-амілоїдного пептиду, із залишком аспарагінової кислоти в положенні 1, істотному для зв'язування. Це означає, що антитіло розпізнає епітоп ―нeo‖, утворений розщепленням APP на сайті βсекретази. Дане спостереження свідчить, що антитіло 2E7 не повинне розпізнавати послідовність суміжних пептидів APP. Для перевірки даної гіпотези синтезували пептид APP (Пептид APP1, SEQ ID NО: 16), який містить залишки 1–7 βамілоїдного пептиду і п'ять суміжних одержаних з 35 94734 APP амінокислот. Таким чином, пептид APP1 містить суміжні амінокислоти від положення 5 N-кінця, до сайта розщеплення BACE-1, до положення 7 Cкінця, до сайта розщеплювання BACE-1, і ацетильований на N-кінці. Здатність антитіла 2E7 до зв'язування з пептидом APP1, похідним від APP, і β-амілоїдним пептидом 1–12 (пептидом Aβ1) порівнювали, застосовуючи методологію Biacore (як було описано раніше для побудови карти епітопа). Антитіло 2E7 показало високу спорідненість зв'язування з β-амілоїдним пептидом Aβ-1, який містить основний епітоп 1–7. Однак, не спостерігалося зв'язування з пептидом APP1, який також містить основну β-амілоїдну послідовність 1–7. Пептид Aβ1 APP1 DAEFRHDSGYEVGSGK-біотин SEQ ID NО: 15 AcNH-SEVKMDAEFRHDGSGK- біотин SEQ ID NО: 16 TM Комбінацію заснованого на FMAT клітинного зв'язування і заснованої на Biacore візуалізації пептиду застосували, щоб продемонструвати, що в цих форматах 2E7 не володіє спорідненістю зв'язування до білка APP з повною довжиною. З одержаних даних можна побачити, що залишок аспарагінової кислоти в положенні 1 β-амілоїдного пептиду необхідний для зв'язування, тобто, зроблено висновок, що 2E7 розпізнає тільки ―neo‖ Nкінець β-амілоїду і, таким чином, не повинен зв'язуватися з APP, експресованим на поверхні клітини. Біологічна активність in vivo 125 Модель витікання β-амілоїдів I Цілий ряд опублікованих досліджень показали, що β-амілоїдні антитіла можуть утворювати комплекси з β-амілоїдним пептидом в кровотоку. Зрозуміло, що така ізоляція периферичних β-амілоїдів дозволяє подальше витікання амілоїдів з ЦНС у кровотік (DeMattos RB, PNAS (2001), 98(15); 88508855). Розробили гостру фармакодинамічну модель для сортування антитіл за їх здатністю до утворення комплексу з β-амілоїдним пептидом мозку в кровотоку. Анестезію (4 % фторований простий ефір) здійснювали мишам-самцям C57/BL6J, який утримували (1,5 % фторований простий ефір) в атмосфері 100 % кисню. Далі тварин розміщували в стереотаксичній рамі. Після надрізу по серединній лінії уздовж сагітального шва свердлили розточений отвір в черепі і вставляли напрямну канюлю в бічний мозковий шлуночок (координати передньозадня (AP) -0,5 мм, бічна (L) +0,7 мм, черевна (V) 2,5 мм). Свердлили наступні два отвори в черепі, в яких були розміщені кіркові гвинти. Канюлю закріплювали на місці ціаноакриловим гелем і на надріз накладали шов навколо кришки з ціаноакрилового гелю. Після операції мишам вводили підшкірно 0,3 мл розчину солі та розміщували їх у теплому оточенні для відновлення після анестезії. Після відновлення рефлексу випрямляння миші були розміщені окремо і отримували стандартний післяопераційний догляд протягом 5 днів. Процедури не були дозволені протягом подальших 5 днів, або до відновлення передопераційної маси 36 тіла. Після одужання місце розміщення канюлі було перевірене реакцією пиття після введення ангіотензину IІ. Кожна миша одержала інтрацеребровентрикулярне введення (5 мкл) (ICV) 100 нг ангіотензину IІ (АІІ) (в 0,9 % розчині солі). Після введення АІІ споживання води спостерігали протягом 15 хвилин. Миші з позитивною реакцією на агент АІІ, який викликає спрагу (які тривалий час п'ють) увійшли до дослідження, яке розпочинали не раніше п'яти днів після ін'єкції АІІ. В день дослідження мишей вміщували на 5-10 хвилин в тепле оточення для індукції розширення судин, необхідного для полегшення ін'єкції в хвостову вену. Досліджуване антитіло (600 мкг) або фосфатний буферний розчин (в об'ємі дози, не більше, ніж 10 мл на кг маси тіла) вводили ін'єкційним способом через хвостову вену і мишей повернули