Спосіб одержання бактеріального концентрату прямого внесення на основі грибкової кефірної закваски

Реферат: Спосіб одержання бактеріального концентрату прямого внесення на основі грибкової кефірної закваски передбачає приготування інокуляту грибкової кефірної закваски, молочнокислих бактерій та дріжджів, приготування ростового середовища, нарощування бактеріальної маси, відокремлення біомаси, змішування із захисним середовищем та сублімаційне сушіння. Як молочнокислі бактерії інокулят містить штами молочнокислих мікроорганізмів Lactococcus lactis ssp. lactis ІMB B-7296, Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetilactis IMB B-7295, Streptococcus thermophilus IMB B-7292, а як дріжджі містить дріжджі виду Saccharomyces unisporus IMB Y5040. Завдяки модифікації складу ростового середовища, зміні режимів культивування бактеріальної маси та застосуванню нового захисного середовища досягається інтенсифікація та спрощення технологічного процесу виробництва. Забезпечення високих показників активності та швидкості реактивації під час внесення бактеріального концентрату у молоко дає змогу подовжити строк придатності до зберігання кисломолочного продукту, виробленого з використанням бактеріального концентрату зі збереженням полівидового складу. UA 98914 C2 (12) UA 98914 C2 UA 98914 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біотехнології і може бути використаний у молочній промисловості у виробництві кефіру та кефірних напоїв. Відомо спосіб виробництва бактеріального концентрату К-2 на основі грибкової культури "Київська К-1" [ТУ У 577/49-1-92 Концентрат сухой бактериальный К-2 на основе грибковой культуры "Киевская К-1"]. Спосіб дозволяє одержувати препарат з широким діапазоном вмісту бактеріальних складових кефірного грибка - молочнокислих та оцтовокислих мікроорганізмів, дріжджів, що не завжди забезпечує необхідний баланс молочнокислого та спиртового бродіння. Як наслідок, продукт, отриманий з використанням такої заквашувальної культури, характеризується нестабільними мікробіологічними та органолептичними показниками. Одержана таким чином суха культура не містила бактерії у співвідношенні, характерному для симбіотичної грибкової закваски, і використання її у виробництві кефіру не може повністю відтворити його смакові якості. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб одержання сухого концентрату грибкової кефірної закваски для виробництва кефіру, який передбачає культивування грибкової кефірної закваски, збагаченої чистою культурою лактозопозитивних дріжджів виду Candida kefyr [Патент України 74769 С2, МПК (2006) C12N 1/20, А23С 9/12]. Недоліком цього способу є те, що залучення штаму дріжджів Candida kefyr призводить до зброджування лактози, активізуючи спиртове бродіння, та, відповідно, утворення вуглекислого газу. Надмірне накопичення продуктів життєдіяльності дріжджів спричиняє здуття упаковки кефіру, у результаті - продукт не придатний до тривалого зберігання. Зависокий вміст у бакконцентраті лактобацил, які характеризуються інтенсивним накопиченням молочної кислоти за температурних режимів сквашування кефіру, призводить до появи у готовому продукті вади «надлишкова кислотність». 8 Наявність у бакконцентраті оцтовокислих бактерій у кількості до 10 КУО/г спричиняє стрімке накопичення оцтової кислоти та в'язких полісахаридів, що провокує "ослизнявіння" продукту та відчутно погіршує його органолептичні характеристики. Крім того, біотехнологія цієї заквашувальної культури передбачає довготривале упродовж 16-18 год., накопичення біомаси, а поживне середовище включає гідроліз білків молока протосубтиліном за температури 55 °C упродовж 3 годин, що вимагає для приготування додаткових витрат часу та енерговитрат. Задачею винаходу, що пропонується, є одержання бактеріального концентрату для кефіру та кефірних напоїв з помірним рівнем газоутворення зі збереженням полівидового складу та симбіотичних відносин складових