Спосіб та композиція для боротьби з бур’янами (варіанти)

Реферат: Винахід стосується способу контролю за ростом бур’янистої рослини, який включає місцеве застосування до поверхні бур’янистої рослини композиції, яка містить полінуклеотид, ідентичний або комплементарний до щонайменше 18 безперервних нуклеотидів послідовності UA 116088 C2 (12) UA 116088 C2 гена 4-гідрофенілпіруватдіоксигенази (HPPD) або РНК-транскрипту вказаної послідовності гена HPPD, де вказану послідовність гена HPPD вибирають із групи, яка складається з SEQ ID NOs: 10, 16-19, 21-29, 31 і 32, і агент перенесення, який готує вказану поверхню вказаної бур’янистої рослини для проникнення вказаного полінуклеотиду, внаслідок чого ріст, розвиток або репродуктивна здатність вказаної бур’янистої рослини знижується, або вказана бур’яниста рослина стає сприйнятливішою до гербіциду, який є інгібітором HPPD, порівняно з необробленою бур’янистою рослиною; та композиції, яка містить вказаний полінуклеотид та вказаний агент перенесення. UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відповідно до § 119 (e) розділу 35 Кодексу США (35 U.S.C.) у цій заявці заявляється пріоритет за попередньою заявкою на видачу патенту США із серійним номером 61/534,066, поданої 13 вересня 2011 року, розкриття якої включене в цей документ у вигляді посилання в повному обсязі. Перелік послідовностей, що міститься у файлі з ім'ям "40_21(58636)B seq listing.txt", розмір якого складає 400,732 байт (виміряний в операційній системі MS-Windows) і який був створений 7 вересня 2012 року, наведений та включений в цей документ у вигляді посилання. ГАЛУЗЬ ВИНАХОДУ Винахід в цілому належить до галузі боротьби з бур'янами. Зокрема, винахід належить до генів 4-гідроксифеніл-піруват диоксигенази у смітних рослин і композицій, що містять полінуклеотидні молекули для модуляції їх експресії. Винахід додатково забезпечує способи та композиції, що використовуються для боротьби з бур'янами. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Бур'яни являють собою рослини, що конкурують з культурними рослинами в агрономічних умовах і коштують фермерам мільярди доларів щорічно у зв'язку з втратами урожаю і витратами на спроби утримати бур'яни під контролем. Бур'яни також є хазяїнами носіями хвороб сільськогосподарських культур та комах-шкідників. Збитки, заподіяні бур'янами в умовах сільськогосподарського виробництва, включають зниження врожайності, погіршення якості урожаю, підвищення витрат на зрошування, збільшення витрат на збір урожаю, зниження вартості землі, спричинення шкоди для худоби та пошкодження урожаю шкідниками і хворобами, які несуть бур'яни. Основними засобами, за допомогою яких бур'яни викликають ці наслідки, є: 1) конкуренція із культурними рослинами за воду, поживні речовини, сонячне світло та інші невід'ємні умови для росту та розвитку, 2) виділення токсичних або дратівливих хімічних речовин, які викликають проблеми зі здоров'ям у людей або тварини, 3) утворення величезної кількості насіння або вегетативних репродуктивних органів або і тих, і інших, які засмічують сільськогосподарську продукцію і назавжди зберігаються в сільськогосподарських землях, та 4) утворення на сільськогосподарських і несільськогосподарських землях величезної кількості рослинності, що підлягає знищенню. Гербіцидостійкі бур'яни є проблемою при використанні майже усіх гербіцидів; існує необхідність ефективної боротьби з цими бур'янами. Нині більше ніж 365 біотипів бур'янів визначаються як стійкі до одного або декількох гербіцидів згідно з Комітетом з попередження виникнення стійкості до дії гербіцидів (HRAC), Північноамериканським комітетом з попередження виникнення стійкості до дії гербіцидів (NAHRAC) і Американським науковим суспільством з дослідження бур'янів (WSSA). 4-гідроксифеніл-піруват диоксигенази (HPPD) являє собою фермент, що містить залізо, який каталізує другу реакцію катаболізму тирозину, перетворення 4-гідроксифеніл-пірувату в гомогентизат. Цей фермент є мішенню багатьох гербіцидів, які включають представників таких хімічних сімейств як трикетони, ізоксазоли та піразоли. СУТЬ ВИНАХОДУ У одному аспекті цей винахід належить до способу контролю за ростом смітних рослин, що включає зовнішню обробку смітної рослини композицією, яка містить полінуклеотид та агент перенесення, в якій полінуклеотид практично ідентичний або практично комплементарний послідовності гену HPPD або її фрагменту, або РНК-транскрипту вказаної послідовності гену HPPD або її фрагменту, в якій вказану послідовність гену HPPD обирають із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-32 або фрагмента полінуклеотиду, внаслідок чого ріст або розвиток, або репродуктивна здатність смітної рослини знижується або смітна рослина стає сприйнятливішою до гербіциду, що є інгібітором HPPD, у порівнянні зі смітною рослиною, яка не оброблена вказаною композицією. Таким чином, рослини, які стали стійкими до застосування гербіцидів, що містять гліфосат, можна зробити сприйнятливішими до гербіцидних дій гербіциду, що містить гліфосат, тим самим посилюючи дію гербіциду. Фрагмент полінуклеотиду, який складається із щонайменше 18 безперервних нуклеотидів, щонайменше 19 безперервних нуклеотидів, щонайменше 20 безперервних нуклеотидів або щонайменше 21 безперервних нуклеотидів у довжину і щонайменше на 85 відсотків ідентичний послідовності гену HPPD, обраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-32 та агента перенесення, являє собою кремнійорганічну композицію або сполуку. Фрагмент полінуклеотиду може бути смисловою або антисмисловою молекулою олДНК або олРНК, длРНК або длДНК, або гібридами длДНК/РНК. Композиція може містити більше ніж один фрагмент полінуклеотиду та композиція може містити гербіцид, що є інгібітором HPPD, і/або інші гербіциди, які підвищують дію композиції для боротьби з бур'янами. В іншому аспекті цього винаходу розкриваються полінуклеотидні молекули та способи модуляції експресії гену HPPD у смітних видів рослин. Спосіб знижує, пригнічує або іншим 1 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 чином уповільнює експресію гену HPPD у рослини, що включає зовнішню обробку смітної рослини композицією, яка містить полінуклеотид та агент перенесення, в якій полінуклеотид практично ідентичний або практично комплементарний послідовності гену HPPD або її фрагменту, або РНК-транскрипту послідовності гену HPPD або її фрагменту, в якій послідовність гену HPPD обирають із групи, що складається з SEQ ID NO: 1-32 або фрагменту полінуклеотиду. Фрагмент полінуклеотиду, який складається із щонайменше 18 безперервних нуклеотидів, щонайменше 19 безперервних нуклеотидів, щонайменше 20 безперервних нуклеотидів або щонайменше 21 безперервних нуклеотидів у довжину і щонайменше на 85 відсотків ідентичний послідовності гену HPPD, обраній із групи, що складається з SEQ ID NO: 132 та агента перенесення, являє собою кремнійорганічну композицію. Фрагмент полінуклеотиду може також бути смисловою або антисмисловою молекулою олДНК або олРНК, длРНК або длДНК, або гібридами длДНК/РНК. У додатковому аспекті винаходу композицію, що містить полінуклетидну молекулу, можна змішати з іншими гербіцидними (сумісними гербіцидами) сполуками, щоб забезпечити додатковий контроль за небажаними рослинами на полі із культурними рослинами. У додатковому аспекті композицію полінуклеотидної молекули можна змішати з будь-яким одним або декількома додатковими агрохімікатами, такими як, інсектициди, фунгіциди, нематоциди, бактерициди, акарициди, регулятори росту, хемостерилізатори, хімічні сигнальні речовини, репеленти, атрактанти, феромони, стимулятори поїдання, біопестициди, мікробні пестициди або інші біологічно активні сполуки для отримання багатокомпонентного пестициду, що надає ще ширший спектр захисту сільськогосподарської продукції. ПЕРЕЛІК ФІГУР КРЕСЛЕННЯ Наступні креслення утворюють частину цього опису і включені для додаткової демонстрації деяких аспектів цього винаходу. Цей винахід може бути краще зрозумілим із посиланням на один або декілька із цих креслень у поєднанні з детальним описом конкретних варіантів реалізації винаходу, приведених в цьому документі. Цей винахід може бути краще зрозумілий завдяки наступному опису фігур: Фігура 1. ілюструє обробку щириці Палмера (Amaranthus palmeri) тригерними полінкулеотидами олДНК і гербіцидом, що є інгібітором HPPD, мезотріоном. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ Пропонуються способи та композиції, що містять полінуклеотид, який забезпечує регуляцію, репресію або уповільнення експресії гену HPPD (4-гідроксифеніл-піруват диоксигенази), а також поліпшений контроль за видами смітних рослин і особливо за біотипами бур'янів, стійкими до гербіциду, що є інгібітором HPPD. Аспекти способу можуть застосовуватися для контролю за ростом різних смітних рослин в агрономічних та інших культурних середовищах. Наступні визначення та способи пропонуються для того, щоб краще визначити цей винахід і спрямувати фахівців цієї галузі техніки на практику цього винаходу. Якщо не вказане інше, терміни, використані в цьому винаході, мають ті ж значення, які зазвичай відомі фахівцеві із загальною підготовкою в галузі техніки, до якої належить цей винахід. Якщо термін приведений в однині, автори цього винаходу також мають на увазі множину цього терміну. Під полінуклеотидами, що "не транскрибуються", мають на увазі, що полінуклеотиди не містять повної одиниці транскрипції полімерази II. Використовуваний тут термін "розчин" належить до однорідних сумішей і до неоднорідних сумішей, таких як суспензії, колоїди, міцели та емульсії. Смітними рослинами є рослини, які конкурують із культурними рослинами, найбільш важливі з яких включають, без обмеження ними, такі важливі інвазивні та шкідливі бур'яни, а також стійкі до дії гербіциду біотипи в рослинництві, як Amaranthus вид -A. albus, A. blitoides, A. hybridus, A. palmeri, A. powellii, A. retroflexus, A. spinosus, A. tuberculatus та A. viridis; Ambrosia вид -A. trifida, A. artemisifolia; Lolium вид -L. multiflorum, L. rigidium, L perenne; Digitaria вид -D. insularis; Euphorbia вид -E. heterophylla; Kochia вид -K. scoparia; Sorghum вид -S. halepense; Conyza вид C. bonariensis, C. canadensis, C. sumatrensis; Chloris вид -C. truncate; Echinochola вид -E. colona, E. crus-galli; Eleusine вид -E. indica; Poa вид -P. annua; Plantago вид -P. lanceolata; Avena вид -A. fatua; Chenopodium вид -C. album; Setaria вид –S. viridis, Abutilon theophrasti, Ipomoea вид, Sesbania вид, Cassia вид, Sida вид, Brachiaria вид та Solanum вид. Додаткові види смітних рослин, знайдені на посівних площах включають Alopecurus myosuroides, Avena sterilis, Avena sterilis ludoviciana, Brachiaria plantaginea, Bromus diandrus, Bromus rigidus, Cynosurus echinatus, Digitaria ciliaris, Digitaria ischaemum, Digitaria sanguinalis, Echinochloa oryzicola, Echinochloa phyllopogon, Eriochloa punctata, Hordeum glaucum, Hordeum leporinum, Ischaemum rugosum, Leptochloa chinensis, Lolium persicum, Phalaris minor, Phalaris paradoxa, Rottboellia exalta, Setaria faberi, Setaria viridis var, robusta-alba schreiber, Setaria viridis 2 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 var, robusta-purpurea, Snowdenia polystachea, Sorghum sudanese, Alisma plantago-aquatica, Amaranthus lividus, Amaranthus quitensis, Ammania auriculata, Ammania coccinea, Anthemis cotula, Apera spica-venti, Bacopa rotundifolia, Bidens pilosa, Bidens subalternans, Brassica tournefortii, Bromus tectorum, Camelina microcarpa, Chrysanthemum coronarium, Cuscuta campestris, Cyperus difformis, Damasonium minus, Descurainia sophia, Diplotaxis tenuifolia, Echium plantagineum, Elatine triandra var, pedicellata, Euphorbia heterophylla, Fallopia convolvulus, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Helianthus annuus, Iva xanthifolia, Ixophorus unisetus, Ipomoea indica, Ipomoea purpurea, Ipomoea sepiaria, Ipomoea aquatic, Ipomoea triloba, Lactuca serriola, Limnocharis flava, Limnophila erecta, Limnophila sessiliflora, Lindernia dubia, Lindernia dubia var, major, Lindernia micrantha, Lindernia procumbens, Mesembryanthemum crystallinum, Monochoria korsakowii, Monochoria vaginalis, Neslia paniculata, Papaver rhoeas, Parthenium hysterophorus, Pentzia suffruticosa, Phalaris minor, Raphanus raphanistrum, Raphanus sativus, Rapistrum rugosum, Rotala indica var, uliginosa, Sagittaria guyanensis, Sagittaria montevidensis, Sagittaria pygmaea, Salsola iberica, Scirpus juncoides var, ohwianus, Scirpus mucronatus, Setaria lutescens, Sida spinosa, Sinapis arvensis, Sisymbrium orientale, Sisymbrium thellungii, Solanum ptycanthum, Sonchus asper, Sonchus oleraceus, Sorghum bicolor, Stellaria media, Thlaspi arvense, Xanthium strumarium, Arctotheca calendula, Conyza sumatrensis, Crassocephalum crepidiodes, Cuphea carthagenenis, Epilobium adenocaulon, Erigeron philadelphicus, Landoltia punctata, Lepidium virginicum, Monochoria korsakowii, Solanum americanum, Solanum nigrum, Vulpia bromoides, Youngia japonica, Hydrilla verticillata, Carduus nutans, Carduus pycnocephalus, Centaurea solstitialis, Cirsium arvense, Commelina diffusa, Convolvulus arvensis, Daucus carota, Digitaria ischaemum, Echinochloa crus-pavonis, Fimbristylis miliacea, Galeopsis tetrahit, Galium spurium, Limnophila erecta, Matricaria perforate, Papaver rhoeas, Ranunculus acris, Soliva sessilis, Sphenoclea zeylanica, Stellaria media, Nassella trichotoma, Stipa neesiana, Agrostis stolonifera, Polygonum aviculare, Alopecurus japonicus, Beckmannia syzigachne, Bromus tectorum, Chloris inflate, Echinochloa erecta, Portulaca oleracea та Senecio vulgaris. Вважається, що усі рослини містять у своєму геномі ген фітоендесатурази, послідовність якого можна виділити та отримати полінуклеотиди відповідно до способів цього винаходу, які застосовуються для регуляції, пригнічення або уповільнення експресії гену-мішені HPPD в рослинах і росту або розвитку оброблених рослин. Культурна рослина також може бути смітною рослиною, якщо вона зустрічається в небажаному середовищі. Наприклад, кукурудза, яка росте на полі сої. Трансгенні культури, стійкі до одного або декількох гербіцидів потребують спеціалізованих способів управління для боротьби з бур'янами та самопосівними сільськогосподарськими культурами. Цей винахід дозволяє виявляти трансгени стійкості до гербіцидів, щоб дозволити обробленим рослинам стати сприйнятливими до гербіциду. Наприклад, трансгенні послідовності ДНК HPPD у трансгенних об'єктах, які включають FG72. "Тригер" або "тригерний полінуклеотид" являє собою молекулу полінуклеотиду, яка гомологічна або комплементарна полінуклеотиду гену-мішені. Молекули тригерного полінуклеотиду модулюють експресію гену-мішені при місцевому нанесенні на поверхню рослин за допомогою агента перенесення, завдяки якому ріст або розвиток, або репродуктивна здатність рослини, обробленої вказаною композицією, регулюється, пригнічується або сповільнюється, або вказана рослина стає сприйнятливішою до гербіциду, що є інгібітором EPSPS, в результаті використання вказаної композиції, яка містить полінуклеотид, у порівнянні з рослиною, яка не оброблена композицією, що містить тригерну молекулу. Тригерні полінуклеотиди, розкриті в цьому винаході, в цілому описані відносно послідовності гену-мішені і можуть використовуватися в смисловій (гомологічній) або антисмисловій (комплементарній) орієнтації як одноланцюгові молекули або містити обидва ланцюги, як дволанцюгові молекули, або варіанти нуклеотидів і їх модифіковані нуклеотиди залежно від різних областей, в яких виявлятиметься ген. Передбачається, що композиція згідно цього винаходу міститиме декілька полінуклеотидів та гербіцидів, які включають, без обмеження ними, тригерні полінуклеотиди гену HPPD і гербіцид, що є інгібітором HPPD, і будь-який один або декілька додаткових тригерних полінуклеотидів гену-мішені гербіциду і відповідних гербіцидів, і будь-який один або декілька додаткових тригерних полінуклеотидів основного