до індивідуальних кліток після ін'єкції. Точно через одну годину після ін'єкції в хвостову вену мишам повільно ввели ICV (2 мкл за хвилину) 125 ін'єкційним способом з 2 нг (1 мкКюрі) I βамілоїда 1-40 (Amersham Biosciences, UK) в об'ємі дози 5 мкл. Точно через 4 години після введення дози ICV відібрали 50 мкл крові із стовбура і виміряли рівень радіоактивності на сцинтиляційному лічильнику. Миші, яким вводили ін'єкційним способом у хвостову вену 2E7 (n = 6 на групу лікування), демонстрували статистично істотне зростання радіоактивного сигналу (кількість імпульсів на хвилину) в 50 мкл крові із стовбура в порівнянні з кількістю імпульсів сигналу, виявленого у мишей, яким вводили ін'єкційним способом розчинник (CPM – розчинник: 1339,7 ± 496,2 проти 2E7 4387,9 ± 980,3; ANOVA:F(2,13) = 4,97, p < 0,05. Post-hoc LSD: p = 0,01 2E7 проти розчинника [post-hoc Duncans: p = 0,02 2E7 проти розчинника]). В двох наступних дослідженнях 2E7, проведених за ідентичним протоколом, спостерігалося подібне зростання витікання амілоїдів у кров в порівнянні з контрольними ін'єкціями розчинника (CPM кров: Розчинник 352 +/- 113 проти 2E7 2397 +/- 353, і Розчинник 1281 +/- 312 проти 2E7 5291 +/- 885; ANOVA з тестом post-hoc LSD p < 0,001 проти розчинника). Трансгенні моделі зниження вмісту β-амілоїдів у ЦНС 1. Навантаження β-амілоїдів через 4 тижні введення 2-місячним мишам TASTPM Самці і самки – трансгенні миші TASTPM (подвійні мутанти APPswe x PS1.M146V, Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130-136), яким було на початку дослідження від 61 до 65 днів, були поселені окремо. Рівні кількості мишей були призначені в кожну групу (N = 12 на групу) лікування і були змішаними за статтю і віком. Групи лікування включали наступні. А: MOPC21 (антитіло з невідомою специфічністю, Holton et al (1987) J. Immunol 139(9) 3041-3049, негативний контроль), B: 2E7 (досліджуване антитіло). Всі антитіла розчиняли у фосфатному буферному розчині і вводили внутрішньоочеревинно. Незалежно від маси тварини, вводили 300 мкг антитіла. Тваринам вводили дози двічі на тиждень протягом чотирьох тижнів. Через один день після введення заверша 37 льної дози тварин піддавали евтаназії передозуванням пентобарбіталу натрію. Мозок розтинали і розрізали навпіл. Зразки половини мозку були зібрані в попередньо зважені пробірки Еппендорфа об’ємом 2 мл і швидко заморожені. Далі проби розморожували, їх знову зважували і додавали 1 мл 5 M розчину гуанідину в HCI, що містить таблетки повного інгібітору протеази (Boehringer Mannheim), після чого зразки гомогенізували і витримували при 4 °С більше 90 хв при постійному перемішуванні. Далі зразки розбавили 1:10 в буфері для аналізу (50 мМ Трис HCI, pH 7,4, 150 мМ NaCI, 0,05 % Tвіну-20 + 1 % альбуміну бичачої сироватки), перемішували і центрифугували із швидкістю 20000 g протягом 20 хв при 4 °C. Супернатант видаляли і вміщували як потрійні зразки на планшет для аналізу. Рівні Aβ40 і Aβ42 вимірювали за допомогою електрохемілюмінесцентного імуноаналізу (BioVeris), заснованого на чутливій пластині, із застосуванням C-кінцевих специфічних βамілоїдних антитіл (до Aβ40 або Aβ42), мічених специфічною міткою Oritag для полегшення виявлення (BioVeris), яка застосовується для захоплення або Aβ40, або Aβ42, разом з N-кінцевим специфічним антитілом Aβ, обробленим біотином. Комплекси антитіло-Aβ захоплювалися гранулами, вкритими стрептавідином, які зв'язують обробленим біотином антитіла (Dynabeads, Dynal), які інкубують протягом ночі при кімнатній температурі при енергійному перемішуванні та досліджують на фотодетекторі BioVeris МС. Стандартні криві будували, застосовуючи людські пептиди Aβ40 і Aβ42 в буфері аналізу, що містить необхідну концентрацію гуанідину HCI. Дані проаналізували, застосовуючи статистичне програмне забезпеченTM ня аналізу Excel Robosage , і рівні Aβ виражені як пМ/г тканини. В даному прикладі лікування антитілом 2E7 зменшило навантаження на ЦНС Aβ42 на 37 % (p < 0,001 ) і ЦНС Aβ40 на 23 % (p < 0,001). В інших дослідженнях за подібних експериментальних умов антитіла 2E7 зменшили навантаження на ЦНС Aβ42 на 38 % (Дослідження 1, тільки самці), 22 % (Дослідження 2, незначуще) і 39 % (Дослідження 3, самці, p = 0,001 ) і 13 % (Дослідження 3, самки, незначуще) в порівнянні з тваринами, яким вводили фосфатний буферний розчин. В цих дослідженнях 2E7 також зменшував ЦНС Aβ40 до 18 % (Дослідження 3, самці, p = 0,017), і давав незначуще зменшення Aβ40 в ЦНС до 25 % (Дослідження 1, тільки самці), < 1 % (Дослідження 2) і незначуще зростання 3 % (Дослідження 3, самки) в порівнянні з тваринами, яким вводили фосфатний буферний розчин. 