мікроорганізмів, притаманних природній асоціації кефірних грибків, інтенсифікація та спрощення технологічного процесу його виробництва, забезпечення високих показників активності та швидкості реактивації під час внесення бактеріального концентрату у молоко, подовження строку придатності до зберігання кисломолочного продукту, виробленого з використанням бактеріального концентрату. Це досягається за рахунок збагачення природного симбіозу грибкової кефірної закваски мікрофлорою, виділеною виключно з кефірних грибків: молочнокислими бактеріями видів Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetilactis, Streptococcus thermophilus та дріжджами Saccharomyces unisporus, не здатними до зброджування лактози. Завдяки вдосконаленню складу ростового середовища для накопичення бактеріальної маси, попередній підготовці інокуляту та використанню захисного середовища на основі буферного розчину відбувається прискорення технологічного процесу та підвищення активності бакконцентрату. Використовують 3 ростове середовище наступного складу (г/дм води): суха сироватка - 30, глюкоза - 10, натрій лимоннокислий тризаміщений - 10, лактоза - 5, пептон - 3, сухий дріжджовий екстракт - 3, натрій оцтовокислий однозаміщений - 2, аскорбінова кислота - 0,5, марганець сірчанокислий - 0,16, а нарощування бактеріальної маси проводять за температури (33±1)°С упродовж 11-12 год. з періодичним або безперервним розкисленням до рН (6,7±0,1). Виробництво традиційного кефіру засновано на використанні мікрофлори кефірних грибків, яка є симбіозом багатьох видів бактерій - Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Acetobacter та дріжджів. Тому під час сквашування проходить два основних види бродіння: молочнокисле та спиртове, в результаті яких накопичується широка гама смако-ароматичних речовин, молочної кислоти, оцтової кислоти, етилового спирту, вуглекислого газу тощо, які обумовлюють специфічні органолептичні показники кефіру. Проте співвідношення складових мікроорганізмів кефірних заквасок може змінюватися, що зумовлює нестабільність перебігу ферментативного процесу під час виробництва кефіру. Природній асоціації грибкової кефірної закваски притаманний склад дріжджової мікрофлори з перевагою лактозонегативних штамів, тому найперспективнішим шляхом вдосконалення технології одержання бактеріального концентрату для кефіру є біостабілізація грибкової кефірної закваски додатковим введенням незброджуючих лактозу дріжджів та мезофільних лактококів у співвідношенні, властивому для кефірних грибків. 1 UA 98914 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Особливістю способу, який заявляється, є збагачення мікрофлори грибкової кефірної закваски штамами молочнокислих бактерій та дріжджів, виділених виключно з кефірного грибка. Спосіб передбачає внесення у ростове середовище грибкової кефірної закваски та штамів молочнокислих мікроорганізмів видів Lactococcus lactis ssp. lactis 1MB B-7296 (L. lactis ІMB B7296), Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetilactis ІMB B-7295 (L. diacetilactis ІMB B-7295) та Streptococcus thermophilus 1MB B-7292 (S. thermophilus ІMB B-7292) у співвідношенні 1:1:1:1, відповідно, у кількості 4-5 % від об'єму ростового середовища, та штаму дріжджів Saccharomyces unisporus ІMB У-5040 (S. unisporus ІMB У-5040) у кількості 1 % від об'єму ростового середовища. Використання як основи грибкової кефірної закваски гарантує збереження полівидового складу бактеріального концентрату, забезпечуючи наявність у заквашувальній культурі термота мезофільних лактобацил, оцтовокислих бактерій, дріжджів з різним типом ферментування лактози у тісному природному симбіозі. Збагачення мікрофлори грибкової кефірної закваски додатковими штамами молочнокислих бактерій інтенсифікує ферментування молока без надмірного кислотоутворення. Молокозсідальна активність молочнокислих лактококів L. lactis ІMB В-7296, L. diacetilactis ІMB В7295 - 7 годин, гранична