гену. Основні гени являють собою гени в рослині, які забезпечують ключові ферменти або інші білки, наприклад, фермент біосинтезу, метаболізуючий фермент, рецептор, білок-переносник сигналу, структурний продукт гену, фактор транскрипції або транспортний білок; або регулюючі РНК, такі як, мікроРНК, які важливі для росту або виживання організму або клітини, або беруть участь у нормальному рості і розвитку рослин (Meinke зі співавторами, Trends Plant Sci. 2008 Sep;13(9):483-91). Пригнічення 3 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 основного гену посилює дію гербіциду, що впливає на функцію продукту гена, відмінну від пригніченого основного гену. Композиції згідно цього винаходу можуть містити різні тригерні полінуклеотиди, які модулюють експресію основного гену, відмінного від HPPD. Гербіциди, до яких трансгени рослин проявили стійкість і можна застосувати цей спосіб, включають, без обмеження ними: ауксиноподібні гербіциди, гліфосат, глюфосинат, сульфонілсечовини, імідазолінони, бромоксиніл, делапон, дикамбу, циклогександіон, інгібітори протопорфириноген оксидази, гербіциди, що є інгібіторами 4-гідроксифеніл-піруват диоксигенази. Наприклад, трансгени та їх полінуклеотидні молекули, які кодують білки, які відповідають за стійкість до гербіцидів, відомі в цій галузі техніки, і включають, без обмеження нею, 5-енолпірувіл-шикімат-3-фосфат-синтазу (EPSPS), наприклад, що детальніше описано в патентах США за номерами 7,807,791 (SEQ ID NO: 5); 6,248,876 B1; 5,627,061; 5,804,425; 5,633,435; 5,145,783; 4,971,908; 5,312,910; 5,188,642; 4,940,835; 5,866,775; 6,225,114 B1; 6,130,366; 5,310,667; 4,535,060; 4,769,061; 5,633,448; 5,510,471; патенті США за номером Re 36,449; патентах США за номерами RE 37,287 E; і 5,491,288; стійкість до сульфонілсечовини і/або імідазолінону, наприклад, що детальніше описана в патентах США за номерами 5,605,011; 5,013,659; 5,141,870; 5,767,361; 5,731,180; 5,304,732; 4,761,373; 5,331,107; 5,928,937; і 5,378,824; і міжнародній заявці WO 96/33270; стійкість до гербіцидів, що є інгібіторами гідроксифенілпіруватдиоксигенази в рослинах, описана в патентах США за номерами 6,245,968 B1; 6,268,549; і 6,069,115; публікації патенту США 20110191897 та US7,312,379 SEQ ID NO: 3; US7,935,869; US7,304,209, SEQ ID NO: 1, 3, 5 і 15; полінуклеотиди арілоксиалканоат диоксигенази, які надають стійкість до 2,4-D та інших гербіцидів на основі феноксиауксину, а також до гербіцидів на основі арілоксифеноксипропіонату, що описано, наприклад, в WO2005/107437; US7,838,733 SEQ ID NO: 5; і полінуклеотиди, стійкі до дикамби, що описано, наприклад, в Herman зі співавторами (2005) J. Biol. Chem. 280: 24759-24767. Інші приклади ознак стійкості до гербіциду включають ті, які обумовлені полінуклеотидами, які кодують екзогенну фосфінотріцин ацетилтрансферазу, що описано в патентах США за номерами 5,969,213; 5,489,520; 5,550,318; 5,874,265; 5,919,675; 5,561,236; 5,648,477; 5,646,024; 6,177,616; та 5,879,903. Рослини, що містять екзогенну фосфінотріцин ацетилтрансферазу можуть проявляти підвищену стійкість до гербіцидів на основі глюфосинату, які інгібують фермент глутамінсинтетазу. Крім того, стійкі до гербіцидів полінуклеотиди включають ті, які обумовлені полінуклеотидами, що обумовлюють змінену дію протопорфириноген оксидази (протокс), як описано в патентах США за номерами 6,288,306 B1; 6,282,837 B1; та 5,767,373; та WO 01/12825. Рослини, які містять такі полінуклеотиди, можуть проявляти покращену стійкість до будь-якого з безлічі гербіцидів, що націлені на фермент протокс (також позначені як протокс інгібітори). Полінуклеотиди, які кодують гліфосат оксидоредуктазу та гліфосат-N-ацетил трансферазу (GOX описаний в патенті США 5,463,175 та GAT описаний в публікації патенту США 20030083480, дикамба монооксигенази в публікації патенту США 20030135879, усі з яких включені в цей документ у вигляді посилання); молекула полінуклеотиду, яка кодує бромоксиніл нітрилазу (Bxn описана в патенті США за номером 4,810,648 щодо стійкості до бромоксинілу, який включений в цей документ у вигляді посилання); молекула полінуклеотиду, яка кодує фітоендесатуразу (crtI), описана у Misawa зі співавторами, (1993) Plant J. 4:833-840 та у Misawa зі співавторами, (1994) Plant J. 6:481-489 щодо стійкості до норфлуразону; молекула полінуклеотиду, яка кодує синтазу ацетогідроксикислот (AHAS, aka ALS), описана у Sathasiivan зі співавторами (1990) Nucl. Acids Res. 18:318-2193 щодо стійкості до гербіцидів групи сульфонілсечовини; та ген bar, описаний у DeBlock зі співавторами (1987) EMBO J. 6:2513-2519 щодо стійкості до глюфосинату та біалафосу. Трансгенні кодуючі області і регуляторні елементи генів стійкості до гербіцидів являють собою мішені, в яких тригерні полінуклеотиди і гербіциди можуть бути включені в композиції згідно цього винаходу. Композиція згідно цього винаходу містить компонент, який являє собою гербіцид, що є інгібітором HPPD, який включає, без обмеження ними, трикетони, такі як мезотріон, тефурілтріон, темботріон та сулкотріон; ізоксазоли, такі як, ізоксахлортол, пірасульфотол та ізоксафлутол; піразоли, такі як, бензофенап, піразолінат, топрамезон та піразоксифен. Додаткові інгібітори HPPD включають бензобіциклон і біциклопірон. Доступні численні гербіциди з аналогічними або різними механізмами дії (надалі позначені як сумісні гербіциди), які можна додати до композиції, наприклад, представники сімейства гербіцидів, що включають, без обмеження ними, амідні гербіциди, гербіциди на основі ароматичних кислот, миш'якові гербіциди, гербіциди на основі бензотіазолу, гербіциди на основі бензоїлциклогександіону, гербіциди на основі бензофураніл алкілсульфонату, гербіциди на основі карбамату, гербіциди на основі циклогексеноксиму, гербіциди на основі циклопропілізоксазолу, гербіциди на основі дикарбоксиміду, гербіциди на основі динітроаніліну, 4 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гербіциди на основі динітрофенолу, гербіциди на основі дифенілового ефіру, гербіциди на основі дитіокарбамату, галогеновані аліфатичні гербіциди, гербіциди на основі імідазолінону, неорганічні гербіциди, нітрильні гербіциди, фосфорорганічні гербіциди, гербіциди на основі оксадиазолону, гербіциди на основі оксазолу, феноксигербіциди, гербіциди на основі фенілендиаміну, піразольні гербіциди, гербіциди на основі піридазину, гербіциди на основі піридазинону, піридинові гербіциди, гербіциди на основі піримідиндиаміну, гербіциди на основі піримідинілоксибензиламіну, четвертинні амонієві гербіциди, гербіциди на основі тіокарбамату, гербіциди на основі тіокарбонату, гербіциди на основі тіосечовини, триазинові гербіциди, гербіциди на основі триазинону, гербіциди на основі триазолу, гербіциди на основі триазолону, гербіциди на основі триазолопіримідину, гербіциди на основі урацилу і гербіциди на основі сечовини. Зокрема, норми витрати доданих гербіцидів в композиціях, що містять полінуклеотиди, можна зменшити. Скорочення норм витрат додатково доданих гербіцидів може складати 10-25 відсотків, 26-50 відсотків, 51-75 відсотків або може бути більшим, та очікується підвищення активності полінуклеотидів і композиції гербіциду. Типові гербіциди сімейств включають, без обмеження ними, ацетохлор, ацифлуорфен, ацифлуорфен натрію, аклоніфен, акролеїн, алахлор, алоксидим, аліловий спирт, аметрин, амікарбазон, амідосульфурон, амінопіралід, амітрол, сульфамат амонію, анілофос, асулам, атратон, атразін, азимсульфурон, BCPC, бефлубутамід, беназолін, бенфлуралін, бенфуресат, бенсульфурон, бенсульфуронметил, бенсулід, бентазон, бензфендізон, бензобіциклон, бензофенап, біфенокс, біланафос, біспірібак, біспірібак натрію, буру, бромацил, бромобутид, бромоксиніл, бутахлор, бутафенацил, бутаміфос, бутралін, бутроксидим, бутилат, какодилову кислоту, хлорат кальцію, кафенстрол, карбетамід, карфентразон, карфентразон-етил, CDEA, CEPC, хлорфлуренол, хлорфлуренолметил, хлоридазон, хлорімурон, хлорімурон-етил, хлороцетову кислоту, хлоротолурон, хлорпрофам, хлорсульфурон, хлортал, хлортал-диметил, цинідон-етил, цинметилін, циносульфурон, цисанілід, клетодим, клодинафоп, клодинафоп-пропаргіл, кломазон, кломепроп, клопіралід, клорансулам, клорансулам-метил, CMA, 4-CPB, CPMF, 4CPP, CPPC, крезол, кумілурон, цианамід, цианазін, циклоат, циклосульфамурон, циклоксидим, цигалофоп, цигалофоп-бутил, 2,4-D, 3,4-DA, даімурон, далапон, дазомет, 2,4-DB, 3,4-DB, 2,4DEB, десмедіфам, дикамбу, дихлобеніл, орто-дихлорбензол, пара-дихлорбензол, дихлорпроп, дихлорпроп-П, диклофоп, диклофоп-метил, диклосулам, дифензокват, дифензоквату метилсульфат, дифлуфенікан, дифлуфензопір, димефурон, димепіперат, диметахлор, диметаметрин, диметенамід, диметенамід-П, диметипін, диметиларсинову кислоту, динітрамін, динотерб, дифенамід, дикват, диквату дибромід, дитіопір, діурон, DNOC, 3,4-DP, DSMA, EBEP, ендотал, ЕРТС, еспрокарб, еталфлуралін, етаметсульфурон, етаметсульфурон-метил, етофумезат, етоксифен, етоксисульфурон, етобензанід, феноксапроп-П, феноксапроп-П-етил, фентразамід, сульфат заліза, флампроп-M, флазасульфурон, флорасулам, флуазіфоп, флуазіфоп-бутил, флуазіфоп-П, флуазіфоп-П-бутил, флукарбазон, флукарбазон натрію, флуцетосульфурон, флухлоралін, флуфенацет, флуфенпір, флуфенпір-етил, флуметсулам, флуміклорак, флуміклорак-пентил, флуміоксазин, флуометурон, флуороглікофен, флуороглікофен-етил, флупропанат, флупірсульфурон, флупірсульфурон-метил натрію, флуренол, флурідон, флуорохлоридон, флуороксипір, флуртамон, флутіацет, флутіацет-метил, фомесафен, форамсульфурон, фосамін, глуфозинат, глуфозинат амонію, гліфосат, галосульфурон, галосульфурон-метил, галоксифоп, галоксифоп-П, HC-252, гексазінон, імазаметабенз, імазаметабенз-метил, імазамокс, імазапік, імазапір, імазаквін, імазетапір, імазосульфурон, інданофан, йодометан, йодосульфурон, йодосульфурон-метил натрію, іоксиніл, ізопротурон, ізоурон, ізоксабен, ізоксахлортол, ізоксафлутол, карбутилат, лактофен, ленацил, лінурон, MAA, МАМА, МСРА, МСРА-тіоетил, МСРВ, мекопроп, мекопроп-П, мефенацет, мефлуїдид, мезосульфурон, мезосульфурон-метил, мезотріон, метам, метаміфоп, метамітрон, метазахлор, метабензтіазурон, метиларсонову кислоту, метилдімрон, метилізотіоцианат, метобензурон, метолахлор, С-метолахлор, метосулам, метоксурон, метрибузін, метсульфурон, метсульфурон-метил, МK-66, молінат, монолінурон, MSMA, напроанілід, напропамід, напталам, небурон, нікосульфурон, нонанову кислоту, норфлуразон, олеїнову кислоту (жирні кислоти), орбенкарб, ортосульфамурон, оризалін, оксадиаргіл, оксадиазон, оксасульфурон, оксацикломефон, оксифлуорфен, паракват, дихлоріду паракват, пебулат, пендиметалін, пеноксулам, пентахлорфенол, пентанохлор, пентоксазон, петоксамід, нафтові олії, фенмедифам, фенмедифам-етил, піклорам, піколінафен, піноксаден, піперофос, арсеніт калію, азид калію, претілахлор, примісульфурон, примісульфурон-метил, продиамін, профлуазол, профоксидим, прометон, прометрин, пропахлор, пропаніл, пропаквізафоп, пропазін, профам, пропізохлор, пропоксикарбазон, пропоксикарбазон натрію, пропизамід, просульфокарб, просульфурон, піраклоніл, пірафлуфен, пірафлуфен-етил, піразолінат, 5 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 піразосульфурон, піразосульфурон-етил, піразоксифен, пірибензоксим, пірибутикарб, піридафол, піридат, пірифталід, піримінобак, піримінобак-метил, піримісульфан, піритіобак, піритіобак натрію, квінклорак, квінмерак, квінокламін, хізалофоп, хізалофоп-П, римсульфурон, сетоксидим, сидурон, симазин, симетрин, SMA, арсеніт натрію, азид натрію, хлорат натрію, сулкотрион, сульфентразон, сульфометурон, сульфометурон-метил, сульфосат, сульфосульфурон, сірчану кислоту, дігтярну олію, 2,3,6-TBA, TCA, TCA-натрію, тебутіурон, тепралоксидим, тербацил, тербуметон, тербутилазін, тербутрин, тенілхлор, тіазопір, тіфенсульфурон, тіфенсульфурон-метил, тіобенкарб, тіокарбазил, топрамезон, тралкоксидим, триалат, триасульфурон, триазифлам, трибенурон, трибенурон-метил, трикамбу, триклопір, триетазин, трифлоксисульфурон, трифлоксисульфурон натрію, трифлуралін, трифлусульфурон, трифлусульфурон-метил, тригідрокситриазин, тритосульфурон, [3-[2-хлор-4флуоро-5-(-метил-6-трифлуорометил-2,4-диоксо-,2,3,4-тетрагідропіримідин-3-іл)фенокси]-2піриділокси] етиловий ефір оцтової кислоти (CAS RN 353292-3-6), 4-[(4,5-дигідро-3-метокси-4метил-5-оксо)-H-,2,4-триазол-ілкарбоніл-сульфамоїл]-5-метилтіофен-3 карбонової кислоти (BAY636), BAY747 (CAS RN 33504-84-2), топрамезон (CAS RN 2063-68-8), 4-гідрокси-3-[[2-[(2метоксиетокси)метил]-6-(трифлуоро-метил)-3-піридиніл]карбоніл]-біцикло[3.2.]окт-3-ен-2-ону (CAS RN 35200-68-5), і 4-гідрокси-3-[[2-(3-метоксипропіл)-6-(дифлуорометил)-3піридиніл]карбон-іл]-біцикло[3.2.]окт-3-ен-2-ону. Крім того, включення гербіцидних сполук із невказаними механізмами дії описано в CN101279950A, CN101279951A, DE10000600A1, DE10116399A1, DE102004054666A1, DE102005014638A1, DE102005014906A1, DE102007012168A1, DE102010042866A1, DE10204951A1, DE10234875A1, DE10234876A1, DE10256353A1, DE10256354A1, DE10256367A1, EP1157991A2, EP1238586A1, EP2147919A1, EP2160098A2, JP03968012B2, JP2001253874A, JP2002080454A, JP2002138075A, JP2002145707A, JP2002220389A, JP2003064059A, JP2003096059A, JP2004051628A, JP2004107228A, JP2005008583A, JP2005239675A, JP2005314407A, JP2006232824A, JP2006282552A, JP2007153847A, JP2007161701A, JP2007182404A, JP2008074840A, JP2008074841A, JP2008133207A, JP2008133218A, JP2008169121A, JP2009067739A, JP2009114128A, JP2009126792A, JP2009137851A, US20060111241A1, US20090036311A1, US20090054240A1, US20090215628A1, US20100099561A1, US20100152443A1, US20110105329A1, US20110201501A1, WO2001055066A2, WO2001056975A1, WO2001056979A1, WO2001090071A2, WO2001090080A1, WO2002002540A1, WO2002028182A1, WO2002040473A1, WO2002044173A2, WO2003000679A2, WO2003006422A1, WO2003013247A1, WO2003016308A1, WO2003020704A1, WO2003022051A1, WO2003022831A1, WO2003022843A1, WO2003029243A2, WO2003037085A1, WO2003037878A1, WO2003045878A2, WO2003050087A2, WO2003051823A1, WO2003051824A1, WO2003051846A2, WO2003076409A1, WO2003087067A1, WO2003090539A1, WO2003091217A1, WO2003093269A2, WO2003104206A2, WO2004002947A1, WO2004002981A2, WO2004011429A1, WO2004029060A1, WO2004035545A2, WO2004035563A1, WO2004035564A1, WO2004037787A1, WO2004067518A1, WO2004067527A1, WO2004077950A1, WO2005000824A1, WO2005007627A1, WO2005040152A1, WO2005047233A1, WO2005047281A1, WO2005061443A2, WO2005061464A1, WO2005068434A1, WO2005070889A1, WO2005089551A1, WO2005095335A1, WO2006006569A1, WO2006024820A1, WO2006029828A1, WO2006029829A1, WO2006037945A1, WO2006050803A1, WO2006090792A1, WO2006123088A2, WO2006125687A1, WO2006125688A1, WO2007003294A1, WO2007026834A1, WO2007071900A1, WO2007077201A1, WO2007077247A1, WO2007096576A1, WO2007119434A1, WO2007134984A1, WO2008009908A1, WO2008029084A1, WO2008059948A1, WO2008071918A1, WO2008074991A1, WO2008084073A1, WO2008100426A2, WO2008102908A1, WO2008152072A2, WO2008152073A2, WO2009000757A1, WO2009005297A2, WO2009035150A2, WO2009063180A1, WO2009068170A2, WO2009068171A2, WO2009086041A1, WO2009090401A2, WO2009090402A2, WO2009115788A1, WO2009116558A1, WO2009152995A1, WO2009158258A1, WO2010012649A1, WO2010012649A1, WO2010026989A1, WO2010034153A1, WO2010049270A1, WO2010049369A1, WO2010049405A1, WO2010049414A1, WO2010063422A1, WO2010069802A1, WO2010078906A2, WO2010078912A1, WO2010104217A1, WO2010108611A1, WO2010112826A3, WO2010116122A3, WO2010119906A1, WO2010130970A1, WO2011003776A2, WO2011035874A1, WO2011065451A1, усі з яких включені в цей документ у вигляді посилання. Композиції тригерних молекул полінуклеотиду і олігонуклеотиду використовуються в композиціях, наприклад, у рідинах, які містять молекули полінуклеотиду при низьких концентраціях, окремо або в комбінації з іншими компонентами, наприклад, однією або декількома молекулами гербіциду або в тій же рідині, або в окремо взятих рідинах, які також забезпечують агент перенесення. Хоча не існує ніякої верхньої межі концентрацій і дозувань молекул полінуклеотиду, які можуть