2. Навантаження β-амілоїдами після 4 місяців введення 4-місячним мишам TASTPM Якщо коротко, 4-місячним трансгенним мишам TASTPM вводили дози по 300 мкг антитіл один або два рази на тиждень внутрішньочеревинно. Після введення доз протягом 4 місяців рівень β-амілоїдів в ЦНС вимірювали за допомогою ELISA, і навантаження бляшок вимірювали імуногістохімічним методом. З 4-місячного до 8-місячного віку наван 94734 38 таження β-амілоїдів у ЦНС зростає експоненціально, і швидко розвивається патологія бляшок (Howlett DR (2004) Brain Research 1017 (1-2) 130136). Вік мишей становив від 120 до 128 днів на початку дослідження, і вони були поселені окремо. Однакові кількості мишей були призначені в кожну групу лікування (N = 20 або 21 на групу) і були змішаними за статтю і віком. Групи лікування включали наступні. А: фосфатний буферний розчин (розчинник) вводили двічі на тиждень, B: дозу 2E7 вводили один раз на тиждень, C: 2E7 вводили двічі на тиждень, D: фосфатний буферний розчин вводили один раз на тиждень. Дозу 300 мкг (об'єм 79 мкл) 2E7 вводили внутрішньоочеревинно. Тварини, яких лікували розчинником, одержували такий же об'єм фосфатного буферного розчину. Тваринам вводили дози протягом вісімнадцяти тижнів. Миші TASTPM схильні зазнавати мимовільних нападів, і в результаті цілий ряд тварин померли протягом курсу дослідження. Кінцеві кількості були наступними. А: 4 самки, 9 самців; B: 5 самок, 8 самців; C: 4 самки, 9 самців; D: 2 самки, 9 самців. Через два або чотири дні після введення останньої дози тварини (рівні кількості за групу) були піддані евтаназії передозуванням пентобарбіталу натрію. Зразок кінчика хвоста від кожної миші взяли для підтвердження генотипу. Було здійснено розтин мозку, який розрізали навпіл. Праву півкулю фіксували зануренням у 4 % параформальдегід і обробляли для гістологічного дослідження. Ліву півкулю збирали в попередньо зважені пробірки Еппендорфа об’ємом 2 мл, заморожували на сухому льоду і зберігали при -80 °C для подальшого аналізу щодо вмісту амілоїдів. Перед аналізом зразки розморожували, їх знову зважували і додавали 1 мл 5 M гуанідину HCI, що містив таблетки повного інгібітору протеази (Boehringer Mannheim) перед тим, як зразки гомогенізували і витримували при 4 °C більше 90 хв при постійному перемішуванні. Далі зразки розбавляли 1:10 в буфері для аналізу (50 мМ трис HCI, pH 7,4, 150 мМ NaCI, 0,05 % Tвіну-20 + 1 % альбуміну бичачої сироватки), перемішували і центрифугували із швидкістю 20000 G протягом 20 хв при 4 °C. Далі супернатант розбавляли 1:1000 і додавали як потрійні зразки на планшети для аналізу. Рівні Aβ40 і Aβ42 вимірювали, як в дослідженні після 4 тижнів введення. Аналіз відхилення застосовували за списком лікування, статі і дози, що входять до моделі як фіксовані ефекти. Всі взаємодії між трьома факторами також включали. Не було істотних відмінностей між двома списками дозування (один або два рази на тиждень). При такому дизайні експерименту, по-перше, можна оцінити, чи існують будь-які істотні відмінності між списками доз, і, по-друге, оскільки не було таких істотних відмінностей, дані з двох списків дозування можна об'єднати, таким чином збільшуючи потужність експерименту шляхом подвоєння кількості мишей в аналізі. В даному прикладі лікування антитілом 2E7 зменшило навантаження Aβ42 на ЦНС на 22,5 % (p = 0,0152). Рівень Aβ40 у ЦНС також знизився на 39 12,1 %, але дана цифра не досягала статистичної достовірності (p = 0,118). Комплексний імуногістохімічний аналіз одержаних зразків виконувався для визначення області тканини мозку з патологією бляшок. Зрізи відбирали з кори на рівні хвостатої і від кори на рівні гіпокампу. Суміжні секції фарбували специфічним антитілом Aβ40 або Aβ42 або альтернативно амілоїдною фарбою Конго червоною. Застосовуючи програмне забезпечення для аналізу зображення, область забарвленого зрізу бляшок виражали як відсоткову частку загальної площі зрізу. Після фіксації половинки мозку, занурені в PFA, коронально розтинали в матриці мозку на частини товщиною 6 x 2 мм. Ці частини по 2 мм будуть називатися зрізами від А до F, де А — найбільш ростральний і F — хвостовий. Зрізи А, B,C і D, E, F розмістили в окремих залитих касетах, пронумерованих для кожної тварини. Касети утримували в PFA для підготовки до обробки і заливки. Заливку проводили на процесорі тканини TM Citadel 1000 (Shandon). Всі тканини обробляли в такому режимі: 70 % IMS - 1 година 100 % IMS - 3 x 1 година 100 % етанол - 2 години 100 % ізобутиловий спирт; 1 x 2 години; 1 x 1,5 години Histoclear - 2 x 1,5 години Парафіновий віск - 2 x 2 години Після завершення циклу обробки просочені воском зрізи тканини перемістили в базові форми, заповнені розплавленим парафіновим воском, і залили з допомогою системи заливки парафіну Histocentre (Shandon). Тканина була залита таким чином, що зрізи А, B і C потрапили в одну форму; D, E і F в другу форму. Це здійснювалося для всіх наборів зрізів, тобто кожна половина мозку давала результати у двох блоках воску з трьох секцій кожний. Секції розмістили в формах таким чином, що хвостова поверхня кожного шматка стала поверхнею наступного зрізу. Вжили заходів для забезпечення достатнього проштовхування вниз кожної секції в формі таким чином, що кожний гістологічний зріз відбувався в паралелі. Касету для обробки з отворами далі ретельно розмістили на кожну форму, яку потім долили до верху розплавленим воском. Потім залиті блоки охолоджували на охолодженій пластині, поки можна було видаляти з форм. Блоки зберігали при кімнатній температурі стільки, скільки необхідно для приготування гістологічних зрізів. Блоки вирізали випадково, і зрізи по 5 мкм плавали на попередньо поміченому предметному склі, вкритому желатином, (Superfrost, Erie Scientific Company). Дві секції плавали на кожному склі. Де можливо, робили послідовні зрізи і пронумерували скло послідовно від 1 до 25. П'ятдесят зрізів (25 шматків скла) взяли з кожного блоку. Скло висушили на гарячій пластині, а потім зберігали при кімнатній температурі стільки, скільки необхідно. Імуногістохімічний аналіз провели на наборах з 30 мікропрепаратів. На кожному мікропрепараті верхній зріз помітили антитілом Аβ40 (G30, поліклональне антитіло кролика, яке розпізнає β 94734 40 амілоїд х-40), нижній зріз — антитілом Aβ42, 20G10, моноклональне антитіло, яке розпізнає βамілоїд x-42. Мінімум 5 зрізів на антитіло з блоку були помічені. Мічення здійснювали наступним чином. Після видалення воску через Histoclear і набір спиртів за зростанням концентрації зрізи занурили в 85 % мурашину кислоту на 8 хвилин, а потім блокували в 0,3 % розчині пероксиду водню протягом 30 хвилин для блокування ендогенних пероксидаз. Антитіла G30 і 20G10 застосовували протягом ночі в розведеннях 1:1000, зрізи залишали при 4 °C. Зрізи обробляли відповідними обробленими біотином вторинними анти-кролячим і анти-мишачими антитілами. Забарвлення здійснювали фарбувальним набором діамінобензидин тетрагідрохлориду TM (DAB , Vector Labs). Зрізи швидко контрастно забарвили гематоксиліном Маєра перед зневодненням, очищенням і вкриванням склом. Зрізи залишили сохнути як мінімум протягом 48 годин перед мікроскопією. Зображення були TM захоплені на мікроскопі Leica DMRB , обладнаному цифровим фотоапаратом. Зображення проаналізували, застосовуючи програмне забезпеTM чення Qwin (Leica), і результати представили як % площі зрізу, поміченої антитілом Aβ. Аналіз відхилення застосовували за списком лікування, статі і дози, що входять до моделі