кислотність у молоці відповідно 120 °Т та 96 °Т. При внесенні 3 % культури у стерильне молоко за температури 30 °C штами утворюють нев'язкі однорідні згустки. Штам L. diacetilactis ІMB В-7295 володіє здатністю до продукування ароматичних речовин діацетилу, летких органічних кислот - та вуглекислого газу, завдяки чому готовий продукт набуває вираженого кисломолочного смаку та аромату з легким освіжаючим присмаком. Штам S. thermophilus ІMB В-7292 здатний до сквашування молока за температури від 30 °C до 40 °C упродовж 6 годин з формуванням щільного в'язкого молочного згустку, гранична кислотність якого не перевищує 98 °Т. Всі штами молочнокислих бактерій резистентні до дії бактеріофагів. Їх залучення до складу бактеріального концентрату дасть змогу підвищити молокозсідальну активність, прискорити сквашування продукту, забезпечуючи утворення однорідної, в міру в'язкої консистенції. Застосування штаму дріжджів S. unisporus ІMB У-5040, не здатних до зброджування лактози, дає змогу одержати продукт з характерними для кефіру якісними ознаками, зберігаючи природне співвідношення між дріжджами з різною біохімічною активністю. Клітини дріжджів крупні, овальні, спосіб вегетативного розмноження - брунькування. На морфологічному агарі штам росте з утворенням на поверхні білих матових випуклих колоній з рівними краями та гладкою блискучою поверхнею. На пластині з картопляним агаром штам росте з утворенням примітивного малорозвиненого псевдоміцелію; істинного міцелію, артро- та балістоспори не утворює. Штам зброджує глюкозу, не зброджує лактозу, мальтозу, сахарозу, рамнозу, трегалозу, асимілює глюкозу, лактозу, мальтозу, сахарозу, рамнозу, а також цитрат, нітрат та Lлізин. Здатний до росту у середовищі без вітамінів. Не росте за вмісту глюкози вище 50 % та за температури 37 °C. Оптимальна температура росту - (25±1)°С. Реакція з діазонієм блакитним негативна. При внесенні 5 % інокуляту у глюкозопептонному середовищі за температури 25 °C 3 3 упродовж 5 діб штам утворює 230 мг/100 см етилового спирту, 120 мг/100 см летких органічних кислот у перерахунку на оцтову кислоту. Відмітною ознакою штаму S. unisporus ІMB У-5040 є стійкість до ліофілізації: рівень виживання клітин під час заморожування та сушіння становить від 93,4 % до 98,7 %. Такі показники гарантують одержання ліофілізованого бакконцентрату для кефіру зі стабільним вмістом дріжджової мікрофлори. Під час ферментування молочної основи штам дріжджів S. unisporus ІMB У-5040 асимілює молочний цукор без накопичення надмірної кількості вуглекислого газу. Означені властивості цього штаму дріжджів дають змогу подовжити термін придатності до споживання виробленого кисломолочного продукту до 14 діб зі збереженням необхідних органолептичних та мікробіологічних показників, властивих кефіру (кресл.). У свіжовиробленому продукті за 3 однакової чисельності дріжджів 1·10 КУО/г рівень СО2 у разі використання прототипу був у 2,5 рази вищий, ніж при застосуванні бакконцентрату, що заявляється. Упродовж зберігання обох зразків кефірів спостерігали поступове збільшення кількості дріжджів та накопичення продуктів бродіння, але швидкість росту різнилася. Тоді як продукт з прототипом вже на 10 добу був непридатним для споживання, кефір з використанням заявленого бакконцентрату за рахунок додаткового залучення до складу мікрофлори штам дріжджів S. unisporus ІMB У-5040 через 14 діб характеризувався помірним рівнем СО2 до 1,7 см, приємним кисломолочним тонізуючим смаком, злегка пінною консистенцією. Згідно зі заявленим способом, для інтенсифікації росту заквашувальної композиції 3 використовують ростове середовище наступного складу (г/дм води): суха сироватка - 30, глюкоза - 10, натрій лимоннокислий тризаміщений - 10, лактоза - 5, пептон - 3, сухий 2 UA 98914 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 дріжджовий екстракт - 3, натрій оцтовокислий однозаміщений - 2, аскорбінова кислота - 0,5, марганець