використовуватися в цих способах, для ефективності 6 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зазвичай треба буде знайти нижню межу ефективних концентрацій і дозувань. Концентрації можна скорегувати з урахуванням об'єму спрею або обробки, яка застосовується до листя рослини або інших частин поверхні рослини, таких як квіткові пелюстки, стебла, бульби, фрукти, пильовики, пилок або насіння. В одному варіанті реалізації необхідна обробка трав'янистих рослин із використанням 25-мерної олігонуклеотидної молекули вимагає близько 1 наномоль (нмоль) молекул олігонуклеотидів на рослину, наприклад, від близько 0,05 до 1 нмоль на рослину. Інші варіанти реалізації для трав'янистих рослин включають необхідні діапазони концентрації від близько 0,05 до близько 100 нмоль або від близько 0,1 до близько 20 нмоль, або від близько 1 нмоль до близько 10 нмоль полінуклеотидів на рослину. Дуже великі рослини, дерева або лози можуть потребувати відповідно більшої кількості полінуклеотидів. При використанні довгих молекул длРНК, які можна перетворити в декілька олігонуклеотидів, можна використати нижчі концентрації. Щоб продемонструвати варіанти реалізації, відносно олігонуклеотидних молекул для зазначення обробки 0,8 нмоль молекули полінуклеотиду на рослину умовно використовують фактор 1Х; 10Х для 8 нмоль молекули полінуклеотиду на рослину; і 100Х для 80 нмоль молекули полінуклеотиду на рослину. Полінуклеотидні композиції використовуються в композиціях, наприклад, в рідинах, які містять молекули полінуклеотиду, окремо або в комбінації з іншими компонентами, або в тій же рідині, або в окремо взятих рідинах, які також забезпечують агент перенесення. Як використовується в цьому документі, агент перенесення являє собою агент, який у поєднанні з полінуклеотидом в композиції, яка місцево застосовується до поверхні рослини-мішені, дозволяє полінуклеотиду потрапити в клітину рослини. У деяких варіантах реалізації агент перенесення являє собою агент, який кондиціонує поверхню тканини рослини, наприклад, листя, стебла, корені, квіти або фрукти для потрапляння за допомогою молекул полінуклеотиду в клітини рослини. Перенесення полінуклеотидів в клітини рослини може бути полегшене за допомогою попереднього або одночасного застосування агенту перенесення полінуклеотиду до тканини рослини. У деяких варіантах реалізації агент перенесення застосовують після нанесення полінуклеотидної композиції. Агент перенесення полінуклеотиду забезпечує полінуклеотидам шлях через воскові бар'єри серозної оболонки, пори і/або стінки клітини або мембранні бар'єри в клітини рослини. Відповідні агенти перенесення для полегшення перенесення полінуклеотиду в клітину рослини включають агенти, які покращують проникність зовнішньої поверхні рослини або які покращують проникність олігонуклеотидів або полінуклеотидів в клітини рослини. Такі агенти для полегшення перенесення композиції в клітину рослини містять хімічну речовину або фізичну речовину, або їх комбінації. Хімічні речовини для кондиціонування або перенесення містять: (а) поверхнево-активні речовині, (б) органічний розчинник або водний розчин, або водні суміші органічних розчинників, (в) окисники, (г) кислоти, (д) луги, (е) олії, (є) ферменти або їх комбінації. Варіанти реалізації способу можуть необов'язково включати етап інкубації, етап нейтралізації (наприклад, щоб нейтралізувати кислоту, лугу або окисник або інактивувати фермент), етап обполіскування або їх комбінації. Варіанти реалізації агентів або обробки для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів включають емульсії, зворотні емульсії, ліпосоми та інші міцелоподібні композиції. Варіанти реалізації агентів або обробки для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів містять протиіони або інші молекули, які, як відомо, пов'язують з молекулами нуклеїнових кислот, наприклад, неорганічні іони амонію, іони алкіламонію, іони алкіллітію, поліаміни, такі як спермін, спермідин або путресцин та інші катіони. Органічні розчинники, які використовуються в кондиціонуванні рослини з метою проникнення полінуклеотидів, містять DMSO, DMF, піридин, N-піролідин, гексаметилфосфорамід, ацетонітрил, диоксан, поліпропіленгліколь, інші розчинники, здатні змішуватися з водою або які розчинятимуть фосфонуклеотиди в неводних системах (наприклад, які використовуються в реакціях синтезу). Можуть використовуватися природні або синтетичні олії з додаванням або без поверхнево-активних речовин або емульгаторів, наприклад, олії рослинного походження, th олії з насіння (наприклад, можна використати ті, які є в переліку 9 Compendium of Herbicide Adjuvants, у відкритому доступі всесвітньої мережі (Інтернет) на сайті herbicide.adjuvants.com, наприклад, парафінові олії, ефіри жирної кислоти і багатоатомного спирту або олії з молекулами з коротким ланцюгом, модифіковані амідами або поліамінами, такі як поліетиленімін або N-піролідин. Агенти перенесення містять, без обмеження ними, кремнійорганічні препарати. Агрономічні поля, які потребують контролю за ростом рослин, обробляють шляхом нанесенням композиції безпосередньо на поверхню зростаючих рослин, наприклад, за допомогою обприскування. Наприклад, спосіб застосовують для боротьби з бур'янами на полі культурних рослин шляхом розпилення композиції на полі. Композиція може бути надана у 7 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 вигляді бакової суміші, послідовної обробки компонентів (зазвичай композиціями, які містять полінуклеотид, а потім гербіцидом) або одночасної обробки, або змішування одного або більше компонентів композиції з окремих контейнерів. Обробка поля може проводитися в міру необхідності для забезпечення боротьби з бур'янами, а компоненти композиції можна скорегувати для боротьби з конкретними видами смітних рослин або сімействами бур'янів за допомогою використання конкретних полінуклеотидів або полінуклеотидних композицій, здатних вибірково охоплювати конкретні види або сімейства рослин, з якими належить боротися. Композицію можна використовувати з ефективною робочою концентрацією залежно від часу обробки поля, наприклад, передпосівне внесення, при посадці, після посадки, після збору урожаю. Гербіциди, що є інгібіторами HPPD, можна використовувати на полі, виходячи з норми від 1 до 2000 грамів аі/га (активного інгредієнту на гектар) або більше. Полінуклеотидні композиції можна використовувати, виходячи з норми від 1 до 30 грамів на акр, залежно від кількості тригерних молекул, необхідних для охоплення бур'янів на цьому полі. Культурні рослини, які потребують боротьби з бур'янами включають, без обмеження ними, такі рослини, як: i) кукурудза, соя, бавовна, рапс, цукровий буряк, люцерна, цукрова тростина, рис і пшениця; ii) овочеві рослини, включаючи, без обмеження ними, томат, солодкий перець, гострий перець, диня, кавун, огірок, баклажан, цвітна капуста, броколі, салат, шпинат, лук, горох, морква, солодка кукурудза, пекінська капуста, цибуля-порей, кріп, гарбуз, кабачок або пляшковий гарбуз, редька, брюссельська капуста, фізаліс овочевий, стручкова квасоля, зріла квасоля або бамія; iii) зелень, включаючи, без обмеження ними, базилік, петрушка, кава або чай; або iv) плодові рослини, включаючи, без обмеження ними, яблуко, груша, вишня, персик, слива, абрикос, банан, плантан, столовий виноград, винний виноград, цитрусові, авокадо, манго або ягоди; v) дерева, які вирощуються для декоративного або комерційного використання, включаючи, без обмеження ними, фруктові або горіхоплідні дерева; або vi) декоративні рослини (наприклад, квітучі декоративні рослини або чагарники, або рулонний газон). Способи та композиції, приведені в цьому документі, також можна застосовувати до рослин, отриманих за допомогою живцювання, клонування або прищепи (тобто до рослин, які виросли не з насіння), у тому числі до плодових дерев і рослин, які включають, без обмеження ними, цитрусові, яблука, авокадо, помідори, баклажани, огірки, дині, кавуни, виноград, а також різні декоративні рослини. Суміші пестицидів Полінуклеотидні композиції можуть також використовуватися у сумішах із різним агрохімікатами і/або інсектицидами, акарицидами і фунгіцидами, пестицидними і біопестицидними засобами. Приклади включають, без обмеження ними, азинфос-метил, ацефат, ізоксатіон, ізофенфос, етіон, етримфос, оксидеметон-метил, оксидепрофос, хіналфос, хлорпірифос, хлорпірифос-метил, хлорфенвінфос, цианофос, диоксабензофос, дихлофос, дисульфотон, диметилвінфос, диметоат, сульпрофос, диазинон, тіометон, тетрахлорвінфос, темефос, тебупіримфос, тербуфос, налед, вамідотіон, піраклофос, піридафентіон, піриміфосметил, фенитротіон, фентіон, фентоат, флупиразофос, протіофос, пропафос, профенофос, фоксим, фозалон, фосмет, формотіон, форат, малатіон, мекарбам, месульфенфос, метамідофос, метидатіон, паратіон, паратіон-метил, монокротофос, трихлорфон, EPN, ізазофос, ізамідофос, кадусафос, диамідафос, дихлорфентіон, тіоназин, фенаміфос, фостіазат, фостіетан, фосфокарб, DSP, етопрофос, аланікарб, алдікарб, ізопрокарб, етіофенкарб, карбаріл, карбосульфан, ксилілкарб, тіодикарб, піримікарб, фенобукарб, фуратіокарб, пропоксур, бендиокарб, бенфуракарб, метоміл, метолкарб, XMC, карбофуран, алдоксикарб, оксаміл, акрінатрин, алетрин, есфенвалерат, емпентрин, циклопротрин, цигалотрин, гаммацигалотрин, лямбда-цигалотрин, цифлутрин, бета-цифлутрин, циперметрин, альфациперметрин, зета-циперметрин, силафлуофен, тетраметрин, тефлутрин, дельтаметрин, тралометрин, біфентрин, фенотрин, фенвалерат, фенпропатрин, фураметрин, пралетрин, флуцитринат, флувалінат, флуброцитринат, перметрин, ресметрин, етофенпрокс, картап, тіоциклам, бенсультап, ацетаміприд, імідаклоприд, клотіанидин, динотефуран, тіаклоприд, тіаметоксам, нітенпірам, хлорфлуазурон, дифлубензурон, тефлубензурон, трифлумурон, новалурон, новифлумурон, бистрифлуорон, флуазурон, флуциклоксурон, флуфеноксурон, гексафлумурон, луфенурон, хромафенозид, тебуфенозид, галофенозид, метоксифенозид, діофенолан, циромазін, пірипроксифен, бупрофезин, метопрен, гідропрен, кінопрен, триазамат, ендосульфан, хлорфенсон, хлорбензилат, дикофол, бромопропілат, ацетопрол, фіпроніл, етіпрол, піретрин, ротенон, сульфат нікотину, агент BT (Bacillus Thuringiensis), спіносад, абамектин, ацеквіноцил, амідофлумет, амітраз, етоксазол, хінометіонат, клофентезин, фенбутатіну оксид, дієнохлор, цигексатин, спіродиклофен, спіромезіфен, тетрадіфон, тебуфенпірад, бінапакрил, біфеназат, піридабен, піримідифен, феназахін, фенотіокарб, фенпіроксимат, флуакрипірим, флуазінам, флуфензин, гекситіазокс, пропаргіт, бензомат, 8 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 полінактиновий комплекс, мілбемектин, луфенурон, мекарбам, метіокарб, мевінфос, халфенпрокс, азадірахтін, діафентіурон, індоксакарб, бензоат емамектину, олеат калію, олеат натрію, хлорфенапір, толфенпірад, піметрозин, феноксикарб, гідраметилнон, гідроксипропіл крохмаль, піридаліл, флуфенерим, флубендиамід, флонікамід, метафлумізол, лепімектин, TPIC, альбендазол, оксибендазол, оксфендазол, трихламід, фенсульфотіон, фенбендазол, левамізолу гідрохлорид, морантель тартрат, дазомет, метам натрію, триадімефон, гексаконазол, пропіконазол, іпконазол, прохлораз, трифлумізол, тебуконазол, епоксиконазол, дифеноконазол, флусилазол, триадіменол, ципроконазол, метконазол, флухінконазол, бітертанол, тетраконазол, тритіконазол, флутриафол, пенконазол, диніконазол, фенбуконазол, бромуконазол, імібенконазол, сімеконазол, міклобутаніл, хімексазол, імазаліл, фураметпір, тифлузамід, етрідіазол, окспоконазол, окспоконазолу фумарат, пефуразоат, протіоконазол, пірифенокс, фенарімол, нуарімол, бупіримат, мепаніпірим, ципродиніл, піриметаніл, металаксіл, мефеноксам, оксадиксіл, беналаксіл, тіофанат, тіофанат-метил, беноміл, карбендазим, фуберідазол, тіабендазол, манзеб, пропінеб, зінеб, метірам, манеб, зірам, тіурам, хлороталоніл, етабоксама, оксикарбоксин, карбоксин, флутоланіл, силтіофам, мепроніл, диметоморф, фенпропідин, фенпропіморф, спіроксамін, тридеморф, додеморф, флуморф, азоксистробін, крезоксим-метил, метоміностробін, орисастробін, флуоксастробін, трифлоксистробін, димоксистробін, піраклостробін, пікоксистробін, іпродіон, процимідон, вінклозолін, хлозолінат, флусульфамід, дазомет, метил ізотіоцианат, хлорпікрин, метасульфокарб, гідроксиізоксазол, гідроксиізоксазол калію, ехломезол, D-D, карбам, основний хлорид міді, основний сульфат міді, нонілфенолсульфонат міді, оксин міді, DBEDC, безводий сульфат міді, міді сульфат пентагідрат, гідроксид міді, неорганічна сірка, сірка, що змочується, сірчисте вапно, сульфат цинку, фентін, гідрокарбонат натрію, гідрокарбонат калію, гіпохлорит натрію, срібло, едифенфос, толклофос-метил, фосетіл, іпробенфос, дінокап, піразофос, карпропамід, фталід, трициклазол, пірохілон, диклоцимет, феноксаніл, касугаміцин, валідаміцин, поліоксини, бластицидін С, окситетрациклін, мілдіоміцин, стрептоміцин, рапсова олія, машинне мастило, бентіавалікарбізопропіл, іпровалікарб, пропамокарб, диетофенкарб, флуороімід, флудиоксаніл, фенпіклоніл, хіноксифен, оксолінова кислота, хлороталоніл, каптан, фолпет, пробеназол, ацибензолар-С-метил, тіадиніл, цифлуфенамід, фенгексамід, дифлуметорим, метрафенон, пікобензамід, прохіназид, фамоксадон, циазофамід, фенамідон, зоксамид, боскалід, цимоксаніл, дитіанон, флуазінам, дихлофлуанід, трифорін, ізопротіолан, ферімзон, дикломезин, теклофталам, пенцикурон, хіномеіионат, іміноктадину ацетат, іміноктадину албесілат, амбам, полікарбамат, тіадіазін, хлоронеб, диметилдитіокарбамат нікелю, гуазатин, додецилгуанідинацетат, квінтозен, толілфлуанід, анілазін, нітроталізопропіл, фенітропан, діметірімол, бентіазол, білок гарпін, флуметовер, мандіпропамід та пентіопірад. Полінуклеотиди Як використовується в цьому документі, термін "ДНК", "молекула ДНК", "полінуклеотидна молекула ДНК" належить до одноланцюгової ДНК (олДНК) або дволанцюгової ДНК (длДНК) молекули геномного або синтетичного походження, наприклад, полімеру з дезоксирібонуклеотидних основ або полінуклеотидна молекула ДНК. Як використовується в цьому документі, термін "РНК", "молекула РНК", "полінуклеотидна молекула РНК" належить до одноланцюгової РНК (олРНК) або дволанцюгової РНК (длРНК) молекули геномного або синтетичного походження, наприклад, полімер із рібонуклеотидних основ, які складають одноабо дволанцюгові ділянки. Якщо не вказане інше, то нуклеотидні послідовності в тексті цього опису читаються зліва направо в напрямку від 5' до 3'. Номенклатура, яка використовується в цьому документі, приведена згідно з вимогами Розділу 37 Зводу нормативних актів федеральних органів виконавчої влади США § 1,822 і представлена в таблицях згідно стандарту ВОІВ (Всесвітня організація інтелектуальної власності) ST.25 (1998), Додаток 2, Таблиці 1 та 3. Як використовується в цьому документі, "полінуклеотид" належить до молекули ДНК або РНК, що містить декілька нуклеотидів і зазвичай належить як до "олігонуклеотидів" (молекула полінуклеотиду зазвичай із 50 або менше нуклеотидів у довжину), так і до полінуклеотидів із 51 або більше нуклеотидів. Варіанти реалізації цього винаходу включають композиції, які складаються з олігонуклеотидів довжиною 18-25 нуклеотидів (18-мер, 19-мер, 20-мер, 21-мер, 22-мер, 23-мер, 24-мер або 25-мер), наприклад, олігонуклеотиди SEQ ID NO: 597-1082 або їх фрагменти, або полінуклеотиди середньої довжини, довжина яких складає 26 або більше нуклеотидів (полінуклеотиди з 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, близько 65, близько 70, близько 75, близько 80, близько 85, близько 90, близько 95, близько 100, близько 110, близько 120, близько 130, близько 140, близько 150, близько 160, близько 170, близько 180, близько 190, близько 9 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 200, близько 210, близько 220, близько 230, близько 240, близько 250, близько 260, близько 270, близько 280, близько 290 або близько 300 нуклеотидів), наприклад, олігонуклеотиди SEQ ID NO: 33-596 або їх фрагменти, або довгі полінуклеотиди, більше ніж близько 300 нуклеотидів (наприклад, полінуклеотиди від близько 300 до близько 400 нуклеотидів, від близько 400 до близько 500 нуклеотидів, від близько 500 до близько 600 нуклеотидів, від близько 600 до близько 700 нуклеотидів, від близько 700 до близько 800 нуклеотидів, від близько 800 до близько 900 нуклеотидів, від близько 900 до близько 1000 нуклеотидів, від близько 300 до близько 500 нуклеотидів, від близько 300 до близько 600 нуклеотидів, від близько 300 до близько 700 нуклеотидів, від близько 300 до близько 800 нуклеотидів, від близько 300 до близько 900 нуклеотидів або близько 1000 нуклеотидів у довжину, або навіть більше ніж близько 1000 нуклеотидів у довжину, наприклад, досягають загальної довжини гену-мішені, у тому числі з кодуючими або некодуючими, або як кодуючими, так і некодуючими ділянками генумішені), наприклад, полінуклеотиди Таблиці 1 (SEQ ID NO: 1-32), в якій обрані полінуклеотиди або їх фрагменти, які гомологічні або комплементарні SEQ ID NO: 1-32, пригнічують, стримують або іншим чином уповільнюють експресію гену-мішені EPSPS. Ген-мішень містить будь-яку молекулу полінуклеотиду в клітині рослини або її фрагменті, для якої модуляція експресії генумішені забезпечується способами та композиціями цього винаходу. Якщо полінуклеотид є дволанцюговим, його довжина може бути аналогічним чином описана відповідно до пар основ. Олігонуклеотиди та полінуклеотиди згідно цього винаходу можна зробити практично ідентичними або практично комплементарними суміжним генетичним елементам гену, наприклад, таким, що охоплюють місце з'єднання інтрону та екзону, місце з'єднання промотору та області, що транскрибується, місце з'єднання 5'-лідерної і кодуючої послідовності, з'єднання 3'-нетрансльованої області і кодуючої послідовності. Композиції полінуклеотидів, використовувані в різних варіантах реалізації цього винаходу, включають композиції, які містять олігонуклеотиди або полінуклеотиди, або суміші їх обох, у тому числі РНК або ДНК, або гібриди РНК/ДНК, або хімічно модифіковані олігонуклеотиди або полінуклеотиди, або їх суміші. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид може являти собою сполучення рібонуклеотидів і дезоксирібонуклеотидів, наприклад, синтетичні полінуклеотиди, що складаються переважно з рібонуклеотидів, але з одним або декількома кінцевими дезоксирібонуклеотидами або синтетичні полінуклеотиди, що складаються переважно з дезоксирібонуклеотидів, але з одним або більше кінцевими дидезоксирібонуклеотидами. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить неканонічні нуклеотиди, такі як інозин, тіоуридин або псевдоуридин. У деяких варіантах реалізації полінуклеотид містить хімічно модифіковані нуклеотиди. Приклади хімічно модифікованих олігонуклеотидів або полінуклеотидів добре відомі в цій галузі техніки; дивися, наприклад, публікацію патенту США 20110171287, публікацію патенту США 20110171176 та публікацію патенту США 20110152353, публікацію патенту США 20110152346, публікацію патенту США 20110160082, які включені в цей документ у вигляді посилання. Наприклад, ті, які включають, без обмеження ним, фосфодиефірний остов олігонуклеотиду або полінуклеотиду, який зустрічається в природі, можуть бути частково або повністю модифіковані за допомогою міжнуклеотидних зв'язків, модифікованих фосфоротіоатом, фосфородитіоатом або метилфосфонатом, модифіковані нуклеозидні основи або модифіковані цукри можуть використовуватися в синтезі олігонуклеотидів або полінуклеотидів, та олігонуклеотиди або полінуклеотиди можуть бути помічені флуоресцентним фрагментом (наприклад, флуоресцеїн або родамін) або іншою міткою (наприклад, біотин). Полінуклеотиди можуть бути одно- або дволанцюговою РНК або одно- або дволанцюговою ДНК, або дволанцюговими ДНК/РНК гібридами або їх модифікованими аналогами та можуть мати довжини, як у олігонуклеотида або більше. У більш конкретних варіантах реалізації полінуклеотиди, які забезпечують одноланцюгову РНК в клітині рослини, обирають із групи, що складається з (а) одноланцюгової молекули РНК (олРНК), (б) одноланцюгової молекули РНК, яка самостійно гібридизується з утворенням дволанцюгової молекули РНК, (в) дволанцюгової молекули РНК (длРНК), (г) одноланцюгової молекули ДНК (олДНК), (д) одноланцюгової молекули ДНК, яка самостійно гібридизується з утворенням дволанцюгової молекули ДНК, і (е) одноланцюгової молекули ДНК, яка містить модифікований ген Pol III, який транскрибується в молекулу РНК, (є) дволанцюгової молекули ДНК (длДНК), (ж) дволанцюгової молекули ДНК, яка містить модифікований ген Pol III, який транскрибується в молекулу РНК, (з) дволанцюгової, гібридизированої молекули РНК/ДНК або їх комбінацій. У деяких варіантах реалізації ці полінуклеотиди містять хімічно модифіковані нуклеотиди або неканонічні нуклеотиди. У варіантах реалізації способу полінуклеотиди містять дволанцюгову ДНК, утворену внутрішньомолекулярною гібридизацією, дволанцюгову ДНК, утворену міжмолекулярною 10 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гібридизацією, дволанцюгову РНК, утворену внутрішньомолекулярною гібридизацією або дволанцюгову РНК, утворену міжмолекулярною гібридизацією. У деяких варіантах реалізації олігонуклеотиди можуть бути з тупими кінцями або можуть мати 3'-виступ з 1-5 нуклеотидів, щонайменше одного або обох ланцюгів. Інші конфігурації олігонуклеотиду відомі в цій галузі техніки та розглядаються в цьому документі. В одному варіанті реалізації полінуклеотиди містять одноланцюгову ДНК або одноланцюгову РНК, яка самостійно гібридизується і утворює шпилькову структуру із щонайменше частково дволанцюговою структурою, що містить щонайменше один сегмент, який буде гібридизуватися з РНК, яка транскрибується з гену-мішені з метою пригнічення. У разі, якщо не передбачається зв'язування якимось механізмом, вважають, що такі полінуклеотиди є або утворюватимуть одноланцюгову РНК із щонайменше одним сегментом, який буде гібридизуватися з РНК, яка транскрибується з гену-мішені з метою пригнічення. У деяких інших варіантах реалізації полінуклеотиди додатково містять промотор, зазвичай промотор, що функціонує в рослині, наприклад, промотор pol II, промотор pol III, промотор pol IV або промотор pol V. Термін "ген" належить до хромосомної ДНК, плазмідної ДНК, кДНК, інтрону та екзону ДНК, штучної полінуклеотидної ДНК або іншої ДНК, яка кодує пептид, поліпептид, білок або молекулу РНК-транскрипту, а також генетичні елементи, які фланкують кодуючу послідовність, які беруть участь у регуляції експресії, наприклад, промоторні області, 5'-лідерні області, 3'нетрансльовані області. Будь-який із компонентів гену являє собою потенційні мішені для олігонуклеотидів та полінуклеотидів згідно цього винаходу. Тригерні молекули полінуклеотиду призначені для модуляції експресії за допомогою індукції регуляції або пригнічення ендогенного гену HPPD в рослині і призначені, щоб їх нуклеотидна послідовність була практично ідентичною або практично комплементарною нуклеотидній послідовності ендогенного гену HPPD рослини або послідовності РНК, яка транскрибується з ендогенного гену HPPD рослини, включаючи трансген в рослині, який забезпечує стійкий до гербіциду фермент HPPD, який може бути кодуючою послідовністю або некодуючою послідовністю. Ефективні молекули, які модулюють експресію, називають "тригерною молекулою або тригерним полінуклеотидом". Під "практично ідентичними" або "практично комплементарними" мають на увазі, що тригерні полінуклеотиди (або щонайменше один ланцюг дволанцюгового полінуклеотиду або його ділянки, або ділянки одноланцюгового полінуклеотиду) призначені для гібридизаціі з ендогенним геном некодуючої послідовності або з РНК, що транскрибується (відома як інформаційна РНК або РНК-транскрипт) з ендогенного гену для здійснення регуляції або пригнічення експресії ендогенного гену. Тригерні молекули визначають за допомогою "перекриття" генів-мішеней зондами, які частково перекриваються, або зондами, які не перекриваються, антисмислових або смислових полінуклеотидів, які практично ідентичні або практично комплементарні нуклеотидній послідовності ендогенного гену. Декілька послідовностей-мішеней можуть збігатися та області послідовності з однаковою гомологією, відповідно до способів цього винаходу, визначають як потенційні тригерні молекули для декількох мішеней. Декілька тригерних молекул різної довжини, наприклад, з 18-25 нуклеотидів, 26-50 нуклеотидів, 51-100 нуклеотидів, 101-200 нуклеотидів, 201-300 нуклеотидів або більше можна об'єднати в пул із декількох обробок для дослідження полінуклеотидних молекул, які охоплюють ділянку генної послідовності (наприклад, ділянка кодуючої області в порівнянні з ділянкою некодуючої області, або 5'-ділянка гену в порівнянні з 3'-ділянкою гену) або усю генну послідовність, включаючи кодуючу і некодуючу область гену-мішені. Полінуклеотидні молекули тригерних молекул, об'єднаних у пул, можна розділити на дрібніші пули або одиночні молекули, щоб визначити тригерні молекули, які забезпечують бажаний ефект. Полінуклеотидні молекули РНК та ДНК гену-мішені (Таблиця 1, SEQ ID NO: 1-32) секвенують будь-якою кількістю доступних способів і устаткування. Деякі з технологій секвенування є в продажу, наприклад, платформа для секвенування за допомогою гібридизації від компанії Affymetrix Inc. (Саннівейл, штат Каліфорнія) і платформи для секвенування за допомогою синтезу від компаній 454 Life Sciences (Бредфорд, штат Коннектікут), Illumina/Solexa (Хейуорд, штат Каліфорнія), і Helicos Biosciences (Кембрідж, штат Массачусетс), а також платформа секвенування за допомогою лігування від компанії Applied Biosystems (Фостер Сіті, штат Каліфорнія), як описано нижче. На додаток до секвенування одиночної молекули, виконаного з використанням секвенування за допомогою синтезу від компанії Helicos Biosciences, інші технології секвенування одиночної молекули здійснюються і включають технологію SMRT™ компанії Pacific Biosciences, технологію Ion Torrent™ і нанопорове секвенування, розроблені, наприклад, компанією Oxford Nanopore Technologies. Ген-мішень HPPD, що містить ДНК або РНК, може бути виділений із використанням праймерів або зондів практично комплементарних 11 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або практично гомологічних SEQ ID NO: 1-32 або їх фрагменту. Полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) фрагменту гену можна отримати за допомогою використання праймерів практично комплементарних або практично гомологічних SEQ ID NO: 1-32 або їх фрагменту, що доцільно для виділення гену HPPD із геному рослини. SEQ ID NO: 1-32 або їх фрагменти можуть використовуватися в різних технологіях захоплення послідовності для виділення додаткових послідовностей гену-мішені, наприклад, включаючи, без обмеження ними, Roche NimbleGen® (Медісон, штат Вісконсін) та стрептавідин-зв'язані Dynabeads® (Life Technologies, Гранд Айленд, штат Нью-Йорк), та US20110015084, які включені в цей документ у вигляді посилання в повному обсязі. У деяких варіантах реалізації комплементарність послідовностей функціональних одноланцюгових полінуклеотидів має бути не 100 відсотковою, а щонайменше достатньою, щоб дозволити гібридизацію з РНК, яка транскрибується з гену-мішені або ДНК гену-мішені з утворенням дуплексу, щоб дозволити механізм пригнічення експресії генів. Таким чином, у варіантах реалізації фрагмент полінуклеотиду призначений бути практично ідентичним або практично комплементарним послідовності з 18 або більше безперервних нуклеотидів як у послідовності-мішені гену HPPD, так і в інформаційній РНК, що транскрибується з гену-мішені. Під "практично ідентичними" мають на увазі 100 відсоткову ідентичність послідовності або щонайменше близько 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 відсоткову ідентичність послідовності в порівнянні з послідовністю з 18 або більше безперервних нуклеотидів як у гені-мішені, так і в РНК, що транскрибується з гену-мішені; під "практично комплементарними" мають на увазі 100 відсоткову комплементарність послідовності або щонайменше близько 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 відсоткову комплементарність послідовності в порівнянні з послідовністю з 18 або більше безперервних нуклеотидів як у гені-мішені, так і в РНК, що транскрибується з гену-мішені. У деяких варіантах реалізації цього винаходу молекули полінуклеотиду мають 100 відсоткову ідентичність послідовності з компліментарністю до однієї алелі або до одного представника сімейства цього гену-мішені (кодуюча або некодуюча послідовність гену згідно цього винаходу); у інших варіантах реалізації молекули полінуклеотиду мають 100 відсоткову ідентичність послідовності з комплементарністю до декількох алелей або представників сімейства цього гену-мішені. У деяких варіантах реалізації полінуклеотиди, які використовуються в композиціях, які практично ідентичні або практично комплементарні гену-мішені або транскрипту, включатимуть домінуючу нуклеїнову кислоту в композиції. Таким чином, у деяких варіантах реалізації полінуклеотиди, які практично ідентичні або практично комплементарні гену-мішені або транскрипту, міститимуть щонайменше близько 50 %, 75 %, 95 %, 98 % або 100 % нуклеїнових кислот, приведених у композиції в масовій або молярній концентрації. Проте, у деяких варіантах реалізації полінуклеотиди, які практично ідентичні або практично комплементарні гену-мішені або транскрипту, можуть містити щонайменше від близько 1 % до близько 50 %, від близько 10 % до близько 50 %, від близько 20 % до близько 50 % або від близько 30 % до близько 50 % нуклеїнових кислот, приведених у композиції в масовій або молярній концентрації. Також надані композиції, в яких полінуклеотиди, які практично ідентичні або практично комплементарні генумішені або транскрипту, можуть містити щонайменше від близько 1 % до 100 %, від близько 10 % до 100 %, від близько 20 % до близько 100 %, від близько 30 % до близько 50 % або від близько 50 % до 100 % нуклеїнових кислот, приведених у композиції в масовій або молярній концентрації. "Ідентичність" належить до міри схожості двох послідовностей полінуклеїнових кислот або білків. Вирівнювання двох послідовностей виконується за допомогою відповідної комп'ютерної програми. Комп'ютерною програмою для виконання вирівнювання послідовностей, яка широко використовується і прийнята до використання являється CLUSTALW v1.6 (Thompson, зі співавторами Nucl. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). Кількість схожих основ або амінокислот ділять на загальну кількість основ або амінокислот та множать на 100, щоб отримати відсоток ідентичності. Наприклад, якщо у двох послідовностей із 580 пар основ було б 145 схожих основ, вони були б ідентичними на 25 відсотків. Якщо дві порівнювані послідовності мають різну довжину, кількість збігів ділять на найменшу з двох довжин. Наприклад, якщо з 200 і 400 амінокислот білку є 100 схожих амінокислот, вони ідентичні на 50 відсотків по відношенню до коротшої послідовності. Якщо коротша послідовність складається з менше ніж 150 основ або 50 амінокислот у довжину, кількість збігів ділять на 150 (для основ нуклеїнових кислот) або на 50 (для амінокислот) і множать на 100, щоб отримати відсоток ідентичності. Тригерні молекули для конкретних представників сімейства генів можна визначити з кодуючих і/або некодуючих послідовностей сімейств генів рослини або декількох рослин шляхом вирівнювання і вибору 200-300 фрагментів полінуклеотиду з найменш гомологічних 12 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 областей серед вирівняних послідовностей і оцінити за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів (таких, як смислова або антисмислова олДНК або олРНК, длРНК або длДНК), щоб визначити їх відносну ефективність у стимулюванні фенотипу стійкості до гербіцидів. Ефективні сегменти додатково ділять на 50-60 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги найменш гомологічним і повторно оцінюють за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів. 50-60 ефективних фрагментів полінуклеотиду ділять на 19-30 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги найменш гомологічним і знову оцінюють для стимулювання виходу/якості фенотипу. Після оцінки відносної ефективності фрагменти використовують окремо або знову оцінюють у комбінації з одним або декількома іншими фрагментами для визначення складу тригеру або суміші тригерних полінуклеотидів для забезпечення виходу/якості фенотипу. Тригерні молекули для широкого спектру дій можна визначити з кодуючих і/або некодуючих послідовностей сімейств генів рослини або декількох рослин за допомогою вирівнювання і вибору 200-300 фрагментів полінуклеотиду з найбільш гомологічних областей серед вирівняних послідовностей і оцінити за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів (таких, як смислова або антисмислова олДНК або олРНК, длРНК або длДНК), щоб визначити їх відносну ефективність у стимулюванні виходу/якості фенотипу. Ефективні сегменти ділять на 50-60 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги більш гомологічним і повторно оцінюють за допомогою місцево застосованих полінуклеотидів. 