як фіксовані ефекти. Всі взаємодії між трьома факторами також включали. Не було істотних відмінностей між двома схемами введення (один або два рази на тиждень). При даному дизайні експерименту, по-перше, ми могли оцінити, чи були істотні відмінності між схемами введення, і по-друге, якщо не було таких істотних відмінностей, дані з двох схем введення можна об'єднати, таким чином збільшуючи силу експерименту через подвоєння кількості мишей в аналізі. В даному прикладі лікування антитілом 2E7 зменшило патологічні бляшки, за даними вимірювання за допомогою антитіла, яке розпізнає Aβ42. Патологія бляшок зменшилася на 27,1 % (p = 0,0026) у корі на рівні гіпокампа і на 43 % (p < 0,0001) у корі на хвостовому рівні. Патологія бляшок також зменшилася, що виміряно за допомогою антитіла, яке розпізнає Aβ40. Патологія бляшок зменшилася на 16,6 % (p = 0,0421) у корі на рівні гіпокампа і на 17,3 % (p = 0,0342) у корі на хвостовому рівні. Ознаки мікрокрововиливу (визначені з допомогою гранул берлінської лазурі) не спостерігалася в даному дослідженні у мишей, яких лікували розчинником або 2E7. Цей метод робить видимим трьохвалентне залізо (залізо є істотною складовою частиною гемоглобіну, що переносить кисень, знайденого в еритроцитах) шляхом утворення нерозчинної блакитної сполуки. Всі рівні мозку від усіх тварин були чистими. Когнітивні моделі Після введення доз протягом 4 місяців 4місячним мишам TASTPM, як описано вище, цих мишей перевірили в двох когнітивних моделях: аналіз розпізнавання об'єкта і аналіз умовного рефлексу страху. Аналіз розпізнавання об'єкта 41 94734 В аналізі розпізнавання об'єкта використовують природну схильність тварин досліджувати нові об'єкти, і аналіз залежить від здатності тварин пригадати об'єкт, який був досліджений раніше (близький об'єкт). Повідомлялося, що 8-місячні миші TASTPM демонстрували дефіцит здатності розрізняти нові та близькі об'єкти (Howlett et al., 2004), що вказує на сповільнену пізнавальну функцію у цих тварин. В даному дослідженні, однак, 8місячні миші TASTPM, які одержували розчинник, не демонстрували порушення пізнавальної здатності, тобто вони могли відрізняти нові та знайомі об'єкти. Таким чином, не було вікна для дослідження потенційного терапевтичного впливу в результаті лікування 2E7. Аналіз умовного рефлексу страху Модель умовного рефлексу страху розробили для перевірки здатності тварин співвіднести попередній болісний стимул з контекстуальним або стимулюючим сигналом і пригадати його, коли він представлений таким же контекстом або тоном після затримки Xh. В даному дослідженні 8-місячні миші TASTPM, яких лікували розчинником (один або два рази на тиждень), демонстрували дефіцит контекстуальної диференціації, що вказує на порушення пізнавальної здатності у тварин. Даний дефіцит залишався незмінним після лікування 2E7, яке вводили один або два рази на тиждень. 3. Введення протягом 4 місяців 6-місячним мишам TASTPM Дане дослідження включало введення 2E7 (300 мкг внутрішньочеревинно двічі на тиждень) мишам TASTPM протягом 4 місяців, починаючи з 3 місяців від народження. Контрольні тварини одержували lgG2A у фосфатному буферному розчині. Як викладено вище, мозки були розкриті і розрізані навпіл. Праву півкулю зафіксували зануренням у 4 % параформальдегід і обробили для гістологічного дослідження. Ліву півкулю зібрали в попередньо зважені Еппендорфа об’ємом 2 мл, заморозили на 2E7 Послідовність амінокислот VH (SEQ ID NО: 17) 2E7 Послідовність ДНК VH (SEQ ID NО: 18) 2E7 Послідовність амінокислот VL (SEQ ID NО: 19) 2E7 Послідовність ДНК VL (SEQ ID NО: 20) 42 сухому льоду і зберігали при -80 °C для подальшого аналізу на вміст амілоїдів. Попередній аналіз одного зрізу з кожного випадкового вибору зразків мозку (n = 6 лікували розчинником, групу n = 7 лікували 2E7) провели з допомогою IHC, застосовуючи такий же загальний протокол, як описано вище. Статистичний аналіз (t-тест Стьюдента) демонструє істотне зменшення навантаження бляшок Aβ42 на таламус (71,9 %, p = 0,007) і в області ―таламус + кора + гіпокамп‖ (54,1 %, p = 0,022) у мишей, яким вводили дози 2E7, але відсутність істотних змін Aβ40. Для біохімічного вимірювання Aβ40 і Aβ42 у мозку зразки обробляли і здійснювали вимірювання, як описано вище (фактор розведення 1:10000). Вміст Aβ42 істотно зменшився (p = 0,01) — на 29,9 % у мишей, яким вводили дози 2E7 (контрольних n = 12, лікували n = 16). Концентрації Aβ40 також зменшилися (22,6 %), але дане зменшення не мало статистичної достовірності (p = 0,052). Клонування варіабельних ділянок гібридоми Послідовності варіабельних ділянок Всю РНК екстрагували з клітин гібридоми 2E7, і послідовності кДНК важких і легких варіабельних ділянок генерували зворотною транскрипцією і полімеразною ланцюговою реакцією (RT-PCR). Прямий праймер RT-PCR був сумішшю вироджених праймерів, специфічних для лідерних послідовностей гена імуноглобуліну мишей, і зворотний праймер був специфічним для константних ділянок антитіла, в даному випадку мишачий ізотип lgG2a для важкого ланцюга і мишача капа для легкого ланцюга. Праймери були розроблені згідно стратегії, описаної Jones і Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991). RT-PCR здійснювали в подвійному повторенні для обох послідовностей V-ділянки, щоб дозволити подальшу перевірку правильних послідовностей V-ділянки. Продукти V-ділянки, продуковані RT-PCR, клонували (Invitrogen TA Cloning Kit) і одержали дані послідовності. 43 Ділянки визначення комплементарності (CDR) підкреслені в послідовностях амінокислот. Клонування та експресія химери 2E7 Химерне антитіло 2E7 (2E7c), що складається з вихідних мишачих V ділянок, пересаджене до людського IgG1 (видозмінений Fc (L235A, G237A)) для важкого ланцюга або людських ділянок C капа для легкого ланцюга, генерували для експресії матеріалу рекомбінантного антитіла, 94734 44 який можна застосовувати для підтвердження правильного клонування функціональних мишачих V ділянок. ДНК, що кодує V ділянки 2E7 мишачих важких і легких ланцюгів і ендогенні мишачі сигнальні послідовності, була клонована в структуру ссавцевих векторів експресії RLD-bshe (для важкого ланцюга) і RLN-bshe (для легкого ланцюга), які вже містили людські константні ділянки (IgG1 Fc видозмінений (L235A, G237A) або людські C капа, відповідно). Елементи вектора експресії RLD-bshe для експресії важкого ланцюга: Базові пари Опис сегменту ДНК 0 - 1014 Промотор (SV40/RSV) 1015 - 2442 Важкі ланцюги антитіла 2443- 2765 Полі А 2766 - 3142 Промотор BG 3239 - 3802 DHFR 3803 - 4162 Полі А 4163 - 6322 Повні основи 5077 - 5937 (комплементарна нитка) Бета-лактамаза (положення елементів і повний розмір вектора наведені вище виключно з метою ілюстрації і залежатимуть від розміру вставки ланцюга антитіла) Елементи вектора експресії RLD-bshe для експресії легкого ланцюга: Базові пари Опис сегменту ДНК 0 - 1014 Промотор (SV40/RSV) 1015 - 1731 Легкий ланцюг антитіла 1732 - 2051 Полі А 2388 - 2764 Промотор BG 2774 - 3568 Неоміцин 3569 - 3876 Полі А 3877 - 6063 Повні основи 5077 - 5937 (комплементарна нитка) Бета-лактамаза (положення елементів і повний розмір вектора наведені вище виключно з метою ілюстрації і залежатимуть від розміру вставки ланцюга антитіла) Клони з правильно клонованими послідовностями VH і VL були ідентифіковані і виготовлені плазміди для експресії в клітинах CHO суспензійної культури. Експресовані антитіла 2E7c були очищені з супернатанту культури клітин хроматографією Протеїну А на системі FPLC, а потім перевірені на зв'язування з Aβ методом ELISA і TM SPR, застосовуючи технологію Biacore . Результати показали, що правильні V ділянки миші 2E7, клоновані та експресовані, в результаті дають функціональне антитіло з подібними характеристиками до вихідного мишачого антитіла 2E7. Гуманізація легкого ланцюга Людська послідовність з Genpept ID CAA51135 (SEQ ID NО: 24) і № X72467 одержана з банку генів, яка мала 77 % ідентичності на рівні амінокислот (зокрема CDR) була вибрана, як структура акцептора. Конструкція L1 являє собою трансплантат мишачих CDR з 2E7 ділянки VL в дану структуру акцептора. Гуманізація