сірчанокислий - 0,16. Як джерело азотного живлення застосовують пептон та суху молочну сироватку, яка водночас містить значну кількість лактози, середовище додатково збагачують вуглеводами - лактозою та глюкозою, а також стимуляторами росту - дріжджовий екстракт, натрій лимоннокислий тризаміщений, натрій оцтовокислий, аскорбінова кислота, марганець сірчанокислий. Ростове середовище такого складу містить розчинні азотовмісні 3 сполуки у кількості 18,20 мг/см , серед яких частка розчинного білку пептидів різної молекулярної маси становить 62,5 %, а вільних амінокислот - 7,2 %. Середовище характеризується співвідношенням «вуглеводи:розчинний азот» C:N=2,0, що є раціональним для нарощування бактеріальної маси як молочнокислих бактерій, так і дріжджів, на відміну від відомого способу, згідно з яким C:N=1,2. Готування ростового середовища передбачає розчинення у воді за температури 30-35 °C всіх компонентів, крім глюкози та аскорбінової кислоти, та стерилізацію за температури (121±1)°С упродовж 30 хв. Глюкозу та аскорбінову кислоту вносять у стерильне ростове середовище у вигляді 30-40 % окремо простерилізованих розчинів перед внесенням інокуляту. Порівняно з відомим способом, завдяки вдосконаленню складу ростового середовища за рахунок залучення сухої сироватки та пептону та, відповідно, виключення технологічної операції гідролізу білків молока тривалість готування середовища скорочується на 2-3 години (таблиця 1). Температура культивування заквашувальної композиції під час виробництва бактеріального концентрату, що заявляється, становить (33±1)°С. Нижча температура не забезпечує достатнього розвитку термофільної мікрофлори, разом з тим підвищення температури нарощування біомаси понад 34 °C ініціює стрімкий розвиток термофільних лактобацил, а ріст інших представників мікрофлори, особливо дріжджів, істотно сповільнюється. Бактеріальну масу нарощують упродовж 11-12 годин за температури (33±1)°С з періодичним або безперервним нейтралізуванням до рН 6,6. Тривале культивування кефірної закваски спричиняє порушення балансу кефірної мікрофлори, що супроводжується активним розвитком бактерій роду Acetobacter з утворенням надлишкової кількості оцтової кислоти, що пригнічує розвиток молочнокислої мікрофлори, а також негативно позначається на органолептичних якостях виробленого кисломолочного продукту. Порівняно з прототипом, додаткове збагачення середовища азотовмісними речовинами і вуглеводами та підвищення температури культивування до 32-34 °C дає змогу скоротити тривалість нарощування біомаси відповідно до запропонованого методу на 4-7 годин. Згідно зі способом, що заявляється, для збереження полівидового складу та симбіотичних взаємовідносин заквашувальної композиції під час ліофільного сушіння використовують захисне середовище на основі фосфатного буферного розчину, яке містить сахарозу, желатин, лимоннокислий натрій, калій фосфорнокислий двозаміщений (К2НРО4), натрій фосфорнокислий тризаміщений (NaH2PO4), кальцій хлористий (СаСl2), магній сірчанокислий (MgSO4). Використання захисного середовища дозволяє зберегти всі види мікроорганізмів та забезпечити високий рівень реактивації сухого бакконцентрату після внесення у молоко. Захисне середовище заявленого складу характеризується нейтральним рівнем активної кислотності (pH 6,80), буферна ємність цього середовища становить 0,32 екв. молочної кислоти / од. pH, після розведення середовища удвічі - рівень активної кислотності збільшується на 0,22 од. pH, а у разі внесення 0,1 молю нейтральної солі ефект становить 0,03 од. pH. Зі зміною температури від 20 °C до 0 °C кислотність знижується на 0,05 од. pH (-0,003 од. pH/°С), що підвищує захист клітин та обмежує згубну дію кислоти на мікробну популяцію. Крім того, позитивний ефект має залучення до складу захисного середовища хлористого кальцію та сульфату магнію: їх внесення у молочну основу сприяє стабілізації білкової структури молочного згустку під