50-60 ефективних фрагментів полінуклеотиду ділять на 19-30 фрагментів полінуклеотиду з відданням переваги більш гомологічним і знову оцінюють для стимулювання виходу/якості фенотипу. Після оцінки відносної ефективності фрагменти використовують окремо або в комбінації з одним або декількома іншими фрагментами для визначення складу тригеру або суміші тригерних полінуклеотидів для забезпечення виходу/якості фенотипу. Способи отримання полінуклеотидів добре відомі в цій галузі техніки. Способи і композиції хімічного синтезу, синтезу in vivo та синтезу in vitro відомі в цій галузі техніки і включають різні вірусні елементи, мікробні клітини, модифіковані полімерази і модифіковані нуклеотиди. Комерційний синтез олігонуклеотидів часто забезпечує два дезоксирібонуклеотиди на 3'-кінці смислового ланцюга. Довгі молекули полінуклеотиду можна отримати за допомогою комерційно доступних наборів, наприклад, у наборах Applied Biosystems/Ambion (Остін, штат Техас) ДНК лігується на 5'-кінці в мікробній касеті експресії, яка містить бактерійний промотор полімерази Т7, що робить ланцюги РНК, які можна зібрати в длРНК, і наборів, що постачаються різними виробниками, які включають T7 RiboMax Express (Promega, Медісон, штат Вайомінг), AmpliScribe T7-Flash (Epicentre, Медісон, штат Вайомінг) та TranscriptAid T7 High Yield (Fermentas, Глен Берні, штат Меріленд). Молекули длРНК можна отримати з мікробних касет експресії в бактерійних клітинах (Ongvarrasopone зі співавторами ScienceAsia 33:35-39; Yin, Appl. Microbiol. Biotechnol 84:323-333, 2009; Liu зі співавторами, BMC Biotechnology 10:85, 2010), у яких регульована або недостатня активність ферменту РНКази III або із використанням різних вірусних векторів для отримання достатньої кількості длРНК. Згідно цього винаходу фрагменти гену HPPD поміщають у мікробні касети експресії в такому положенні, в якому фрагменти швидко формують олРНК або длРНК, які використовуються в способах, описаних у цьому документі, для регуляції експресії гену-мішені HPPD. Довгі молекули полінуклеотиду можна також зібрати з декількох фрагментів РНК або ДНК. У деяких варіантах реалізації розрахункові параметри, такі як індекс Рейнольдса (Reynolds зі співавторами Nature Biotechnology 22, 326330 (2004), правила Тушля (Pei та Tuschl, Nature Methods 3(9): 670-676, 2006), алгоритм i-score (Nucleic Acids Res 35: e123‚ 2007), програма i-Score Designer tool і пов'язані алгоритми (Nucleic Acids Res 32: 936-948‚ 2004. Biochem Biophys Res Commun 316: 1050-1058‚ 2004, Nucleic Acids Res 32: 893-901‚ 2004, Cell Cycle 3: 790-5‚ 2004, Nat Biotechnol 23: 995-1001‚ 2005, Nucleic Acids Res 35: e27‚ 2007, BMC Bioinformatics 7: 520‚ 2006, Nucleic Acids Res 35: e123‚ 2007, Nat Biotechnol 22: 326-330‚ 2004) відомі в цій галузі техніки і можуть використовуватися при виборі полінуклеотидних послідовностей, ефективних для пригнічення експресії генів. У деяких варіантах реалізації проводять скринінг послідовності полінуклеотиду проти геномної ДНК рослини-мішені, щоб мінімізувати неумисне пригнічення експресії інших генів. Ліганди можуть бути прив'язані до полінуклеотиду, наприклад, длРНК, олРНК, длДНК або олДНК. Ліганди в цілому можуть містити модифікатори, наприклад, для поліпшення поглинання; діагностичні сполуки або репортерні групи, наприклад, для моніторингу розподілу; зшиваючі агенти; фрагменти, які надають стійкість до нуклеази; і природні або нестандартні нуклеїнові основи. Звичайні приклади включають ліпофіли, ліпіди (наприклад, холестерин, жовчна кислота або жирні кислоти (наприклад, літохолевий олеїл, лауроїл, докозеніл, стеароїл, пальмитоїл, міристоїлу олеоїл, лінолеоїл)), стероїди (наприклад, уваол, гецигенін, диосгенін), терпени 13 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, тритерпени, наприклад, сарсасапогенін, фриеделін, літохолева кислота, дериватизирована епифріделанолом), вітаміни (наприклад, фолієва кислота, вітамін А, біотин, піридоксаль), вуглеводи, білки, агенти, що зв'язують білок, молекули, спрямовані на інтегрин, полікатіони, пептид, поліаміни і пептидоміметики. Ліганд може також бути рекомбінантною або синтетичною молекулою, такою як синтетичний полімер, наприклад, поліетиленгліколь (ПЕГ), ПЕГ-40K, ПЕГ-20K та ПЕГ-5K. Інші приклади лігандів включають ліпофільні молекули, такі як, холестерин, холева кислота, адамантан оцтової кислоти, 1-пірен масляна кислота, дигідротестостерон, гліцерин (наприклад, складні ефіри та їх прості ефіри, наприклад, С 10, С11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19 або С20 алкіл; наприклад, лауроїл, докозеніл, стеароїл, олеоїл, лінолеоїл, 1,3-біс-O(гексадецил)гліцерину, 1,3-біс-O(октадецил)гліцерину, геранілоксигексильна група, гексадецилгліцерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандіол, гептадецильна група, пальмітинова кислота, міристинова кислота, O3-(олеоїл)литохолевої кислоти, O3(олеоїл)холенової кислоти, додеканоїл, літохоліл, 5β-холаніл, N, N-дистеарїл-літохоламід, 1,2ди-О-стеароїлгліцерид, диметокситритіл або феноксазин) та ПЕГ (наприклад, ПЕГ-5K, ПЕГ-20K, ПЕГ-40K). Переважні ліпофільні фрагменти містять ліпід, холестерини, олеїл, ретиніл або холестерильні залишки. З'єднання ліганду з длРНК може поліпшити її клітинну абсорбцію, ліпофільні сполуки, які були з'єднані з олігонуклеотидами, містять 1-пірен масляну кислоту, 1,3-біс-O(гексадецил)гліцерин та ментол. Одним із прикладів ліганду для рецепторно-опосередкованого ендоцитозу є фолієва кислота. З'єднання длРНК, які містять фолієву кислоту, можна було б ефективно транспортувати в клітину за допомогою фолат-рецепторно-опосередкованого ендоцитозу. Інші ліганди, які були з'єднані з олігонуклеотидами, включають поліетиленгліколі, вуглеводні кластери, зшиваючі агенти, кон'югати порфірину, транспортні пептиди та ліпіди, такі як холестерин. В деяких випадках з'єднання катіонного ліганду з олігонуклеотидом призводить до поліпшення стійкості до дії нуклеази. Типовими прикладами катіонних лігандів є пропіламонію та диметилпропіламонію. Цікаво, що повідомлялося, що антисмислові олігонуклеотиди зберігають свою високу афинність зв'язування з іРНК після того, як катіонний ліганд розподілили по усьому олігонуклеотиду. Дивися M. Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 та посилання в ньому. Біологічна доставка може бути здійснена різними способами, включаючи, без обмеження ними, (1) завантаження ліпосом молекулою длРНК, описаною в цьому винаході і (2) утворення комплексу молекули длРНК із ліпідами або ліпосомами з отриманням комплексів "нуклеїнова кислота-ліпід" або "нуклеїнова кислота-ліпосома". Ліпосома може складатися з катіонних та нейтральних ліпідів, зазвичай використовуваних для трансфекції клітин in vitro. Катіонні ліпіди можуть вступати в реакції комплексоутворення (наприклад, з перенесенням заряду) з негативно зарядженими нуклеїновими кислотами з утворенням ліпосом. Прикладами катіонних ліпосом є, без обмеження ними, ліпофектин, ліпофектамін, ліпофектак та DOTAP. Способи отримання ліпосом добре відомі фахівцям в цій галузі техніки. Ліпосомні композиції можна отримати, наприклад, з фосфатидилхоліну, диміристоїлфосфатидилхоліну, дипальмітоїлфосфатидилхоліну, диміристоїлфосфатиділгліцерину, диолеїлфосфатиділетаноламіну або ліпосом, що містять дигідросфінгоміелін (DHSM). Багато ліпофільних агентів є комерційно доступними, включаючи Lipofectin® (Invitrogen/Life Technologies, Карлсбад, штат Каліфорнія) та Effectene™ (Qiagen, Валенсія, штат Каліфорнія). Крім того, способи системної доставки можуть бути оптимізовані з використанням комерційно доступних катіонних ліпідів, таких як DDAB або DOTAP, кожен з яких може бути змішаний із нейтральним ліпідом, таким як DOPE або холестерин. В деяких випадках можуть використовуватися ліпосоми, наприклад, описані в публікації Templeton зі співавторами Nature Biotechnology, 15:647-652 (1997). В інших варіантах реалізації для доставки in vivo та ex vivo можуть використовуватися полікатіони, такі як поліетиленімін (Boletta зі співавторами, J. Am Soc. Nephrol. 7:1728, 1996). Додаткову інформацію, що належить до використання ліпосом для доставки нуклеїнових кислот, можна знайти в патенті США за номером 6,271,359, у публікації заявки PCT WO 96/40964 та в публікації Morrissey, D. зі співавторами, 2005, Nat Biotechnol. 23(8):1002-7. У деяких варіантах реалізації кремнійорганічний препарат, який є комерційно доступним, як поверхнево-активна речовина Silwet® L-77 під номером CAS 27306-78-1 та номером EPA: CAL.REG.NO. 5905-50073-AA і нині поставляється компанією Momentive Performance Materials, Олбані, штат Нью-Йорк, можна використовувати для виготовлення полінуклеотидної композиції. У деяких варіантах реалізації, в яких кремнійорганічний препарат Silwet L-77 використовується для попередньої обробки (перед розпиленням) листя рослини або інших поверхонь рослини, свіжоприготовані концентрації в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі 14 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %) є ефективними в підготовці листа або іншої поверхні рослини до перенесення молекул полінуклеотиду в клітини рослини при місцевому застосуванні на поверхні. У деяких варіантах реалізації способів та композицій, приведених у цьому винаході, використовується або надається композиція, яка містить полінуклеотидну молекулу і кремнійорганічний препарат, який містить Silwet L-77 в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %). У деяких варіантах реалізації будь-який із комерційно доступних кремнійорганічних препаратів, що надаються під наступними товарними знаками: Breakthru S 321, Breakthru S 200 Cat# 67674-67-3, Breakthru OE 441 Cat#68937-55-3, Breakthru S 278 Cat #27306-78-1, Breakthru S 243, Breakthru S 233 Cat#134180-76-0, виробництва компанії Evonik Goldschmidt (Німеччина), Silwet® HS 429, Silwet® HS 312, Silwet® HS 508, Silwet® HS 604 (виробництва компанії Momentive Performance Materials, Олбані, штат Нью-Йорк), може використовуватися як агент перенесення в полінуклеотидній композиції. У деяких варіантах реалізації, в яких кремнійорганічний препарат використовується для попередньої обробки (перед розпиленням) листя рослини або інших поверхонь рослини, свіжоприготовані концентрації в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %) є ефективними в підготовці листа або іншої поверхні рослини до перенесення молекул полінуклеотиду в клітини рослини при місцевому застосуванні на поверхні. У деяких варіантах реалізації способів та композицій, приведених у цьому винаході, використовується або надається композиція, яка містить полінуклеотидну молекулу і кремнійорганічний препарат в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %). Кремнійорганічні препарати, використовувані в способах та композиціях, приведених у цьому винаході, можуть містити одну або більше ефективних кремнійорганічних сполук. Як використовується в цьому документі, вираз "ефективна кремнійорганічна сполука" використовується для опису будь-якої кремнійорганічної сполуки, яка міститься в кремнійорганічному препараті, який дозволяє полінуклеотиду потрапити в клітину рослини. У деяких варіантах реалізації ефективні кремнійорганічні сполуки можуть дозволити полінуклеотиду потрапити в клітину рослини таким чином, щоб дозволити полінуклеотидоопосередковане пригнічення експресії гену-мішені в клітині рослини. В цілому, ефективні кремнійорганічні сполуки включають, без обмеження ними, сполуки, які можуть містити: i) трисилоксанову головну групу, сполучену ковалентним зв'язком з, ii) алкільним лінкером, який включає, без обмеження ним, н-пропіловий лінкер, сполучений ковалентним зв'язком з, iii) полігліколевим ланцюгом, сполученим ковалентним зв'язком з, iv) кінцевою групою. Трисилоксанові головні групи таких ефективних кремнійорганічних сполук включають, без обмеження ним, гептаметилтрисилоксан. Алкільні лінкери можуть включати, без обмеження ним, н-пропіловий лінкер. Полігліколеві ланцюги включають, без обмеження ними, поліетиленгліколь або поліпропіленгліколь. Полігліколеві ланцюги можуть містити суміш, яка забезпечує середню довжину ланцюга "n" близько "7,5". У деяких варіантах реалізації середня довжина ланцюга "n" може варіюватися від близько 5 до близько 14. Кінцеві групи можуть включати, без обмеження ними, алкільні групи, такі як метильна група. Вважається, що ефективні кремнійорганічні сполуки включають, без обмеження ними, трисилоксанетоксиліровані поверхнево-активні речовини або поліалкіленоксид, модифікований гептаметилтрисилоксаном. (Сполука I: поліалкіленоксид гептаметилтрисилоксан, середня довжина n=7,5). 