важкого ланцюга Людська послідовність № M99675 одержана до банку генів (SEQ ID NО: 21) алель гена VH3-48 з 74 % ідентичністю на рівні амінокислот (зокрема CDR 1 і 2) до 2E7 варіабельної важкої ділянки миші була вибрана як структура акцептора людського важкого ланцюга разом з людським мінігеном JH4. Три варіанти гуманізованих варіабельних важких ланцюгів були розроблені на основі 45 94734 послідовності M99675 і JH4. H1 являє собою трансплантат мишачих CDR, застосовуючи визначення Kabat з двома додатковими зворотними мутаціями структури в положеннях 93 і 94. H2 і 46 H3 обидва походять від H1, але включають по одній додатковій структурній мутації, які були різні в кожній конструкції; (положення 24 і 48 відповідно; див. Табл. 4). Таблиця 4 Конструкція H1 H2 Н3 Структури матриці М99675 і JH4 H1 H1 Залишок (Kabat#) 93,94 24 48 Конструювання гуманізованого важкого і легкого ланцюга ДНК Гуманізовані V ділянки ДНК синтезували наново створенням частково перекритих олігомерів та ПЛР ампліфікацією. Рестрикційні сайти для клонування в ссавцеві вектори експресії RLDbshe і RLN-bshe і сигнальні людські послідовності імуноглобуліну, що походять з вибраних структур людського акцептора, включалися. ДНК, що кодують гуманізовані V ділянки (H1 (SEQ ID NO: 27), H2 (SEQ ID NO: 29), H3 (SEQ ID NO: 31), L1 (SEQ ID NO: 33)) разом з сигнальними послідовностями і рестрикційними сайтами далі були клоновані в структуру ссавцевих векторів експресії: H1, H2 і H3 в RLD-bshe, для генерації ДНК, що кодує три модифікованих Fc важких ланцюга людського IgG1 повної довжини, кожний з яких містить мутації L235A і G237A, повної довжини H1 (SEQ ID NO: 35), повної довжини H2 (SEQ ID NO: 37) і повної довжини H3 (SEQ ID NO: 39); L1 клонований у структурі в RLN-bshe, що містить ДНК, яка кодує людську константну ділянку капа для генерації ДНК, яка кодує людський легкий ланцюг капа повної довжини (SEQ ID NO: 41). Характерні приклади експресії гуманізованих важких і легких ланцюгів комбінацій антитіл Клітини CHOK1 тимчасово трансфікували в малому масштабі усіма комбінаціями конструктів ДНК гуманізованих легких і важких ланцюгів: L1+H1, L1+H2, L1+H3 (SEQ ID NО: 35 + 41, 37 + 41, 39 + 41) на планшетах з 6 лунками. Клітини CHOK1, перенесені в DMEM F12, з 5 % ембріональною бичачою сироваткою, що містила дуже Людина A і R відповідно A V Миша Vі S відповідно V I мало IgG, і 2 ммоль глютаміну вирощували до злиття на планшетах з 6 лунками. Злиті клітини трансфікували загалом 7,5 мкг ДНК: 30 мкг ліпідів Transfast (Promega) в середовищі Optimem Glutamax (Invitrogen). Трансфіковані клітини інкубували при 37 °C з 5 % CО2. Через 72 години зібрали супернатант і досліджували щодо концентрації антитіла, а потім перевірили на зв'язування з людським Aβ з допомогою ELISA. Гуманізовані L1, об'єднані з трьома гуманізованими важкими ланцюгами, всі експресували повне антитіло, яке зв'язувалося з людським Aβ. Гуманізовані антитіла також експресували шляхом тимчасової трансфекції клітин CHOK1 у великих масштабах із застосуваням ліпосомної доставки ДНК (наприклад, TransFast (Promega)) і експресію в пляшках для культивування. Для оптимізації рівнів експресії в тимчасовій трансфекції застосовували співвідношення ДНК вектора експресії важкого до легкого ланцюга 1:6. Матеріал з тимчасової трансфекції був очищений із застосуванням колонок ProSepA або колонок FPLC з ProSepA HiTrap. Оцінка 2E7 гуманізованих варіантів H1L1, H2L1 і H3L1 в аналізі ELISA щодо зв'язування з βамілоїдами 2E7 гуманізовані варіанти H1L1, H2L1 і H3L1 були оцінені за зв'язуванням з людським пептидом Аβ (1-40), обробленим біотином на С-кінці. Химерний 2E7 застосовували як еталон. Табл. 5– 7 демонструють результати з різними партіями очищеного матеріалу тимчасової трансфекції у великих масштабах. Таблиця 5 ELISA Зв'язування з Аβ MAb Химера 2E7c H1L1 H2L1 H3L1 EC50 (мкг/мл) 0,033 0,035 0,048 0,044 Стандартна похибка 0,00144 0,00142 0,00202 0,00105 Таблиця 6 ELISA Зв'язування з Аβ MAb Химера 2E7c H1L1 H2L1 H3L1 EC50 (мкг/мл) 0,043 0,051 