час сквашування. Бактеріальну масу змішують зі захисними середовищами у співвідношенні 1:2, відповідно. Про ефективність його застосування свідчить високий ступінь виживання клітин молочнокислих бактерій гомо- та гетероферментативного типу після ліофільного сушіння - 99,0 %, а також дріжджів - 78,0 %, що значно вище за аналогічні показники відомого способу (таблиця 1). Завдяки збагаченню мікрофлори грибкової кефірної закваски молочнокислими лактококами, модифікації складу ростового середовища, зміні режимів культивування бактеріальної маси та застосуванню нового захисного середовища активність заявленого бакконцентрату становить 6,0-6,5 годин, що на 1 годину випереджає прототип. Крім того, після внесення у молочну суміш заявлений бакконцентрат характеризується швидшим кислотоутворенням, тобто вищою швидкістю реактивації: через 3 години сквашування молочної основи титрована кислотність досягає 32 °Т, тоді як у разі застосування відомого бакконцентрату цей показник становить 3 UA 98914 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 лише 25 °Т. Такі показники заявленого бакконцентрату дають змогу застосовувати його для прямого внесення у молочну основу під час виготовлення кефіру або кефірних напоїв, спрощуючи технологічний процес та мінімізуючи ризик стороннього бактеріального забруднення та враження бактеріофагами. Виробництво бакконцентрату згідно зі заявленим способом є доцільним, оскільки вихід 3 сухого бакконцентрату зі 100 дм ростового середовища становить 775 г, що у 1,8 рази вище, ніж за відомим способом. Про перевагу застосування бакконцентрату згідно зі способом, що заявляється, свідчать фізико-хімічні та мікробіологічні показники вироблених кисломолочних продуктів (таблиця 2). За рахунок збагачення мікрофлори грибкової кефірної закваски штаму дріжджів S. unisporus IMB У5040, які не здатні до зброджування лактози, у готовому продукті рівень газоутворення є значно нижчим за аналогічний показник кефіру, виробленого з використанням прототипу. Разом з тим, за однакової кількості молочнокислих бактерій чисельність дріжджів у продукті була на порядок вищою, ніж у прототипі, забезпечуючи відповідність кефіру вимогам національних та міжнародних нормативних документів, що пов'язано з кращим виживанням дріжджів під час ліофілізації бакконцентрату. Додаткове залучення до складу заявленого бакконцентрату штаму S. thermophilus дало змогу поліпшити показники вологоутримуючої здатності та в'язкості утвореного молочного згустку. Крім того, кефір, вироблений зі застосуванням заявленого бакконцентрату, характеризується меншим вмістом оцтовокислих бактерій та лактобацил, завдяки чому продукту притаманна нижча кислотність та відсутність вади «слизиста консистенція». Спосіб здійснюють таким чином. Кефірні грибки культивують у пастеризованому знежиреному молоці у співвідношенні 1:40 за температури (20±1)°С упродовж 16-18 год. Одержану закваску відокремлюють від кефірних грибків. Окремо у стерильному знежиреному молоці культивують штами молочнокислих бактерій: L. lactis IMB В-7296 і L. diacetilactis IMB В-7295 - за температури (32±1)°С, S, thermophilus IMB В-7292 - за температури (37±1)°С до утворення згустку. Дріжджі S. unisporus IMB У-5040 нарощують за температури (25±1)°С у глюкозо-пептонному середовищі упродовж 3 діб. 3 Для накопичення бактеріальної маси готують ростове середовище наступного складу (г/дм води): суха сироватка - 30, глюкоза - 10, натрій лимоннокислий тризаміщений - 10, лактоза - 5, пептон - 3, сухий дріжджовий екстракт - 3, натрій оцтовокислий однозаміщений - 2, аскорбінова кислота - 0,5, марганець сірчанокислий - 0,16. Готування ростового середовища передбачає розчинення у воді за температури 30-35 °C сухої сироватки та пептону, внесення решти компонентів, крім глюкози та аскорбінової кислоти, та стерилізацію за температури (121±1)°С упродовж 30 хв. Глюкозу та аскорбінову кислоту вносять у стерильне ростове середовище у