15 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У деяких варіантах реалізації кремнійорганічний препарат, що містить кремнійорганічну сполуку, включаючу трисилоксанову головну групу, використовується в способах та композиціях, приведених у цьому винаході. У деяких варіантах реалізації кремнійорганічний препарат, що містить кремнійорганічну сполуку, включаючу гептаметилтрисилоксанову головну групу, використовується в способах та композиціях, приведених у цьому винаході. У деяких варіантах реалізації кремнійорганічна композиція, яка містить Сполуку I, використовується в способах та композиціях, приведених у цьому винаході. У деяких варіантах реалізації способів та композицій, приведених у цьому винаході, використовується або надається композиція, яка містить полінуклеотидну молекулу та одну або більше ефективну кремнійорганічну сполуку в діапазоні від близько 0,015 до близько 2 відсотків по вазі (мас. %) (наприклад, близько 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, 0,075, 0,08, 0,085, 0,09, 0,095, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,5 мас. %. Композиції містять, без обмеження ними, компоненти, в яких один або більше полінуклеотидів практично ідентичні або практично комплементарні послідовності гену HPPD (промотор, інтрон, екзон, 5'-нетрансльована область, 3'-нетрансльована область), агент перенесення, який забезпечує полінуклеотиду потрапляння в клітину рослини, гербіцид, який доповнює дію полінуклеотиду, один або декілька додаткових гербіцидів, які додатково посилюють гербіцидну дію композиції або забезпечують додатковий механізм дії, відмінний від механізму дії доповнюючого гербіциду, різні солі та стабілізуючи агенти, які збільшують корисність композиції у вигляді домішки компонентів композиції. В деяких аспектах способи включають одну або декілька обробок полінуклеотидною композицією та одну або декілька обробок агентом перенесення для кондиціонування рослини з метою проникнення полінуклеотидів. Якщо агент для кондиціонування з метою проникнення являє собою кремнійорганічну сполуку або сполуку, що міститься в нім, варіанти реалізації полінуклеотидних молекул являють собою дволанцюгові РНК олігонуклеотиди, одноланцюгові РНК олігонуклеотиди, дволанцюгові РНК полінуклеотиди, одноланцюгові РНК полінуклеотиди, дволанцюгові ДНК олігонуклеотиди, одноланцюгові ДНК олігонуклеотиди, дволанцюгові ДНК полінуклеотиди, одноланцюгові ДНК полінуклеотиди, хімічно модифіковані РНК або ДНК олігонуклеотиди або полінуклеотиди або їх суміші. Композиції та способи можуть використовуватися для модуляції експресії ендогенного гену HPPD (наприклад, патент США за номером 7,297,541, публікації патенту США 20110185444 та 20110185445) або трансгенного гену HPPD (наприклад, патент США за номером 7,312,379, публікація патенту США 20110191897) або інактивуючі гени інгібітору HPPD (патенти США за номерами 6,268,549; 6,768,044; 7,312,379; 7,304,209; WO 96/38567, WO 99/24585) у клітині рослини. У різних варіантах реалізації ген HPPD містить кодуючу (білок-кодуючу або трансльовану) послідовність, некодуючу (нетрансльовану) послідовність або як кодуючу, так і некодуючу послідовність. Композиції можуть містити полінуклеотиди та олігонуклеотиди, призначені для виявлення декількох генів або декількох сегментів одного або більше генів. Генмішень може містити декілька послідовних сегментів гену-мішені, декілька непослідовних сегментів гену-мішені, декілька алелей гену-мішені або декілька генів-мішені з одного або більше видів. Розкривається спосіб для модуляції експресії гену HPPD в рослині, який включає: (а) кондиціонування рослини для проникнення полінуклеотидів та (б) обробку рослини полінуклеотидними молекулами, в якій полінуклеотидні молекули містять щонайменше один сегмент з 18 або більше безперервних нуклеотидів, клонованих або іншим чином отриманих з гену-мішені HPPD в антисмисловій або смисловій орієнтації, при якій полінуклеотидні молекули потрапляють всередину рослини та стимулюють модуляцію гену-мішені. Кондиціонування та застосування полінуклеотиду можна виконати окремо або за один етап. Коли кондиціонування та застосування полінуклеотиду виконують на окремих етапах, кондиціонування може передувати або може виконуватися після застосування полінуклеотиду впродовж декількох хвилин, годин або днів. У деяких варіантах реалізації на одній і тій же рослині може здійснювати більше ніж один етап кондиціонування або застосовувати більше ніж одну молекулу полінуклеотиду. У варіантах реалізації способу сегмент можна клонувати або отримати з (а) кодуючої (білок-кодуючої), (б) некодуючої (промотор та інші молекули, які стосуються гену) або (в) і кодуючих, і некодуючих частин гену-мішені. Некодуючі частини включають ДНК, наприклад, промоторні області або РНК, що транскрибується за допомогою ДНК, яка забезпечує регуляторні молекули РНК, включаючи, без обмеження ними: інтрони, 5'- або 3'-нетрансльовані області та мікроРНК, транс-діючі міРНК, природні антисмислові міРНК та інші малі РНК із 16 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 регуляторною функцією або РНК, виконуючі структурну або ферментативну функцію, включаючи, без обмеження ними: рібозими, рібосомні РНК, тРНК, аптамери та рібосвітчі. Усі публікації, патенти та патентні заявки включені в цей документ у вигляді посилання так, як якби кожна окрема публікація або патентна заявка була б конкретно і окремо включена за допомогою окремого посилання. Наступні приклади включені для демонстрації прикладів деяких переважних варіантів реалізації цього винаходу. Фахівцями в цій галузі техніки повинно оцінитися те, що технології, розкриті в прикладах, відповідають підходам, які винахідники успішно застосували на практиці, і, отже, можуть розглядатися в якості зразків переважних варіантів реалізації для його практичного застосування. Проте, фахівці в цій галузі техніки, відповідно до цього опису, повинні оцінити можливість виконання багатьох змін у конкретних варіантах реалізації, які були розкриті і все ж таки отримати схожий або аналогічний результат без відхилення від суті і обсягу цього винаходу. ПРИКЛАДИ Приклад 1. Полінуклеотиди, що належать до послідовностей гену HPPD. Полінуклеотидні молекули гену-мішені HPPD в природі зустрічаються в геномі Amaranthus palmeri, Amaranthus rudis, Amaranthus thunbergii, Amaranthus graecizans, Amaranthus hybridus, Amaranthus viridis, Ambrosia trifida, Kochia scoparia, Abutilon theophrasti, Conyza candensis, Digitaria sanguinalis, Euphorbia heterophylla, Lolium multiflorum та Xanthium strumarium та включають молекули, пов'язані з експресією поліпептиду, який визначається як HPPD, що містить регуляторні молекули, кДНК, які містять кодуючі і некодуючі області гену HPPD і його фрагментів, як показано в Таблиці 1. Полінуклеотидні молекули екстрагують із цих видів рослин за допомогою стандартних для цієї галузі техніки способів, наприклад, тотальну РНК екстрагують із використанням реагенту Trizol (Invitrogen Corp, Карлсбад, штат Каліфорнія, Cat. No. 15596-018) з дотриманням фахівцями в галузі екстракції полінуклеотиду протоколу виробника або його модифікацій, що може поліпшити відновлення або чистоту екстрагованої РНК. Коротко, розпочинають із 1 граму подрібнених тканин рослини для екстракції. Розподіляють на аліквоти 10 мілілітрів (мл) реагенту Trizol у 15 мл конічні пробірки. Додають подрібнений порошок у пробірки і струшують, щоб гомогенізувати. Інкубують гомогенізовані зразки впродовж 5 хвилин (хв) при кімнатній температурі (КТ) та потім додають 3 мл хлороформу. Енергійно трясуть пробірку вручну впродовж 15-30 секунд (сек) і інкубують при КТ впродовж 3 хв. Центрифугують пробірку при 7000 оборотах за хвилину (об/хв) впродовж 10 хв при 4 °C. Переливають водну фазу в нову 1,5 мл пробірку і додають 1 об'єм холодного ізопропанолу. Інкубують зразки впродовж 20-30 хв при КТ і центрифугують при 10000 об/хв впродовж 10 хв при 4 °C. Промивають гранули 80 відсотковим етанолом Sigma-класу. Видаляють супернатант і швидко висушують гранули на повітрі. Розчиняють РНК гранулу в близько 200 мікролітрах води, очищеної діетилпірокарбонатом. Недовго нагрівають при 65C, щоб розчинити гранулу і перемішують на вортексі або відміряють піпеткою, щоб ресуспендувати РНК гранулу. Корегують концентрацію РНК до 1-2 мікрограмів/мікролітр. ДНК екстрагують за допомогою набору EZNA SP Plant DNA Mini kit (Omega Biotek, Норкросс, штат Джорджія, Cat#D5511) і пробірки Lysing Matrix E (Q-Biogen, Cat#6914) з дотриманням фахівцями в галузі екстракції полінуклеотиду протоколу виробника або його модифікацій, що може поліпшити відновлення або чистоту екстрагованої ДНК. Коротко, до аліквоти подрібненої тканини в пробірці Lysing Matrix E на сухому льоді додають 800 мкл Buffer SP1 в кожен зразок, гомогенізують за допомогою руйнуючого клітини міні-гомогенізатора типу beadbeater впродовж 35-45 сек, інкубують на льоду впродовж 45-60 сек, центрифугують при ≥ 14000 об/хв впродовж 1 хв при КТ, додають 10 мікролітрів РНКази А в лізат, інкубують при 65 °C впродовж 10 хв, центрифугують впродовж 1 хв при КТ, додають 280 мкл Buffer SP2 і перемішують на вортексі, інкубують зразки на льоду впродовж 5 хв, центрифугують при ≥ 10000 об/хв впродовж 10 хв при КТ, переносять супернатант у колонку-гомогенізатор у 2 мл пробірці для збору зразків, центрифугують при 10000 об/хв впродовж 2 хв при КТ, переносять очищений лізат у 1,5 мл мікроцентрифужну пробірку, додають 1,5 об'єму Buffer SP3 до очищеного лізату, негайно перемішують на вортексі для отримання гомогенної суміші, переносять до 650 мкл супернатанту до колонки Hi-Bind, центрифугують при 10000 об/хв впродовж 1 хв, повторюють, застосовують 100 мкл 65 °C Elution Buffer до колонки, центрифугують при 10000 об/хв впродовж 5 хв при КТ. Секвенсори ДНК нового покоління, такі як 454-FLX (Roche, Бренфорд, штат Коннектікут), SOLiD (Applied Biosystems), а також Genome Analyzer (HiSeq2000, Illumina, Сан-Дієго, штат Каліфорнія) використовують, щоб забезпечити екстракцію з тканин рослини полінуклеотидної 17 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 послідовності ДНК та РНК. Первинні дані секвенування збирають у контиги. Послідовність контигів використовують для визначення тригерних молекул, які можуть застосовуватися до рослин, щоб дозволити регуляцію експресії генів. Послідовність ДНК-мішені виділяють із геномної (гДНК) та кодуючої ДНК (кДНК) з різних видів смітних рослин для гену HPPD, і зібрані контиги викладають у послідовності SEQ ID NO: 1-32 та в Таблиці 1. Приклад 2. Полінуклеотиди, що згідно винаходу належать до тригерних молекул Послідовності генів та фрагментів із Таблиці 1 розділяють на довжини по 200 полінуклеотидів (200-мер) з 25 полінуклеотидними областями, що перекриваються (SEQ ID NO:33-596). Ці полінуклеотиди випробують, щоб вибрати найбільш ефективні тригерні області по усій довжині будь-якої послідовності-мішені. Тригерні полінуклеотиди виконують у вигляді смислової або антисмислової олДНК або олРНК, длРНК або длДНК, або длДНК/РНК гібридів і об'єднують з агентом перенесення на кремнійорганічній основі, щоб забезпечити створення полінуклеотидного препарату. Полінуклеотиди об'єднують у набори з від двох до трьох полінуклеотидів у наборі, використовуючи по 4-8 нмоль кожного полінуклеотиду. Кожен набір полінуклеотидів готують з агентом перенесення і застосовують до рослини або поля рослин у комбінації з гербіцидом, що містить гліфосат, або з подальшою обробкою гліфосатом на перший-третій день після застосування полінуклеотиду, щоб визначити вплив на сприйнятливість рослини до гліфосату. Вплив визначають як затримку росту і/або знищення рослини та визначають на 8-14 день після обробки набором полінуклеотиду і гліфосатом. Виявляють найбільш ефективні набори і випробовують окремі полінуклеотиди тими ж способами, як і набори та виявляють окремий 200-мерний найбільш ефективний полінуклеотид. 200-мерну послідовність розділяють на дрібніші послідовності з 50-70-мерних областей із 10-15 полінуклеотидними областями, що перекриваються, і випробовують полінуклеотиди в індивідуальному порядку. Найбільш ефективний 50-70-мерний полінуклеотид додатково розділяють на дрібніші послідовності з 25-мерних областей із 12-13 полінуклеотидними областями, що перекриваються, і випробовують на ефективність у комбінації з обробкою інгібітором HPPD. За допомогою цього способу можна визначити олігонуклеотид або декілька олігонуклеотидів, які є найбільш ефективними тригерними молекулами для впливу на сприйнятливість рослини до гліфосату або на модуляцію експресії гену HPPD. Модуляцію експресії гену HPPD визначають за допомогою виявлення міРНК молекул HPPD, характерних для гену HPPD, або за допомогою вивчення зменшення кількості РНК-транскрипту HPPD, що виробляється, у порівнянні з необробленою рослиною, або за допомогою простого вивчення очікуваного фенотипу застосування тригеру з гербіцидом, що містить гліфосат. Виявити міРНК можна, наприклад, з використанням наборів, таких як mirVana (Ambion, Остін, штат Техас) і mirPremier (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, штат Міссурі). Послідовність ДНК-мішені, виділена з геномної (гДНК) та кодуючої ДНК (кДНК) з різних видів смітних рослин для гену HPPD, та зібрані контиги, представлені в послідовності SEQ ID NO: 132, розділяють на полінуклеотидні фрагменти, як представлено в SEQ ID NO: 33-596. Послідовності генів та фрагментів із Таблиці 1 порівнюють та виявляють 21-мерні безперервні полінуклеотиди з гомологією по усіх різних послідовностях гену HPPD. Мета полягає в тому, щоб визначити тригерні молекули, які застосовуються в якості гербіцидних молекул або в комбінації з гербіцидом, що є інгібітором HPPD, до широкого діапазону видів бур'янів. Послідовності SEQ ID NO: 597-1082 показують 21-мери, які присутні в гені HPPD щонайменше в шістьох видів бур'янів із Таблиці 1. Передбачається, що додаткові 21-мер можна обрати з послідовностей Таблиці 1, які є характерними для одного виду бур'янів або декількох видів бур'янів у межах роду, або тригерних молекул, які складаються із щонайменше 18 безперервних нуклеотидів, щонайменше 19 безперервних нуклеотидів, щонайменше 20 безперервних нуклеотидів або щонайменше 21 безперервних нуклеотидів у довжину і щонайменше на 85 відсотків ідентичні послідовності гену HPPD, обраній із групи, яка складається з SEQ ID NO: 1-32 або їх фрагменту. За допомогою цього способу можна визначити олігонуклеотид або декілька олігонуклеотидів, які є найбільш ефективними тригерними молекулами для впливу на сприйнятливість рослини до гліфосату або на модуляцію експресії гену HPPD. Модуляцію експресії гену HPPD визначають шляхом виявлення міРНК молекул HPPD, характерних для гену HPPD, або шляхом вивчення зменшення кількості РНК-транскрипту HPPD, що виробляється, у порівнянні з необробленою рослиною. Виявити міРНК можна, наприклад, з використанням наборів, таких як mirVana (Ambion, Остін, штат Техас) і mirPremier (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, штат Міссурі). 18 UA 116088 C2 5 10 15 20 Послідовність ДНК-мішені, виділена з геномної (гДНК) та кодуючої ДНК (кДНК) з різних видів смітних рослин для гену HPPD, та зібрані контиги, представлені в послідовності SEQ ID NO: 132, розділяють на фрагменти, як представлено в SEQ ID NO: 597-1082. Приклад 3. Способи, використовувані у винаході, які пов'язані з обробкою рослин або частин рослин сумішами тригерних молекул зовнішнього застосування. Рослини щириці Палмера (A. palmeri R-22), сприйнятливі до гліфосату, вирощують у теплиці (30 / 20 С денна/нічна температура (T); при довжині світлового дня в 14 годин) у 4 дюймових квадратних горщиках із земляною сумішшю Sun Gro® Redi-Earth та 3,5 кг/м3 добрива Osmocote® 14-14-14. Рослини щириці Палмера висотою від 5 до 10 см обробляють пулом із 8 коротких (21-22-мер) одноланцюгових антисмислових оліго ДНК полінуклеотидів (олДНК), спрямованих на HPPD, як показано в Таблиці 2 на прикладі HPPD_OLIGO1-8 (SEQ ID NO: 10831090, відповідно), при двох концентраціях, 16 нмоль та 80 нмоль, які додали до складу 10мілімолярного натрій-фосфатного буферу (рН 6,8), що містить 2 % сульфату амонію і 0,5 % Silwet L-77. Рослини обробляють вручну шляхом капання піпеткою по 10 мкл розчину полінуклеотиду на чотири повністю зрілих розкритих листа, усього використали 40 мкл розчину на одну рослину. Через двадцять чотири і сорок вісім годин рослини обробляють мезотріоном (Callisto®, 4 фунти аі на галон; інгібітор HPPD) при нормі внесення 13 грамів аі/га або атразіном (Aatrex® Nine-0®, 90 % аі у ваговому відношенні; інгібітор фотосистеми II) при нормі внесення 170 грамів аі/га із використанням самохідного розпилювача з плоскоструминним розпорошувальним наконечником 9501E, калібрований на 93 літри розчину на гектар. Також додають 1 % маслянистого концентрату, який знижує ушкодження рослин-мішеней при обробці гербіцидом (COC). Кожну обробку повторюють чотири рази. Висоту рослини виміряють безпосередньо перед обробкою олДНК та з інтервалом до дванадцяти днів після обробки гербіцидом для визначення ефективності обробок олігонуклеотидом та гербіцидом. 