0,044 0,055 Стандартна похибка 0,00183 0,00164 0,00191 0,00094 47 94734 48 Таблиця 7 ELISA Зв'язування з Аβ MAb Химера 2E7c H1L1 H2L1 H3L1 Одержані результати показали дуже подібні профілі зв'язування з Aβ для кожного з гуманізованих варіантів похідних 2E7. Порівняння значень EC50 для 2E7c показало невелике зменшення активності зв'язування Aβ, яке відбулося в ході процесу гуманізації. Порівняння гуманізованих варіантів 2E7 в конкурентному ELISA 2E7c химерні і гуманізовані антитіла H1 L1, H2L1 і H3L1 були оцінені за їх здатністю інгібувати зв'язування між людським Аβ пептидом і материнським 2E7 MAb миші в конкуренції ELISA. EC50 (мкг/мл) 0,044 0,047 0,041 0,040 Стандартна помилка 0,00169 0,00265 0,00174 0,00116 Два типи конкурентного ELISA здійснили для порівняння активності зв'язування Aβ трьох гуманізованих варіантів у порівнянні з химерним антитілом 2E7. 1) Іммобілізований β-амілоїд; людський пептид Aβ (1-40), оброблений біотином, був іммобілізований за допомогою стрептавідину на планшетах ELISA. Антитіло миші 2E7 додавали в константній концентрації разом з серіями розведення різних гуманізованих антитіл похідних 2E7. Зв'язаний 2E7 MAb миші потім виявили з'єднаним IgG анти-миші. Таблиця 8 демонструє результати двох аналізів. Таблиця 8 Конкурентне MAb Химера 2E7c H1L1 H2L1 H3L1 Експеримент 1 IC50 (мкг/мл) Стандартна похибка 1,31 0,20 1,62 0,40 1,28 0,26 1,53 0,16 2) β-амілоїд у розчині; константна концентрація β-амілоїдів попередньо витримувалася з серіями розведення гуманізованих варіантів антитіла 2E7 —суміш, яка містила комплексні та вільні амілоїди, додали ненадовго до лунок, що містили Експеримент 2 IC50 (мкг/мл) Стандартна похибка 1,29 0,13 1,76 0,21 1,66 0,28 1,39 0,23 іммобілізований 2E7 MAb миші. Потім виявили кількість вільних β-амілоїдів, яка була все ще доступна для зв'язування іммобілізованим материнським 2E7 MAb. Таблиця 9 демонструє результати двох аналізів. Таблиця 9 Конкурентне MAb Химера 2E7c H1L1 H2L1 H3L1 Експеримент 1 IC50 (мкг/мл) Стандартна похибка 0,052 0,006 0,114 0,014 0,075 0,009 0,069 0,004 Всі гуманізовані варіанти антитіла інгібували зв'язування 2E7 MAb миші з β-амілоїдом з дуже подібним профілем. Значення IC50, генеровані для варіантів H2L1 і H3L1, були дуже близькі до значень химери (якщо їх використовували) 2E7c, яка мала найвищу інгібуючу активність в обох аналізах. Однак, варіант H1L1 демонстрував дещо зменшену інгібуючу активність в обох аналізах, вказуючи на можливу дещо нижчу спорідненість до β-амілоїду. ТМ Аналіз SPR Biacore 2E7, 2E7c, H1L1, H2L1,H3L1 Параметри кінетики зв'язування рекомбінантного 2E7 MAb миші, химерного 2E7c і гуманізованих варіантів H1L1, H2L1 і H3L1 з людськими βамілоїдними пептидами (1-40) і (1-42) оцінили, застосовуючи аналіз Biacore на Biacore 3000. Застосовували два різні формати аналізу. Експеримент 2 IC50 (мкг/мл) 0,140 0,119 0,115 Стандартна похибка 0,024 0,014 0,013 Метод А (i) Якщо коротко, < 20 одиниць резонансу βамілоїдного 1-40 пептиду (обробленого біотином в C-кінці) були захоплені на мікрочипі стрептавідину (як застосовували для табл. 10A). Антитіла були розбавлені в буфері HBS-EP і проходили через поверхню стрептавідин/β-амілоїд у ряді концентрацій від 0,001 нM до 8 нM (для табл. 10A). Здійснювали два окремі цикли; кожний цикл здійснювали на новій поверхні стрептавідин/βамілоїд. Цикли 1 і 2 були по суті однаковими, хоча існували деякі відмінності у використовуваних параметрах; Цикл 1 здійснювали з допомогою поверхні мікрочіпу, на якій 16 одиниць резонансу β-амілоїда було захоплено, і застосовували концентрації антитіл 0,001–8 нM, час асоціації 4 хвилини і час дисоціації 20 хвилин застосовували при швидкості потоку 50 мкл/хв. Для Циклу 2 49 94734 менш ніж 10 одиниць резонансу β-амілоїда було захоплено, і застосовували концентрації антитіл 0,003125–8 нM. Швидкість потоку і час асоціації були такими ж, для Циклу 1, однак час дисоціації зменшився до 15 хвилин. (ii) β-амілоїди (1-40) і (142) були зв'язані з аміном на різних поверхнях мікрочипі біодатчика CM5 до рівня