вигляді 30-40 % окремо простерилізованих розчинів перед внесенням інокуляту. Активну кислотність ростового середовища встановлюють (6,7±0,1) од. pH, використовуючи 25 %-ний водний розчин аміаку. У підготовлене ростове середовище вносять грибкову кефірну закваску та інокулят штамів L. lactis IMB В-7296, L. diacetilactis IMB В-7295 та S. thermophilus IMB В-7292 у співвідношенні 1:1:1:1, відповідно, у кількості 4-5 % від об'єму ростового середовища та інокулят дріжджів S. unisporus IMB У-5040 у кількості 1 % від об'єму ростового середовища. Бактеріальну масу нарощують упродовж 11-12 годин за температури (33±1)°С з періодичним або безперервним нейтралізуванням до pH (6,7±0,1), використовуючи 25 %-ний водний розчин аміаку. Наприкінці культивування ростове середовище охолоджують до температури (8±2)°С та відокремлюють біомасу шляхом центрифугування. Одержану сиру бактеріальну масу змішують у співвідношенні 1:2 зі захисним середовищем на основі фосфатного буферного розчину з pH 3 6,8, що містить (г/дм ): сахарозу - 20,00, желатин - 2,50, лимоннокислий натрій - 1,00, калій фосфорнокислий двозаміщений (К2НРО4) - 1,00, натрій фосфорнокислий три заміщений (NaH2PO4) - 1,05, кальцій хлористий (СаСl2) - 1,00, магній сірчанокислий (MgSO4) - 1,00. Суспензію, що утворилася розливають у стерильні кювети шаром 5-7 мм, заморожують в морозильній шафі за температури мінус (35±5)°С упродовж 14-18 годин, а потім висушують у сублімаційній сушарці з початковою температурою процесу мінус (25±2)°С та кінцевою - плюс (30±2)°С упродовж 16-20 годин. Сухий бакконцентрат у асептичних умовах подрібнюють у порошок та фасують. Приклади здійснення способу. Приклад 1. Для приготування грибкової кефірної закваски пастеризоване молоко в кількості 2 л заквашують 40 г кефірних грибків і культивують упродовж 18 год. за температури 20 °C. 4 UA 98914 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Свіжоприготовлену закваску відокремлюють від кефірних грибків. Окремо у 1,2 л стерильного знежиреного молока культивують штами молочнокислих бактерій: L. lactis IMB В-7296 і L. diacetilactis IMB В-7295 - за температури (32±1)°С, S. thermophilus IMB В-7292 - за температури (37±1)°С до утворення згустку. Дріжджі S. unisporus IMB У-5040 нарощують за температури (25±1)°С у 1 л глюкозо-пептонному середовищі упродовж 3 діб. Інокулят молочнокислих мікроорганізмів нарощують на відновленому знежиреному молоці впродовж 12 годин за температури 30 °C. Інокулят дріжджів культивують за температури 25 °C упродовж 3 діб. 3 Для приготування ростового середовища у 100 дм підігрітої до температури 35 °C водопровідної води за перемішування розчиняють 3000 г сухої сироватки та 300 г пептону, після їхнього повного розчинення додають 1000 г натрію лимоннокислого тризаміщеного, 500 г лактози, 300 г сухого дріжджового екстракту, 200 г натрію оцтовокислого 3-водного, 16 г марганцю сірчанокислого. Активну кислотність ростового середовища до його стерилізації встановлюють на рівні 7,8 од. pH. Середовище стерилізують безпосередньо у ферментері за температури 121 °C упродовж 30 хв., потім охолоджують до температури 33 °C. 3 3 У 2 дм водопровідної води розчиняють 1000 г глюкози, а у 200 см водопровідної води - 50 г аскорбінової кислоти, обидва розчини пропускають крізь бактеріальні фільтри, та асептично вносять у стерилізоване ростове середовище за перемішування. Активну кислотність середовища встановлюють на рівні 6,7 од. pH. 3 3 У ростове середовище вносять: 1,2 дм грибкової кефірної закваски, 1,2 дм L. lactis IMB В3 3 3 7296, 1,2 дм L. diacetilactis IMB В-7295, 1,2 дм S. thermophilus IMB В-7292 та 1,0 дм S. unisporus IMB У-5040. Культивування мікроорганізмів проводять упродовж 12 годин за температури 33 °C з періодичною нейтралізацією культуральної рідини 25 % розчином аміаку до активної кислотності 6,6 од. pH. Першу нейтралізацію проводять через 3 години, далі - через кожні 2 години. Після закінчення нарощування бактеріальної маси культуральну рідину охолоджують до температури 8 °C та відокремлюють біомасу від поживного середовища на суперцентрифузі. 