25 Таблиця 2 Олігонуклеотиди олДНК HPPD HPPD_OLIGO1 HPPD_OLIGO2 HPPD_OLIGO3 HPPD_OLIGO4 HPPD_OLIGO5 HPPD_OLIGO6 HPPD_OLIGO7 HPPD_OLIGO8 HPPD-T67 HPPD-T68 30 35 40 45 TCCGTAGCTTACATACCGAAG TCCAAGTGAATAGGAGAAACA AGCAGCTTCtgCGTCTTCTAC ACAGCACGCACGCCAAGACCG CGaTGTAAGGAATTTGGtAAA CGAGGGGATTGCAGCAGAAGA GTAGGAGaATacGGTGAAGTA GACCCCAAGaAAATCGTCTGC ATTGAGGAGTACGAGAAGACT CTTGAACGTAAACAGGTTCCA CTTCGGTATGTAAGCTACGGA TGTTTCTCCTATTCACTTGGA GTAGAAGACGcaGAAGCTGCT CGGTCTTGGCGTGCGTGCTGT TTTaCCAAATTCCTTACAtCG TCTTCTGCTGCAATCCCCTCG TACTTCACCgtATtCTCCTAC GCAGACGATTTtCTTGGGGTC AGTCTTCTCGTACTCCTCAAT TGGAACCTGTTTACGTTCAAG Результати обробки демонструють, що рослини, оброблені лише 16 нмоль та 80 нмоль олігонуклеотидів олДНК, спрямованих на HPPD, показують затримку росту в порівнянні з контрольними зразками, обробленими буфером на 35 відсотків та 46 відсотків, відповідно. Через чотири дні після обробки рослини, оброблені олДНК, а потім через 24 години мезотріоном або атразіном, показують більшу затримку росту, ніж рослини, які оброблені лише гербіцидом. Таким чином, рослини, оброблені олДНК при концентрації 16 нмоль і 80 нмоль, а потім мезотріоном, показують 77 і 75 відсоткове зниження росту, відповідно, у порівнянні з контрольними зразками, які оброблені буфером. Рослини, оброблені олДНК при концентрації 16 нмоль і 80 нмоль, а потім атразіном, показують 85 і 83 відсоткове зниження росту, відповідно, у порівнянні з контрольними зразками, які оброблені буфером. Дванадцять днів після обробки олДНК при 16 нмоль і 80 нмоль спостерігається 6 відсоткове і 20 відсоткове зниження росту рослин, а подальша обробка, яка включала мезотріон, показує зниження росту на 91 і 89 відсотків, у порівнянні зі зниженням росту контрольних зразків, оброблених лише мезотріоном, на 48 відсотків (Фіг. 1). Рослини, оброблені олДНК при 16 нмоль і 80 нмоль, а потім через 24 години атразіном, показують зниження росту на 50 і 74 відсотків, у порівнянні з 29 відсотковим зниженням при обробці лише атразіном. Таким чином, ефективність мезотріону і атразіну по відношенню до щириці Палмера може значно збільшитися при обробці рослин олДНК, які спрямовані на HPPD. У іншому аналогічному випробуванні випробовують два пули з 5 дволанцюгових олігонуклеотидів ДНК, пул 1, що містить HPPD-T67 (SEQ ID NO: 1091), HPPD-T68 (SEQ ID NO: 19 UA 116088 C2 5 10 15 20 25 30 1092) та OLIGO1-3 з Таблиці 2. Пул 2, що містить OLIGO 4-8 із Таблиці 2. Рослини обробляють із використанням 10 нмоль кожного олігонуклеотиду та обприскують Diruon (DCMU (3-(3,4дихлорфеніл)-1,1-диметилсечовини, Bayer), та вимірюють через 14 днів після обробки, щоб визначити вплив на ріст і розвиток рослин. Результати показують, що олігонуклеотиди підвищують сприйнятливість оброблених рослин до діурону до 22 відсотків. Приклад 4. Спосіб боротьби з бур'янами на полі. Спосіб для боротьби з бур'янами на полі включає використання тригерних полінуклеотидів, які можуть модулювати експресію гену HPPD в одному або декількох видах смітних рослинмішеней. Аналіз послідовностей гену HPPD із тринадцяти видів рослин забезпечив відбір 21мерних полінуклеотидів (SEQ ID NO: 597-1082), які можна використати в композиціях для впливу на ріст або розвиток, або для покращення сприйнятливості до гербіциду гліфосат, щоб контролювати безліч видів бур'янів на полі. Композиція, що містить 1 або 2, або 3, або 4, або більше полінуклеотидів (SEQ ID NO: 597-1082), забезпечить широкий спектр дій композиції відносно декількох видів бур'янів, які зустрічаються в середовищі поля. Спосіб включає створення композиції, яка містить компоненти, які включають щонайменше один полінуклеотид із SEQ ID NO: 597-1082 або будь-який інший полінуклеотид, що ефективно модулює експресію гену, практично ідентичний або практично комплементарний SEQ ID NO: 132 або їх фрагменту, агент перенесення, який мобілізує полінуклеотид у клітину рослини, і гербіцид, який інгібує HPPD, і необов'язково полінуклеотид, який модулює експресію основного гену, і необов'язково гербіцид із відмінним механізмом дії в порівнянні з інгібітором HPPD. Полінуклеотид композиції містить длРНК, олДНК або длДНК, або їх комбінацію. Робоча концентрація композиції, що містить полінуклеотид, може бути від близько 1 до 30 грамів на акр або більше залежно від розміру полінуклеотиду і кількості полінуклеотидів у композиції. Композиція може містити один або більше додаткових гербіцидів, кількість яких потрібна для забезпечення ефективної боротьби з бур'янами декількох видів. Поля культурних рослин, що потребують боротьби зі смітними рослинами, обробляють за допомогою розпилення композиції. Композиція може бути надана у вигляді бакової суміші, послідовної обробки компонентів (зазвичай полінуклеотидом, а потім гербіцидом), одночасної обробки або змішування одного або більше компонентів композиції з окремих контейнерів. Обробка поля може проводитися в міру необхідності для забезпечення боротьби з бур'янами, а компоненти композиції можна скорегувати для боротьби з конкретними видами бур'янів або сімействами бур'янів. Таблиця 1 Послідовності полінуклеотидів гену HPPD SEQ ID NO 1 Вид Тип Абутилон Теофраста кДНК Контиг Довжина Послідовність 713 TCCATAATCCAACGCAGACATTTCAGAGATTCATCCCCGAAG AAATCAAAAATCCCTCAACAAAATGATTCAGATATGCTTAAAC AAAATATGAATTGAGCACAATATCATATTTGACATTTATGTTGA AGTAGCAAAGGTTCGTATAGTTTATGTATGTGCAATTAAAACT AACAGTAACGGAATTCATTCTGACACTCCCTATATGCTGCTAG CAACTACCTCGATCTCTCAAGCCTCGACAACGGTGGTGGATT CTGTAGATTGTTTGGCTTCAAGAGACTTCTCGTATTCTTCAAT GGATTTGAAGAGCTCGGAAAAGTTGCCTTTCCCGAAACCTCC GCATCCTCCTTTCTGGTATTGCTTTCCTTCTTCATCCTTCACC ATGCACCCTAATCTCTGTATTATTTCTATGAATATCGTAGGCC TATCTCCAATGGGCTTAGTGAAAATCTGAAGCAGAGTGCCTT GATCATCTCTGTCAACCAAAATCCCCAACTCTTCACACTCCTT AATCTGCTCATCGCTCAAAATGTCCCCTGCCCTTTGCTTCAAT TTCTTATAGTAAGTGGGCGGCGGCGATGGCATGAACTCGAAA CCACCCACCAAACTTCTCTTCCTCATTTCTCTCAGCGTTCTGA ATATATCTTCACTCACCAGAGCCAAATGTTGAACCCCGGCAC CTTCGTTGTGTTCTAAATACGTTTGGATTT 20 UA 116088 C2 SEQID NO 2 Вид Тип Довжина Послідовність Щириця маскована кДНК Контиг 1234 3 Щириця гібридна кДНК Контиг 547 4 Щириця Палмера кДНК Контиг 1265 CTTCTTCCCCGTCTGAGTTTTTATTACTTCACTTTCTCTCTCAT CATCTAACATGGGAACTTTGAAACCCGAAACTCAACCCGACT CCGAATTCAAACTCGTGGGTTACTCCAACTTCATTCGGGTTAA CCCCAAATCTGACCGTTTTACTGTTAAGCGTTTCCATCATATA GAGTTCTGGTGTGGCGATGCAACCAATGTTAGCAGACGCTTT TCTTGGGGTCTTGGAATGCCTACCGTTGCTAAATCTGACCTTT CTACTGGAAACTCTGTTCACGCTTCTTTTCTTCTTCGTTCCGG TGACCTTTCTTTCCTCTTTACTTCACCTTACTCTCCTACCATGT CCATCCCTTCTTCTGCTGCAATCCCCTCGTTTGATTTCAATCA TTTTACCAAATTTGTTACATCGCACGGTCTTGGCGTGCGTGCT GTTGCCGTCGAAGTAGAAGACGCAGAAGCTGCTTTTAATATC AGCGTTTCGCACGGGGCTATCCCCTGTGTTTCTCCTATTCAC TTGGAAAACGGTGTCGTTTTATCTGAGGTTCATTTATATGGGG ATGTTGTGCTTCGTTATGTAAGCTACGGAAATGAATGTGGGG ATGTGTTTTTTCTTCCTGGGTTTGAGCAAATGCCCGAGGAATC CTCGTTTCGAGGACTTGATTTCGGCCTTCGAAGGTTGGATCA TGCTGTAGGGAATGTCCCTGAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTA TTTGAAGAAGTTTACTGGGTTTCATGAGTTTGCTGAGTTTACA GCTGAAGATGTTGGAACGAGTGAAAGTGGGTTGAATTCAGCC GTATTGGCAAATAATGATGAAATGGTGTTGTTTCCAATGAATG AACCTGTGTATGGGACAAAAAGGAAGAGTCAAATTCAAACTTA TTTGGAGCATAATGAAGGAGCTGGTGTACAACATTTGGCTTT GATGAGTGAAGATATATTTTGGACTTTAAGGGAGATGAGGAA GAGAAGTGGTCTTGGTGGGTTTGAGTTTATGCCGTCGCCGC CTCCGACTTATTACCGGAATTTGAGGAACAGAGCTGCTGATG TATTGAGTGAGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGG ATTTTGGTGGATAAAGATGATCAGGGTACTTTGCTTCAAATCT TCACTAAGCCTATTGGTGACAGGCCAACCATATTTATCGAGAT TATACAAAGAATCGGTTGCATGATGAAAGATGAAGACGGCAA G TCTTCCTGGGTTTGAGGAAATGCCGGAGGAATCGTCGTTTCG AGGACTTGATTTCGGCCTTCGAAGGTTGGATCATGCTGTAGG GAATGTTCCCGAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTATTTGAAGAA GTTTACTGGGTTTCATGAGTTTGCTGAGTTTACAGCTGAAGAT GTTGGGACGAGTGAAAGTGGGTTGAATTCAGCCGTATTGGCA AATAATGATGAAATGGTGTTGTTTCCAATGAATGAACCTGTGT ATGGGACAAAAAGGAAGAGCCAAATTCAAACTTATTTGGAGC ATAATGAAGGAGCTGGTGTACAACATTTGGCTTTGATGAGTG AAGATATATTTTGGACTTTAAGGGAGATGAGGAAGAGAAGTG GTCTTGGTGGGTTTGAGTTTATGCCGTCGCCGCCTCCGACTT ATTACCGGAATTTGAGGAATAGAGCTGCTGATGTATTGAGTG AGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATTTTGGTG GATAAAGATGATCAGGGTACTTTGCTTCAAATCTTCACTAAG AGATGTGTATAAGAGACAGGTCTTGGCGTGCGTGCTGTTGCC GTCGAAGTAGAAGACGCCGAAGCTGCTTTTAATATCAGCGTT TCGCACGGGGCTATCCCCTGTGTTTCTCCTATTCACTTGGAA AACGGTGTCGTTTTATCTGAGGTTCATTTATATGGGGATGTTG TGCTTCGGTATGTAAGCTACGGAAATGAATGTGGGGATGTGT TTTTCTTCCTGGGTTTGAGGAAATGCCGGAGGAATCATCGTTT CGAGGACTTGATTTTGGCATTCGAAGGTTGGATCATGCTGTA GGGAATGTCCCTGAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTATTTGAAG AAGTTTACTGGGTTTCATGAGTTTGCTGAGTTTACAGCTGAAG ATGTTGGGACGAGTGAAAGTGGATTGAATTCAGCCGTATTGG CAAACAATGATGAAATGGTGTTGTTTCCAATGAATGAACCTGT GTATGGGACAAAAAGGAAGAGCCAAATTCAAACTTATTTGGA GCATAATGAAGGAGCTGGTGTACAGCATTTGGCTTTGATGAG TGAAGACATATTTTGGACTTTAAGGGAGATGAGGAAGAGAAG TGGTCTTGGTGGGTTTGAGTTTATGCCGTCGCCGCCTCCGAC TTATTACCGGAATTTGAGGAACAGAGCTGCTGATGTATTGAGT GAGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATTTTGGT GGATAAAGATGATCAGGGTACTTTGCTTCAAATCTTCACCAAA CCTATTGGAGACAGGCCAACCATATTCATCGAGATTATCCAAA GAATTGGTTGCATGATGAAAGATGAAGACGGCAAGATGTACC AAAAGGGTGGTTGCGGAGGATTCGGAAAGGGAAACTTTTCA GAGCTGTTCAAATCAATAGAGGAGTACGAGAAGACTCTTGAA CGTAAACAGGTTCCAGATACAGCTGCTGCATGATGAGCAGAC TAAAATATTGTTGTCTTGCTGATGAAATGATAGAAAAGGTTTG TTTCTTGGTACAATGCTCAACTTCAAAATTTTCTTTATTAAATA ATGAAGTGTAAACTTATACAAACTGTGTCATATATGGTGATTG GTGATCATGGTTTATGTAGAATGTATAACATAATTGATAATCT GTGTATATGCTGAATACTTACATACTGTGAAATCATTCTGATG GAAACATACAATTGGTCAGTAGCTGAGGCTGGTAGCTCCTCA 21 UA 116088 C2 SEQ ID NO Вид Тип Довжина 5 Щириця Палмера гДНК Контиг 3245 Послідовність GATTAGTTTTTTTCAGTCAAAATCGTAGATGTATAT TTTTCTCTTTTATTTTTATCCAAAAATATCATGGGATGTCTAGA TTGGAATAATTAGGGAGTAAAAAGTACCCCTTGATTATGCAGA GCAAAAATAAATTGTCTGAATTTGAAATAAATATCTACAAGAGT AAATTTTTCCATCTTATTCAAAGGTAAATGTTTGATCCACCTAC CTCTATAGATATATTTCAGGGAACTAAATTGTCTTCACCATTAA ATTTGGTTACTTGGTCTTTAAAACCCAAATCATAGAAATTAATG ATAAAATCAAAATAAAAAAGATATTTAAATTCAAATTCAAACTA ACTAATTTTAAATTACAAAATGAATATCTGTAATTTACAAAAGA AAGTATCAAAAACATATGAAAATCTCAACATCTGAAAATTACAA ACAAGTATTCTGTTTTTTCATTTTTTTTTTCTTTTTCGCTATTTC CTTTCAAAAATAAAAGTAAATAAAAATATTCAAAAGCAATTCCA TAAACAAAATCTTAGATATGTAAATCACAAAAACATTAGATCTA GAAAAAAAAAATTTCTTCCATTGCAAACCCTTTTTCAACCTTCA TAACTTCCACTACCATAATGAGGCCAGTAAAGAGACAAAAGT CATTGAGTTGTTGTTGTGCAGTTGATGATAAATGATGATAGAA GGGTTTATTTTTTTTTTGAAATGAATGGTTAGATTTTCTGACTT TTTATTTACCCTATAATGAATATCAAACAATTAACTCTATAAATT ATTTAATACATTAAAATGTTTCATGTAATATGTCTCCTATATTAT TTACCCTTTAATTTTTAAGTGGGAACCAAGTATGTCTTAATTAT CTTTATTTTAATCAAATACGCGGTATACATGAAATAATCAACAA ATGCAATTACTATGCTCGGACGAGAGTAAATATAATGGGAGG AAGTTGTACATACAATTACGAAATAGTCTAAATAAATAACGATA ATTTGTAATATAAACAAACAAATCACACTTATATAAACAGATTT TATAGGGTGGAATCATTAGGATTCTAATTTATCTTTTTTCTTCT TTTGTTTACTTTGCTGATATTTATTTTGTATTTTTCCTATTTCTC AAAAGGAAGACTAACACTCAAATAAAATGATATTGAAATACAA AGCATCACCGGCCAAGCCGAGATGACGAAACTATTTTGAATA ATTATGATGATTTACAACTCCAAATAGAAGTAATTGATCAAGA CTTTAGGACTTGGAAGTGTTGGGCAAAATCTTCCAGAGTCCA GGATAAGTGATAAGTGACGTATTTCCGTTACTCTTAAGTGTTA ACAGCTTTTTGTCACGCAAGGAAAAGAAGACCGTGGACGTCA ACGATGACGTTGAATGTTCATCTTTACAGTCGCAGTCAATCAA TCTCTTTTTAGATCGATCTTCCACCTCAATTCTCCGTTACAAAT CAAATTCCATCTAGAACTTCTTTTTTATTATTTTGACTCATAAAT TCCCCCAAAAATACTTCTATTTTATTATAAATAAATTCCAATTT CTATGTTCTCCATTCATTACCACCCATTACTCCGTTTTCCAAA CCACCATTTTCTCTCTCCTCCTTTACCGCTAACGCTACCACCA TTTTCGCTTCTTCCCCGTCTGAATTTTATTACTTCGCTTTCTCT ATCATCATCTGACATGGGTACTTTGAAACCCGAAACTCAACCC GATTCCGAATTCAAACTCGTGGGTTACTCCAACTTCGTTCGG GTTAACCCCAAATCTGACCGTTTTGCTGTTAAGCGTTTCCACC ATATAGAGTTTTGGTGTGGCGATGCAACCAATGTTAGCAGAC GATTTTCTTGGGGTCTTGGAATGCCTACCGTTGCTAAATCTGA CCTTTCTACAGGAAACTCTGTTCACGCTTCTTTTCTTCTTCGTT CCGGTGACCTTTCTTTTCTCTTTACTTCACCTTACTCTCCTAC CATGTCCATCCCTTCTTCTGCTGCAATCCCCTCGTTTGATTTC AATCATTTTACCAAATTCCTTACATCGCACGGTCTTGGCGTGC GTGCTGTTGCCGTCGAAGTAGAAGACGCGGAAGCTGCTTTTA ACATCAGCGTTTCGCATGGGGCTATTCCCTGTGTTTCTCCTAT TCAATTGGAAAACGGTGTCGTTTTATCTGAGGTTCATTTATAT GGGGATGTTGTGCTTCGGTATGTAAGCTACGGAAATGAATGT GGGGATGTGTTTTTTCTTCCTGGGTTTGAGGAAATGCCGGAG GAATCATCGTTTCGAGGACTTGATTTTGGCATTCGAAGGTTG GATCATGCTGTAGGGAATGTCCCTGAGTTGGCTCCTGCAATT GCTTATTTGAAGAAGTTTACTGGGTTTCATGAGTTTGCTGAGT TTACAGCTGAAGATGTTGGGACGAGTGAAAGTGGATTGAATT CAGCCGTATTGGCAAACAATGATGAAATGGTGTTGTTTCCAAT GAATGAACCTGTGTATGGGACAAAAAGGAAGAGCCAAATTCA AACTTATTTGGAGCATAATGAAGGAGCTGGTGTACAGCATTT GGCTTTGATGAGTGAAGACATATTTTGGACTTTAAGGGAGAT GAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGTGGGTTTGAATTTATGCCGTC GCCGCCTCCGACTTATTACCGGAATTTGAGGAGCAGAGCTG CTGATGTATTGAGTGAGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAAGAGT TGGGGATTTTGGTGGATAAAGATGATCAGGGCACTTTGCTTC AAATCTTCACCAAACCTATTGGAGACAGGCCAACCATATTCAT CGAGATTATCCAAAGAATTGGTTGCATGATGAAAGATGAAGA CGGCAAGATGTACCAAAAGGGTGGTTGCGGAGGATTTGGAA AGGGAAACTTTTCAGAGTTGTTCAAATCAATTGAGGAGTACGA GAAGACTCTTGAACGTAAACAGGTTCCAGATACAGCTGCTGC ATGATGAGCAGACTGAAATATTGCTGTCTTGCTGGTGGAAGC CATATAATGGTAATATGATAGAAAAGGTTTGTTGCTCAAAATTT TCTTTATTAAATAATGAAGTGTAAACTTATACAAACTGTGTCAT 22 UA 116088 C2 SEQ ID NO 6 Вид Щириця Палмера Тип гДНК Контиг Довжина 3416 Послідовність ATATGGTGATTGATGATCATGCATGGTTATGTAGAATGTATAA CATAATTGATAATCTGTGTATATGCTGAAAACTTACATACTG TGAAATCATTCTGATAGAAACATACAATTGGTGAGTAGCTGTC TCTTATACACATCT GGAGGAATTTTTTTGTGCATGTAAAATGTTTTCTCTCTATTTTT TGATTTATGCTATTTTTTCTCTTTTATTTTTATCCAAAAATATCA TGGGATGTCTAGATTGGAATAATTAGGGAGTAAAAAGTACCC CTTGATTATGCAGAGCAAAAATAAATTGTCTGAATTTGAAATA AATATCTACAAGAGTAAATTTTTCCATCTTATTCAAAGGTAAAT GTTTGATCCACCTACCTCTATAGATATATTTCAGGGAACTAAA ATTGTCTTCACCATTATATTTAGTTACTTGGTCTTTAAAACCCA AATCATAGAAATTAACGATAAAATCAAAATATAAAGATATTTAA ATTCCAATTCAAACTAACTAATTTTAAATTACAAAATGAATATC TGTAATTTACAAAAGAAAGTATCAAAAACATATGAAAATCTCAA CATCTGAAAATTAAAAAACAAGTATTTTGTTTCTTCATTTTTTTC TTTTTCGCTATTTCCTTTCAAAAATAAAAGTAAATAAAAATATT CAAAAGCAATTCCATAAACAAAATCTTAGATATGTAAATCACA AAAACATTAGATCTAGAAAAAAAAAATTTCTTCCATTGCAAACC CTTTTTCAACCTTCATAACTTCCACTACCATAATGAGGCCAGT AAAGAGACAAAAGTCATTGAGTTGTTGTTGTGCAGTTGATGAT AAATGATGATAGAAGGGTTTATTTTTTTTTTGAAATGAATGGTT AGATTTTCTGACTTTTTATTTACCCTATATAGAATATCAAACAA TTAACTCTATAAATTATTTAATACATTAAAATGTTTCATGTAATA TGTCTCCTATATTATTTACCCTTTAATTTTTAAGTGGGAACCAA GTATGTCTTAATTATCTTTATTTTAATCAAATACGCGGTATACA TGAAATAATCAACAAATGCAATTACTATGCTCGGACGAGAGTA AATATAATGGGAGGAAGTTGTACATACAATTACGAAATAGTCT AAATAAATAACGATAATTTGTAATATAAACAAACAAATCACACT TATATAAACAGATTTTATAGGGTGGAATCATTAGGATTCTAATT TATCTTTTTTCTTCTTTTGTTTACTTTGCTGATATTTATTTTGTA TTTTTCCTATTTCTCAAAAGGAAGACTAACACTCAAATAAAATG ATATTGAAATACAAAGCATCACCAGCCAAGCCGAGATGACAA AACTATTGGCTAAGTGATAACTGATAAGTGACGTATTTCCGTT ACTCTCAAGTCTTAACAGCTTTTTGTCACGCAAGGAAAAGAAG ACCGTGGACGTCAACGGTGACGTTGAATGTTCATCTTTACAG TCGCAGTCAATCAATCTCTTTTTAGATCGATCTTCCACCTCAA TTCTCCGTTACAAATCAAATTCCATCTAGAACTTCTTTTTAATT ATTTTGACTCATAAATTCCCCCAAAAATACTTCTATTTTATTAT AAATAAATTCCAATTTCTATGTTCTCCATTCATCACCACCCATT ACTCCGTTTTCCAAACCACCATTTTCTCTCTCCTCCATTACCC CTAACACAACTACCATTTTCGCTTCTTCCCCGTCTGAGTCTTA TTACATCGCTTTCTCTCTCATCATCTGACATGGGAACTTTGAA ACCCGAAACTCAACCCGATTCCGAATTCAAACTCGTGGGTTA CTCCAACTTCGTTCGGGTTAACCCCAAATCTGACCGTTTTGCT GTTAAGCGTTTCCACCATATAGAGTTTTGGTGTGGCGATGCA ACCAATGTTAGCAGACGATTTTCTTGGGGTCTTGGAATGCCT ATCGTCGCTAAATCTGACCTGTCTACAGGAAACTCTGTTCAC GCTTCTTTTCTTCTTCGTTCCGGTGACCTTTCTTTTCTCTTTAC TTCACCGTATTCTCCTACCATGTCCATCCCTTCTTCTGCTGCA ATCCCCTCGTTTGATTTCAATCATTTTACCAAATTCCTTACATC GCACGGTCTTGGCGTGCGTGCTGTTGCCGTCGAAGTAGAAG ACGCCGAAGCTGCTTTTAATATCAGCGTTTCGCACGGGGCTA TCCCCTGTGTTTCTCCTATTCACTTGGAAAACGGTGTCGTTTT ATCTGAGGTTCATTTATATGGGGATGTTGTGCTTCGGTATGTA AGCTACGGAAATGAATGTGGGGATGTGTTTTTTCTTCCTGGG TTTGAGGAAATGCCGGAGGAATCATCGTTTCGAGGACTTGAT TTTGGCATTCGAAGGTTGGATCATGCTGTAGGGAATGTCCCT GAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTATTTGAAGAAGTTTACTGGGT TTCATGAGTTTGCTGAGTTTACAGCTGAAGATGTTGGGACGA GTGAAAGTGGATTGAATTCAGCCGTATTGGCAAACAATGATG AAATGGTGTTGTTTCCAATGAATGAACCTGTGTATGGGACAAA AAGGAAGAGCCAAATTCAAACTTATTTGGAGCATAATGAAGG AGCTGGTGTACAGCATTTGGCTTTGATGAGTGAAGACATATTT TGGACTTTAAGGGAGATGAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGTGG GTTTGAATTTATGCCGTCGCCGCCTCCGACTTATTACCGGAA TTTGAGGAGCAGAGCTGCTGATGTATTGAGTGAGGAGCAGAT GAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATTTTGGTGGATAAAGATGA TCAGGGCACTTTGCTTCAAATCTTCACCAAACCTATTGGAGAC AGGTAGATTTTAATCTTGCTTTCAATTGCTTTTGCTTGATTGAT TGACTAGCCAATTTTGATTGCATTTTGTTGCTTATATGACTTGA TGATAATAGATGGTTTACCTTTCTCAGCTGTTCATTTGTAGCC AGTATAGATTCGTTCTAAAATATTTGCAACTGATTATGACATGT AGTAGCAGAAAATGTCCCTATATTGGATGTTTGGCATAAATTA 23 UA 116088 C2 SEQ ID NO 7 Вид Щириця Палмера Тип гДНК Контиг Довжина 3818 Послідовність AGCTTGGTTTTGCACTTATCCTCATTTATTTATAAATTCTAAAA CTTGTTAGTTGTAATTAAGTTAATGAGAACAAAGCCTTAATATT CCTTCAAGGTGATTGTAGTTGGGGCACTAGTTCTAACAATGG AAATTTGGAAATCTATTCCAACTGGTCCCAAGTTAATCTTTGTT TGCAAGCCTGATTGGTTCAAATTAAGGTTATTGTATTCTTGTA TGAATTCGACTCAATGTAAATTTGTTTAATGGAGCATCAATTTT TAATAGTTTTCGACCAAGCAGTATTAGATATATTCGGGATTGA AATAATGCATCTATGAGTGTATAAAACCAAATGGCACATTTGA TTAGAATAAAAGAGAGTATAAGGCTAATTTCGTTTACCTAATAT TTAAAGCGACCCCTAAAATTCAATTGGCCTAAACCCATAAAGT TCAAA GAGTTCAAGATTAAAAGTTAAATTACATTTATGTGGGTTTTATA TAGGCAATGATTGCATTATATTGTTTTTCTTTTGGTGGGAAGA TTTTCCTTTTTAAAAAATTTTAATTTCCCTACATTTTCAAATGAT GGAGGAATTTTTTTGTGCATGTAAAATGTTTTCTCTCTATTTTT TGATTTATGCTATTTTTTCTCTTTTATTTTTATCCAAAAATATCA TGGGATGTCTAGATTGGAATAATTAGGGAGTAAAAAGTACCC CTTGATTATGCAGAGCAAAAATAAATTGTCTGAATTTGAAATA AATATCTACAAGAGTAAATTTTTCCATCTTATTCAAAGGTAAAT GTTTGATCCACCTACCTCTATAGATATATTTCAGGGAACTAAA