3 Вихід сирої біомаси після центрифугування складає 1230 г зі 100 дм ростового середовища. 3 Для приготування захисного середовища у 1,2 дм водопровідної води розчиняють 24 г сахарози, 3 г желатину, 1,2 г лимоннокислого натрію, 1,2 г К2НРО4, 1,26 г NaH2PO4, 1,2 г СаСl2 та 1,2 г MgSO4. Захисне середовище стерилізують за температури 121 °C упродовж 30 хв. та охолоджують до температури 20 °C. Відокремлену бактеріальну масу змішують з приготовленим захисним середовищем. Суспензію розливають у стерильні кювети шаром 5 мм, заморожують в морозильній шафі за температури мінус 35 °C упродовж 14 годин, а потім висушують у сублімаційній сушарці з початковою температурою процесу мінус 25 °C та кінцевою - плюс 32 °C упродовж 16 годин. Сухий бакконцентрат у асептичних умовах подрібнюють у порошок та фасують. 3 Вихід сухого бакконцентрату становить 775 г зі 100 дм ростового середовища, його активність складає 6,0 год., а через 3 години після заквашування молочної суміші приріст титрованої кислотності становить 32 °Т. Приклад 2. Спосіб здійснюють аналогічно прикладу 1, за винятком того, що нарощування бактеріальної маси проводять за температури 26 °C упродовж 16 год. 3 Вихід сирої біомаси після центрифугування складає 870 г зі 100 дм ростового середовища, 3 вихід сухого бакконцентрату становить 530 г зі 100 дм ростового середовища, його активність складає 8,0 год., а через 3 години після заквашування молочної суміші приріст титрованої кислотності становить 28 °Т. Приклад 3. Спосіб здійснюють аналогічно прикладу 1, за винятком того, що у ростове 3 3 середовище вносять інокулят: 3,0 дм грибкової кефірної закваски, 0,6 дм L. lactis IMB В-7296, 3 3 3 0,6 дм L. diacetilactis IMB В-7295, 0,6 дм S. thermophilus IMB В-7292 та 1,0 дм S. unisporus IMB У-5040. Вихід сирої біомаси після центрифугування складає 750 г зі 100 дм ростового середовища, 3 вихід сухого бакконцентрату становить 460 г зі 100 дм ростового середовища, його активність складає 9,0 год., а через 3 години після заквашування молочної суміші приріст титрованої кислотності становить 28 °Т. Порівняльну характеристику бактеріальних концентратів, які одержано за прикладами 1-3 та прототипом, представлено у таблиці 3. Виробництво бакконцентрату для кефіру та кефірних напоїв згідно зі запропонованим способом дає змогу одержати заквашувальну культуру зі збереженням полівидового складу та 5 UA 98914 C2 5 10 симбіотичних відносин складових мікроорганізмів, притаманних природній асоціації кефірних грибків, інтенсифікувати та спростити технологічний процес виробництва бакконцентрату, досягти високих показників активності та швидкості реактивації під час внесення бактеріального концентрату у молоко та помірного рівня газоутворення під час сквашування, подовжити строк придатності до зберігання кисломолочного продукту, виробленого з використанням бактеріального концентрату. Спосіб одержання бактеріального концентрату прямого внесення на основі грибкової кефірної закваски, що поліпшує показники якості готового продукту та подовжує термін його придатності до споживання, рекомендовано для застосування у молочній промисловості у виробництві кефіру та кефірних напоїв. Таблиця 1 Порівняльна характеристика біотехнології бактеріальних концентратів, які одержано за прототипом та заявленим способами Показники Видовий склад мікрофлори Готування основи ростового середовища Внесення компонентів ростового середовища Співвідношення «вуглеводи : розчинний азот» ростового середовища Режими культивування біомаси Склад захисного середовища Активна кислотність захисного середовища Ступінь виживання під час ліофілізації: молочнокислих мікроорганізмів і дріжджів Вихід сухого 3 бакконцентрату зі 100 дм ростового середовища, г Активність (час 3 сквашування 1 дм молока за внесення 1 г бакконцентрату), годин Титрована кислотність заквашеної молочної суміші через 3 години за 30 °C.