TTGTCTTCACCATTAAATTTGGTTACTTGGTCTTTAAAACCCAA ATCATAGAAATTAATGATAAAATCAAAATAAAAAAGATATTTAA ATTCAAATTCAAACTAACTAATTTTAAATTACAAAATGAATATC TGTAATTTACAAAAGAAAGTATCAAAAACATATGAAAATCTCAA CATCTGAAAATTAAAAAACAAGTATTTTGTTTCTTCATTTTTTTC TTTTTCGCTATTTCCTTTCAAAAATAAAAGTAAATAAAAATATT CAAAAGCAATTCCATAAACAAAATCTTAGATATGTAAATCACA AAAACATTAGATCTAGAAAAAAAAAATTTCTTCCATTGCAAACC CTTTTTCAACCTTCATAACTTCCACTACCATAATGAGGCCAGT AAAGAGACAAAAGTCATTGAGTTGTTGTTGTGCAGTTGATGAT AAATGATGATAGAAGGGTTTATTTTTTTTTTGAAATGAATGGTT AGATTTTCTGACTTTTTATTTACCCTATATAGAATATCAAACAA TTAACTCTATAAATTATTTAATACATTAAAATGTTTCATGTAATA TGTCTCCTATATTATTTACCCTTTAATTTTTAAGTGGGAACCAA GTATGTCTTAATTATCTTTATTTTAATCAAATACGCGGTATACA TGAAATAATCAACAAATGCAATTACTATGCTCGGACGAGAGTA AATATAATGGGAGGAAGTTGTACATACAATTACGAAATAGTCT AAATAAATAACGATAATTTGTAATATAAACAAACAAATCACACT TATATAAACAGATTTTATAGGGTGGAATCATTAGGATTCTAATT TATCTTTTTTCTTCTTTTGTTTACTTTGCTGATATTTATTTTGTA TTTTTCCTATTTCTCAAAAGGAAGACTAACACTCAAATAAAATG ATATTGAAATACAAAGCATCACCAGCCAAGCCGAGATGACAA AACTATTGGCTAAGTGATAACTGATAAGTGACGTATTTCCGTT ACTCTCAAGTCTTAACAGCTTTTTGTCACGCAAGGAAAAGAAG ACCGTGGACGTCAACGGTGACGTTGAATGTTCATCTTTACAG TCGCAGTCAATCAATCTCTTTTTAGATCGATCTTCCACCTCAA TTCTCCGTTACAAATCAAATTCCATCTAGAACTTCTTTTTTATT ATTTTGACTCATAAATTCCCCCAAAAATACTTCTATTTTATTAT AAATAAATTCCAATTTCTATGTTCTCCATTCATTACCACCCATT ACTCCGTTTTCCAAACCACCATTTTCTCTCTCCTCCTTTACCG CTAACGCTACCACCATTTTCGCTTCTTCCCCGTCTGAATTTTA TTACTTCGCTTTCTCTATCATCATCTGACATGGGAACTTTAAAA CCCGAAACTCAACCCGATTCCGAATTCAAACTCGTGGGTTAC TCCAACTTCGTCCGGGTTAACCCCAAATCTGACCGTTTTGCT GTTAAGCGTTTCCACCATATAGAGTTTTGGTGTGGCGATGCA ACCAATGTTAGCAGACGATTTTCTTGGGGTCTTGGAATGCCT ACCGTCGCTAAATCTGACCTGTCTACAGGAAACTCTGTTCAC GCTTCTTTTCTTCTTAGTTCCGGTGACCTTTCTTTTCTCTTTAC TTCACCTTACTCTCCTACCATGTCCATCCCTTCTTCTGCTGCA ATCCCCTCGTTTGATTTCAATCATTTTACCAAATTCCTTACATC GCACGGTCTTGGCGTGCGTGCTGTTGCCGTCGAAGTAGAAG ACGCAGAAGCTGCTTTTAATATCAGCGTTTCGCACGGGGCTA TCCCCTGTGTTTCTCCTATTCACTTGGAAAACGGTGTCGTTTT ATCTGAGGTTCATTTATATGGGGATGTTGTGCTTCGGTATGTA AGCTACGGAAATGAATGTGGGGATGTGTTTTTTCTTCCTGGG TTTGAGGAAATGCCGGAGGAATCATCGTTTCGAGGACTTGAT TTTGGCATTCGAAGGTTGGATCATGCTGTAGGGAATGTCCCT GAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTATTTGAAGAAGTTTACTGGGT TTCATGAGTTTGCTGAGTTTACAGCTGAAGATGTTGGGACGA GTGAAAGTGGGTTGAATTCAGCCGTATTGGCAAACAATGATG AAATGGTGTTGTTTCCGATGAATGAACCTGTGTATGGGACAA AAAGGAAGAGCCAAATTCAAACTTATTTGGAGCATAATGAAG GAGCTGGTGTACAGCATTTGGCTTTGATGAGTGAAGACATAT 24 UA 116088 C2 SEQ ID NO Вид Тип Довжина 8 Щириця смітна кДНК Контиг 775 9 Щириця смітна кДНК Контиг 1204 Послідовність TTTGGACTTTAAGGGAGATGAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGTG GGTTTGAGTTTATGCCGTCGCCGCCTCCGACTTATTACCGGA ATTTGAGGAACAGAGCTGCTGATGTATTGAGTGAGGAGCAGA TGAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATTTTGGTGGATAAAGATG ATCAGGGCACTTTGCTTCAAATCTTCACCAAACCTATTGGAGA CAGGTAGATTTTAATCTTGCTTTCAATTGCTTTTGCTTGATGG ATTGACTAGCCAATTTGATTGCATTTTGTTGCTTATATGACTTG ATGCTAGATAGTTTACCTTTCTCAGCTGTTAAGTTGTAGCAAG TATCTAATACATTCGTTCTGAAATATCTGAAATATTTGCAACTG ATTATGACATGTAGCGGGAGAAAATGTCCGTTTGGCATAAATT AAGCTTGGTTTTGCACTTATCCTCATTTATTTATAAATTCTAAA ACTTGTTAGTTGTAAGCTCCTTTCAGTTGTCCTGAATTTAATTA AGTTAATGAGAACAAAGCCTTAATATTCCTTCAAGGTGATTGT AGTTGGGGCACTAGTTCTAACAATGGAAATTTGGAAATCTATT CCAACTGGTCCCAAGTTAATCTTTGTTTGCAAGCCTGATTGGT TCAAATTAAGGTTATTGTATTCTTGTATGAATTCGACTCAATGT AAATTTGTTTAATGGAGTATCAATTTTTAATAGTTTTCAACCAA GTAGTATTAGATATATTCGGGATTGAAATAATGCATCTATGAG TGTACAAAACCAAATGGCACATTTGATTAGAATAAAAGAGAGT ATAAGGCTAATTTCGTTTACCTAATATTTAAAGCGACCCCTAA AATTCAATTGGCCTAAACCCATAAAGTTCAAAAGCAGAGAAGA ACATAGAATAGTGCAGGTCCATTGGTAATGCACTAGGAGTTG GAGCTTTTATGGGTACAAGTGTGTGGCTAGTTGGGGATGACT GTCTAGCATTGTCTAGGTGAAAAGCTGAAGCCTTAAGCCATG AAGGTTTTGAGTAGAGGTGTTCATTTGGGTCATCGGGTTGAT TTCGGGTCAGATGTTTCGGGTCGGTTTAAAATCGGGTTTTGT GTTCACATTGGTTTTTACGTAATT AAATGAATGTGGGGATGTGTTTTTTCTTCCTGGGTTTGAGGAA ATGCCGGAGGAATCATCGTTTCGAGGACTTGATTTCGGCCTT CGAAGGTTGGATCATGCTGTAGGGAATGTCCCTGAGTTGGCT CCTGCAATTGCTTATTTGAAGAAGTTTACTGGGTTTCATGAGT TTGCTGAGTTTACAGCTGAAGATGTTGGGACGAGTGAAAGTG GGTTGAATTCAGCCGTATTGGCAAATAATGATGAAATGGTGTT GTTTCCAATGAATGAACCAGTGTATGGGACAAAAAGGAAGAG TCAAATTCAAACTTATTTGGAGCATAATGAAGGAGCTGGTGTA CAACATTTGGCTTTGATGAGTGAAGATATATTCTGGACTTTAA GGGAGATGAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGTGGGTTTGAGTTT ATGCCGTCGCCGCCTCCGACTTATTACCGGAATTTGAGGAAC AGAGCTGCTGATGTATTGAGTGAGGAGCAGATGAAGGAGTG TGAAGAGTTGGGGATTTTGGTGGATAAAGATGATCAGGGTAC TTTGCTTCAAATCTTCACCAAACCTATTGGAGACAGGCCAACT ATATTTATCGAGATCATCCAAAGAATTGGTTGCATGATGAAAG ATGAAGACGGCAAGATGTACCAAAAGGGTGGTTGCGGAGGA TTTGGAAAGGGAAACTTTTCGGAGCTTTTCAAATCAATTGAGG AGTACGAGAAGACTCTTGAACGTAAACAGGTTCCAGATACAG CTGCTGCATGAGTT CTTACATCGCACGGTCTTGGTGTGCGTGCTGTTGCTGTCGAA GTAGAGGACGCAGAAGCTGCTTTTAATATCAGCGTTTCCAAC GGGGCTATTCCCTGTGTTTCTCCTATTCAATTGGAAAACGGT GTCGTTTTATCTGAGGTTCATTTATATGGGGATGTTGTGCTTC GCTATGTAAGCTACGGAAATGAACGTGGGGATGTGTTTTTTC TTCCTGGGTTTGAGGAAATGCCGGAGGAATCGTCGTTTCGAG GACTTGATTTCGGCCTTCGAAGGTTGGATCATGCTGTAGGGA ATGTTCCCGAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTATTTGAAGAAGTT TACTGGGTTTCATGAGTTTGCTGAGTTTACAGCTGAAGATGTT GGGACGAGTGAAAGTGGGTTGAATTCAGCCGTATTGGCAAAT AATGATGAAATGGTGTTGTTTCCAATGAATGAACCTGTGTATG GGACAAAAAGGAAGAGTCAAATTCAAACTTATTTGGAGCATAA TGAAGGAGCTGGTGTACAACATTTGGCTTTGATGAGTGAAGA TATATTTTGGACTTTAAGGGAGATGAGGAAGAGAAGTGGTCT TGGTGGGTTTGAGTTTATGCCGTCGCCGCCTCCGACTTATTA CCGGAATTTGAGGAATAGAGCTGCTGATGTATTGAGTGAGGA GCAGATGAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATTTTGGTGGATAA AGATGATCAGGGTACTTTGCTTCAAATCTTCACTAAGCCTATT GGTGACAGGCCAACTATATTTATCGAGATCATCCAAAGAATTG GTTGCATGATGAAAGATGAAGACGGCAAGATGTACCAAAAGG GTGGTTGCGGAGGATTTGGAAAGGGAAACTTTTCGGAGCTTT TCAAATCAATTGAGGAGTATGAGAAGACTCTTGAACGTAAACA GGTTCCAGATACAGCTGCTGCATGAGCAGACTAAAATATTGC TGAAACGCAGGCTGCAGCCATATGTTAGAACAGTCATTCTGA TGGAAACACTCAAGCGGTGAGTAGCTGAGGTTGGTGATGCT GAAGTCGAGTCGGTATTTGGATCATCTTACAATTACAGTGCAA GGATAGTAATGAAGCATGTAAACAGCTCCTCAGATTAGTTTTT 25 UA 116088 C2 SEQ ID NO Вид Тип Довжина 10 Щириця смітна гДНК Контиг 511 11 Щириця смітна гДНК Контиг 770 12 Щириця смітна гДНК Контиг 1412 13 Щириця Тунберга кДНК Контиг 707 Послідовність TCCAGTCATAATCGTAGATGTATATGAGAAAATTTAAATTGCT CTTTTAAGTTAATGAAAA TCATCAACAACAAAAGAGTTGAAATTCTAATAATAATCCCAGT AAGCAGTGAGTAAGATCAAATGGAGAGTCAGTTAGTAGCTAA TCATACAAAACCATTAAAGCTACAAAGTTACTCTAATTTCTTAA GATCAAACCCAAAATCTGATCGTTTCAAAGTGAAAAGGTTCCA CCACATTGAGTTCTGGTGTGGTGATGCAACCAACACTAGCCT TTTATTTTCGTTAGGGCTTGGCATGCCTATGGTTGCCAAATCC GATCTCTCCACAGGCAACCTTATACATGCCTCCTACGTCTTAC GTAGTGGCGAACTTTGTTTCGTATTCACGGCTCCTTACTCTCC GTCATCCATGCTCACAACTGCATCAATTCCTTCGTTTGACTAC AGTGCGCACGCCTCTTTTGTGTCCTGTCATGGCCTTGGTGTT CGCGCTGTGGCCCTTGAGGTGGAGAACGCTGAATCCGCCTT TAGGATTAGTGTTGCAGCAGGAGCTCATCCGTCAGCCCCACC AATCATTTTACCAAATTCCTTACATCGCACGGTCTTGGCGTGC GTGCTGTTGCTGTCGAAGTAGAAGACGCAGAAGCTGCTTTTA ATATCAGCGTTTCCAACGGGGCTATTCCCTGTGTTTCTCCTAT TCACTTGGAAAACGGTGTCGTTTTATCTGAGGTTCATTTATAT GGGGATGTTGTGCTTCGGTATGTAAGCTACGGAAATGAATGT GGGGATGTGTTTTTTCTTCCTGGGTTTGAGGAAATGCCGGAG GAATCATCGTTTCGAGGACTAGATTTCGGCCTTCGAAGGTTG GATCATGCTGTAGGGAATGTCCCTGAGTTGGCTCCTGCAATT GCTTATTTGAAGAAGTTTACTGGGTTTCATGAGTTTGCTGAGT TTACAGCTGAAGATGTTGGGACGAGTGAAAGTGGGTTGAATT CAGCCGTATTGGCAAATAATGATGAAATGGTGTTGTTTCCAAT GAATGAACCAGTGTATGGGACAAAAAGGAAGAGTCAAATTCA AACTTATTTGGAGCATAATGAAGGAGCTGGTGTACAACATTTG GCTTTGATGAGTGAAGATATATTCTGGACTTTAAGGGAGATGA GGAAGAGAAGTGGTCTTGGTGGGTTTGAGTTTATGCCGTCGC CGCCTCCGACTTATTACCGGAATTTGAGGAACAGAGCTGCTG ATGTATTGAGTGAGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAAGAGTTG GGGATTTTGGTGGATAAAGATGATCAGGGTACTTTGCTTCAA ATCTTCAC ACCACCATTTTCGTTTCTTCCCCGTCTGAGTTTTATTACTTCAC TTTCTCTCTCATCATCTGACATGGGAACTTTGAAACCCGAAAA TCAACCCGATTCCGAATTCAAACTCGTGGGTTACTCCAACTTT GTTCGGGTTAACCCCAAATCTGACCGTTTTACTGTTAAGCGTT TCCATCATATAGAGTTTTGGTGTGGCGACGCAACCAATGTTA GCAGACGATTTTCTTGGGGTCTTGGAATGCCTACCGTCGCTA AATCTGACCTTTCTACGGGAAACTCTGTTCACGCTTCTTTTCT TCTTCGTTCCGGTGACCTTTCTTTCCTTACTTCACCTTACTCC CCTACCATGTCCATCCCTTCTTCTGCTGCAATCCCCTCGTTTG ATTTCAATCATTTTACCAAATTCCTTACATCGCACGGTCTTGG CGTGCGTGCTGTTGCTGTCGAAGTAGAAGACGCAGAAGCTG CTTTTAATATCAGCGTTTCCAACGGGGCTATTCCCTGTGTTTC TCCTATTCACTTGGAAAACGGTGTCGTTTTATCTGAGGTTCAT TTATATGGGGATGTTGTGCTTCGGTATGTAAGCTACGGAAAT GAATGTGGGGATGTGTTTTTTCTTCCTGGGTTTGAGGAAATG CCGGAGGAATCTTCGTTTCGAGGACTTGATTTCGGCCTTCGA AGGTTGGATCATGCTGTAGGGAATGTCCCTGAGTTGGCTCCT GCAATTGCTTATTTGAAGAAGTTTACTGGGTTTCATGAGTTTG CTGAGTTTACAGCTGAAGATGTTGGGACGAGTGAAAGTGGGT TGAATTCAGCCGTATTGGCAAATAATGATGAAATGGTGTTGTT TCCAATGAATGAACCAGTGTATGGGACAAAAAGGAAGAGTCA AATTCAAACTTATTTGGAGCATAATGAAGGAGCTGGTGTACAA CATTTGGCTTTGATGAGTGAAGATATATTCTGGACTTTAAGGG AGATGAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGTGGGTTTGAGTTTATGC CGTCGCCGCCTCCGACTTATTACCGGAATTTGAGGAACAGAG CTGCTGATGTATTGAGTGAGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAA GAGTTGGGGATTTTGGTGGATAAAGATGATCAGGGTACTTTG CTTCAAATCTTCACCAAACCTATTGGAGACAGGTAGTTTTTAA TCTTGCTTTCAATTGCTTTTGATTAATTGATTGATTAGCCAATT TGATGATTGCATTTTGTTGCTTGTATGACTTGATGATATATGG TTTACCTTTTCTCAGCTGTTCAGTTGTAGCAAGTATTTCTAATC CGTTCTGAAATACTCCATTCGCAACTGATTGTGACATGTTGTG CAGAAAATTATGGAAAATGAGAAAATGTCCCTATATTGGAAGA TTGGT CCCGAGTTGGCTCCTGCAATTGCTTATTTGAAGAAGTTTACTG GGTTTCATGAGTTTGCTGAGTTTACAGCTGAAGATGTTGGGA CGAGTGAAAGTGGGTTGAATTCAGCCGTATTGGCAAATAATG ATGAAATGGTGTTGTTTCCAATGAATGAACCTGTGTATGGGAC AAAAAGGAAGAGCCAAATTCAAACTTATTTGGAGCATAATGAA GGAGCTGGTGTACAACATTTGGCTTTGATGAGTGAAGATATA 26 UA 116088 C2 SEQ ID NO Вид Тип Довжина 14 Щириця зелена кДНК Контиг 1267 15 Амброзія трьохроздільна кДНК Контиг 637 16 Амброзія трьохроздільна кДНК Контиг 718 Послідовність TTTTGGACTTTAAGGGAGATGAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGT GGGTTTGAGTTTATGCCGTCGCCGCCTCCGACTTATTACCGG AATTTGAGGAATAGAGCTGCTGATGTATTGAGTGAGGAGCAG ATGAAGGAGTGTGAAGAGTTGGGGATTTTGGTGGATAAAGAT GATCAGGGTACTTTGCTTCAAATCTTCACTAAGCCTATTGGTG ACAGGCCAACCATATTTATCGAGATTATCCAAAGAATTGGATG CATGATGAAAGATGAGGACGGCAAGATGTACCAAAAGGGTG GTTGTGGAGGATTTGGAAAGGGAAACTTTTCGGAGCTGTTCA AATCAATTGAGGAGTATGAGAAGACTCTTGAACGTAAACAGG TTCCAGATACAGCTGCTGCATGAGCAGACTAAAATATTGCTG AAACGCAGGCTGCAGCCATATGTTAGAACAG AACCACCATTTTCTCTCTCCTCCATTACCACTAACACTCCCAC CATTTTCGTTTCTTCCCCGTCTGAGTCTTATTACTTCGCTTTCT CTCACATCATCTGACATGGGAACTTTGAAACCCGAAACTCAG CCCGATTCCGAATTCAAACTCGTGGGATACTCCAACTTCGTT CGGGTTAACCCCAAATCTGACCGTTTTACTGTTAAGCGTTTTC ATCATATAGAGTTTTGGTGTGGCGATGCAACCAATGTTAGCA GACGATTTTCTTGGGGTCTTGGAATGCCTACCGTTGCTAAAT CTGACCTTTCTACTGGAAACTCTGTTCACGCTTCTTTTCTTCTT CGTTCCGGTGACCTTTCTTTTCTCTTTACTTCACCTTACTCTC CTACCATGTCCGTCCCTTCTTCTGCTGCAATCCCCTCGTTTGA TTTCAATCATTTTACCAAATTCCTTACATCGCACGGTCTTGGT GTGCGTGCTGTTGCTGTCGAAGTAGAAGACGCAGAAGCTGC TTTTAATATCAGCGTTTCCAACGGGGCTATTCCCTGTGTTTCT CCTATTCAATTGGAAAACGGTGTCGTTTTATCTGAGGTTCATT TATATGGGGATGTTGTGCTTCGGTATGTAAGCTACGGAAATG AATGTGGGGATGTGTTTTTCTTCCTGGGTTTGAGGAAATGCC GGAGGAATCGTCGTTTCGAGGACTTGATTTCGGCCTTCGAAG GTTGGATCATGCTGTAGGGAATGTTCCCGAGTTGGCTCCTGC AATTGCTTATTTGAAAAAGTTTACTGGGTTTCATGAGTTTGCT GAGTTTACAGCTGAAGATGTTGGGACGAGTGAAAGTGGGTTG AATTCAGCCGTATTGGCAAATAATGATGAAATGGTGTTGTTTC CAATGAATGAACCTGTGTATGGGACAAAAAGGAAGAGCCAAA TTCAAACTTATTTGGAGCATAATGAAGGAGCTGGTGTACAACA TTTGGCTTTGATGAGTGAAGATATATTTTGGACTTTAAGGGAG ATGAGGAAGAGAAGTGGTCTTGGTGGGTTTGAGTTTATGCCG TCGCCGCCTCCGACTTATTACCGGAATTTGAGGAATAGAGCT GCTGATGTATTGAGTGAGGAGCAGATGAAGGAGTGTGAAGA GTTGGGGATTTTGGTTGACAGAGATGATCAAGGCACTCTGCT TCAAATTTTCACTAAGCCCATTGGAGATAGGCCTACGATATTC ATAGAAATAATACAGAGATTAGGGTGCATGGTGAA CCGGTTTACGGGACGAAGAGGAAGAGTCAGATACAGACATAT TTGGAACATAATGAAGGGGCAGGGGTGCAGCATTTGGCGTT GGCGAGTGAGGATATATTTAGGACATTGAGGGAGATGAGGA AAAGGAGTGGGGTGGGTGGGTTTGAGTTTATGCCATCTCCG CCGCCTACTTATTATCGGAATTTGAAGAACAGGGCGGGCGAT GTGTTGTCGGATGAGCAGATTAAGGAGTGTGAGGAGTTGGG GATATTGGTGGATAAGGATGATCAGGGGACTTTGCTTCAGAT TTTTACCAAGCCTGTTGGTGATAGGCCGACGATATTCATAGA GATAATTCAGAGAGTAGGATGTATGATGAAGGATGAAGAAGG AAAGGTGCAGCAGAAGGCGGGCTGTGGAGGATTTGGTAAAG GGAACTTTTCGGAGCTTTTTAAATCGATTGAGGAATATGAAAA GACACTGGAAGCAAGAACCTGAAGCCACATGAAAACCACACA CAAATAATCTTTCATGAGATTTTAAAATCTAATGATTATGCATC TGTGGATTCTATACAACAAACAGATCCTGAAAATATAGGATAT CAACTTTACAATAAGTTATGTAATATGCATCTCATGATTATCAA TGTATT TACCTCACAAACCCAATCCTCCATACTTCCGTGTTCTCTACTA CTGTTCCACTTTATTAATCTTACCCAACCCCTTCTCATCTATTT CCCCCCTACCTCACAAACATAACCCAAATAAAAAATAAAATTA AAATAAAAAATAAAATGGAACTGAACCCACCCTCGTTGACCCC GTCGTCGCCGGAGACAACTCCGACCACTCCAACCACCCCAT CTCCGCCTTCAAGCTAGTCGGCTTCAAAAACTTCATCCGTAA CAACCCTAAGTCCGACAAATTCTCCGTCAAATCCTTCCACCAC ATCGAGTTCTGGTGCTCCGACGCCACCAACGCCGCCCGTCG CTTCTCATGGGGTCTCGGCATGCCTATTACTTACAAATCCGA CCTTTCTACCGGTAACCATACCCACGCCTCTTATCTCCTTAAC TCCGGCCACCTTAACTTCCTCTTCACCGCCCCTTATTCCCCC ACCATCTCCACCACCACCACCACCGCCTCCATCCCGTCGTTC TCCCACTCCGCCTGCCGTCACTTCACCGCCTCCCACGGCCTT GCTGTCCGTGCCATCGCCGTTGAAGTTCAAGACGCTGAAATC GCTTTCTCCGTTAGTGTCGCTAACGGCGCTAAACCCTCATCT CCACCTATCACCCTTGGCCACGACGACGTCGTTTTGTCAGAA 27 UA 116088 C2 SEQ ID NO Вид Тип Довжина 17 Амброзія трьохроздільна Амброзія трьохроздільна гДНК Контиг 54 гДНК Контиг 719 19 Амброзія трьохроздільна гДНК Контиг 845 20 Амброзія трьохроздільна гДНК Контиг 1024 21 Злинка канадська кДНК Контиг 1610 18 Послідовність GTTCAACTCTACGGTGACGTCGTTTTACGTTATATTAGTTA CTCCGAGGCGTTTTGGGTCCAAAATCCGAAGCGCGGGGCTT AAAGCGCGAGGCG CTTCATGTAGTTCAGCGCTTTTTGGCAAAAAAAGCGTTTTTCT TGGAGCCTTGTGCCTCAAACGCTTAAAGTGCGCCCCAGGCG AGCTTTTTTAAACCAAGGAACACGCACAAGCACTCCACCAATA GTTCAATGCCGTGCTAACCAGTGGGATTAACTAGTGGAAGCT GGATTCAAACATGCTAGAGTGGAAATATATTTTTTTTAATGTTT GGATATGCATATTTAACCATTATAGCATAATATTAATGACAAG GGTTGTAAATTGGTATGCAAATTGTTTGAGCAGGCCGACGAT ATTCATAGAGATAATTCAGAGAGTAGGATGTATGATGAAGGAT GATGAAGGAAAGGTGCAGCAGAAGGCGGGTTGTGGAGGATT TGGTAAAGGGAACTTTTCGGAGCTTTTTAAATCGATTGAGGAA TATGAAAAGACACTGGAAGCAAGAACCTGAAGCCACATGAAA ACCACACAAATAATCTTTAATGAGATCTTAAAATCTAATGATTA TGCATCTGTGGATTCTATACAACAAACAGATCCTGAAAATATA GGATATCAACTTTACAATAAGTTATGTAATATGCATCTCATGAT TATCAATGTATTAATTTATTTTTATGTTGCTGTTTTCGGTTTAGT TTTTGTTCGTTGGTGTTGGGCCGGCTCTTCTTCTATTTCGTTC TTGATCCATTTGAAGTTGAAGGCGAAATTTAGG GCAGTTGAGCTCTACGGCTCACTGAAACAGACCTTTAAACCA TGAACAAGGTTTATGTGTAGGTAAACTAACTTTGGACCAAAAA GCTGTTTTTTTAACCTTCACAATTTGTTTCATGGAAGGTTTTCC TTTTTGTTCAGTTGACATGTTTCTAAACGGGACAAATAAACAT ACATCTATGCCTATTGCACATATAGCATCAACCACCTCACTCC CATGTGGCCCTCACAACAAGGTTGTAAAAATCGGGACTAGTC GCCGACTAGTCCCCGATAAATCGGTGATCGGAGGTCTACTGA TTAATTTTTCATTAATCACTCAATTAGTCGGAATCGGCCCAAG CCGGTCCAAGCCGGCCAAAGTCGGCCGAAGTCGGAGCTAGT CGCCAAAGAATTCCGTTTGAAGTTGGCTTAAAAACATGCTTTC ATCCCACAAACTGATCCATTACCCCAAAAAACCAAAGTTAAAA ACCTGACCTGGATCCCTAAATGCTTCATAATCCGGCAAACCTT TCTGTTCCGGCGAACCTTTCTGTTTCCGGCGACCCATTTGGA GCAGGTGGAGTTGGTTTTGTTCAGTCTTTTGCGGCGTATAAT GAAAGTGGTAGTGAGTAGGGTTTTTAAGTTTGGATCTTTTTAT ATTTAACCCCTTATAGTTTTACTAGTTTATATTTTGTCCCTTAA CTTATATATTTATACATAATAAGCATAAAGTTAATGTTATATATA TACAAATTAACCCTCTACATCTTTACTAGTCTATATTTGGTCCT CTAACTTATACATCTATACAAAAAAAGCATAAAATTAATGTTAT ATATATATAAATTTATAAAATTATACATA TCGTCGTTTCAGGAGCTGGATTACGGTATCCGGCGGCTAGAT CACGCTGTGGGGAACGTACCGGAGTTAGCACCAGCAGTGGA ATATATAAAATCGTTTACCGGGTTTCACGAGTTTGCTGAGTTT ACAGCAGAGGATGTGGGAACGAGTGAGAGTGGACTCAACTC GGTGGTGTTGGCTTGCAATAGTGAGATGGTATTAATACCTCT GAATGAGCCGGTTTACGGGACGAAGAGGAAGAGTCAGATAC AGACATATTTGGAACATAATGAAGGGGCAGGGGTGCAGCATT TGGCGTTGGCGAGTGAGGATATATTTAGGACATTGAGGGAGA TGAGGAAAAGGAGTGGGGTGGGTGGGTTTGAGTTTATGCCG TCTCCGCCGCCTACTTATTATCGGAATTTGAAGAATAGGGCG GGCGATGTGTTGTCGGATGAGCAGATTAAGGAGTGTGAGGA GTTGGGGATATTGGTGGATAAGGATGATCAGGGGACTTTGCT TCAGATTTTTACCAAGCCTGTTGGTGATAGGTATTGTTTTTCG TTAATGTAGCGTTACTTGAATTCGTAATTATGTGTTTAAACTTT AAACTAGATAGTATTAAGGCTTATGCAATATGTATTGTTCCCC TAGAGGACGAGGGTTCTAGACTCTAGTTCCGTAATGTAGTGA TAAAGGTGTAGATTAAGAGTAGGATTAGCGGGTGTGTTAGTT AGCGGTTTTAACAAGAAAAACACATAATATGTTGAAAGAACAA TAACAAGAATGGCAAACATAAAAAAGGAAAAGCCATAAAGGTT GTCATTCTATAATTTGCTTGCATTCAAGATTCTTACTAGGATTG TATTATTATGTGGTTACTAAACTCTATTCAAGTATAAAAACATG AAACCCCTTCACATAAGGAAAAAGAAATATGTATGTTTTAAAA TGGATCATCTTTTCCCTTGTGTCACGATTGCCAATGTTTTTTTT GTTGACCATGAGAACCGTTGGTGAACACGCCTTGGTTTAAAA AAGCGCG TATGGTATTGCATTGTTTCATTCAATTGTACATAATCCACAAAT ACATATGGTGATAATCATGTTCTTTGAGTCAAGAAGATATAAA CATTATACATAGGCAGTTTTCATGCAGTGGCAGTTGGTTCAGT GGTGTTTCGTGCTTCCAGCGTCTTCTCGTATTCTTCAATAGAT TTGAAGAGCTCTGAGAAATTGCCCTTGCCAAATCCTCCACAG CCTGGCTTCTGTTGCACCTTGCCTTCATCATCTTTCAGCATAC ACCCTACTCTCTGAATAATCTCTATGAATATAGTTGGCCTATC ACCAACAGGCTTGGTGAAAATCTGAAGCAAAGTTCCCTGATC 28