°Т Прототип Грибкова кефірна закваска, Candida kefyr Гідроліз білків сухого знежиреного молока протосубтиліном за температури 55 °C упродовж 3 годин натрій лимоннокислий тризаміщений, натрій оцтовокислий, глюкоза, аскорбінова кислота, марганець сірчанокислий, кукурудзяний або дріжджовий екстракт C:N=1,2 Бактеріальний концентрат, що заявляється Грибкова кефірна закваска, L. diacetilactis, L.lactis, S. thermophilus, S. unisporus Розчинення сухої сироватки та пептону за температури 3035 °C натрій лимоннокислий тризаміщений, натрій оцтовокислий, глюкоза, аскорбінова кислота, марганець сірчанокислий, дріжджовий екстракт, лактоза С:N=2,0 Температура 26-28 °C упродовж 16-18 годин Температура (33±1)°С упродовж 11-12 годин сахароза, желатин, желатин, автолізат дріжджів, лимоннокислий натрій, К2НРО4, глюкоза, аскорбінова кислота, вода NaH2PO4, СаСl2, MgSO4 5,70 од.pH 6,80 од. pH 97,5 % 99,0 % 60 % 78,0 % 420 775 7,0-8,0 6,0-6.5 25 32 6 UA 98914 C2 Таблиця 2 Порівняльна характеристика свіжовироблених кисломолочних продуктів, вироблених зі застосуванням заявленого бакконцентрату та відомого Прототип Рівень утворення СО2 за висотою підняття молочного згустку, см Вологоутримувальна здатність, % Кінематична в'язкість, м /с Титрована кислотність, °Т Загальна кількість молочнокислих мікроорганізмів, 3 КУО/см у т.ч. лактобацил 3 Кількість дріжджів, КУО/см Кількість оцтовокислих бактерій, 3 КУО/см Бактеріальний концентрат, що заявляється 1,2 Показники 0,8 84 92 -4 -4 3,73·10 105 4,24·10 90 8 5,3·10 8 4,8·10 6 10 3 1,2·10 5 3 10 10 2 1,8·10 2 10 Таблиця 3 Порівняльна характеристика бактеріальних концентратів, виготовлених за прикладами 1-3, та прототипом Показники Вихід сирої бактеріальної маси 3 зі 100 дм ростового середовища, г Вихід бакконцентрату зі 100 3 дм ростового середовища, г Активність, час сквашування 1 3 дм молока при внесенні 1 г бакконцентрату, годин Титрована кислотність заквашеної молочної суміші через 3 години за 30 °C,°T 5 10 15 20 Приклад 1 Приклад 2 Приклад 3 Прототип 1230 870 750 650 775 530 460 420 6,0 8,0 9,0 7,0 32 28 28 25 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ Спосіб одержання бактеріального концентрату прямого внесення на основі грибкової кефірної закваски передбачає приготування інокуляту грибкової кефірної закваски, молочнокислих бактерій та дріжджів, приготування ростового середовища, нарощування бактеріальної маси, відокремлення біомаси, приготування захисного середовища, змішування з захисним середовищем та сублімаційне сушіння, який відрізняється тим, що в ростове середовище, яке 3 містить (г/дм води) суху сироватку в кількості 30, глюкозу - 10, натрій лимоннокислий тризаміщений - 10, лактозу - 5, пептон - 3, сухий дріжджовий екстракт - 3, натрій оцтовокислий однозаміщений - 2, аскорбінову кислоту - 0,5, марганець сірчанокислий - 0,16, вносять інокулят, для якого використовують грибкову кефірну закваску та штами молочнокислих мікроорганізмів Lactococcus lactis ssp. lactis ІMB B-7296, Lactococcus lactis ssp. lactis biovar diacetilactis IMB B7295, Streptococcus thermophilus IMB B-7292 у співвідношенні 1:1:1:1 відповідно, у кількості 4-5 % від об'єму ростового середовища, а дріжджі виду Saccharomyces unisporus IMB Y-5040 вносять у кількості 1 % від об'єму ростового середовища і нарощують бактеріальну масу за температури 33±1 °С протягом 11-12 год з періодичним або безперервним розкисленням до pH 6,7±0,1, потім змішують бактеріальну масу у співвідношенні 1:2 із захисним середовищем на 3 основі фосфатного буферного розчину з pH 6,8, що містить (г/дм ) сахарозу - 20,00, желатин 7 UA 98914 C2 2,50, лимоннокислий натрій - 1,00, калій фосфорнокислий двозаміщений - 1,00, натрій фосфорнокислий тризаміщений - 1,05, кальцій хлористий - 1,00, магній сірчанокислий - 1,00. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 8