Спосіб ідентифікації антитіл до бруцельозу у молоці великої рогатої худоби

Винахід відноситься до молочної промисловості, а саме до мікробіологічного аналізу молока імуноферментним методом для ідентифікації антитіл до бруцельозу у молоці великої рогатої худоби. Бруцельоз - хронічно протікаюча хвороба тварин і людини, що викликається бактеріями, з'єднаними під загальною назвою Brucella. Від хворих кіз, овець, великої рогатої худоби і свиней можуть заражатися всі види тварин і людина. Основне джерело інфекції - хворі тварини, від яких бруцелли виділяються при аборті з плодом і матковими виділеннями, з послідом, молоком, сечею і калом. Бруцельоз є зоонозом. Від хворої людини здоровому бруцелли не передаються. Хоча до бруцельозу чутливі деякі дикі тварини (зайці, північні олені), природних осередків інфекції не спостерігається. Резервуаром і джерелом інфекції є домашні тварини (вівці, кози, корови, свині, рідше собаки). Бруцельоз широко розповсюдженний в багатьох країнах світу, особливо в тих, де розвинене тваринництво. Зараження людини від хворих тварин відбувається контактним, аліментарним і аерогенним шляхами. Зараження контактним шляхом особливо часто відбувається при попаданні на шкіру навколоплідної рідини. Часто заражаються ветеринарні працівники, телятники, вівчарі і ін. Зараження може наступити і при контакті з м'ясом інфікованих тварин, з гноєм. Бруцелли проникають через щонайменші пошкодження шкіри. Аліментарне зараження часто відбувається через сире молоко, а також при вживанні молочних продуктів (бринза, сири, масло), аерогенне зараження може наступити при попаданні в дихальні шляхи пилу (в місцях випасу і в загородах для утримання овець), що містить, бруцелли, а також в лабораторіях при порушенні техніки безпеки. Відомий метод мікробіологічного аналізу молока та молочних продуктів, в якому досліджують молочну сироватку відомими бактерологічними методами /1/. Недоліком цього способу є те, що він мало надійний. Відсоток вірогідності результату аналізу становить біля 70%. В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб ідентифікації збудника бруцельозу у молоці шляхом застосуванням нового набору реагентів та вибору режимів їх використання, що дозволяло би підвищити універсальність використання способу ідентифікації личинок бруцел у молоці та підвищити вірогідність способу. Поставлена задача вирішується у способі ідентифікації антитіл до бруцельозу у молоці великої рогатої худоби, в якому досліджують сироватку молока, відповідно до винаходу, дослідження ведуть імуноферментним методом в якому вносять до планшету підготовлені негативний контроль та позитивний контроль молочної сироватки на бруцельоз, інкубують її, промивають планшет і вносять до нього імунопероксидазний кон'югант на основі моноклональних антитіл та інкубують, після інкубації планшет промивають і вносять туди розчин проявника та інкубують, при цьому як проявник використовують хромоген - ортофенілендіамін або хромоген - тетраметилбензидин, зупиняють кольорову реакцію стоп-реагентом і визначають оптичну густину в лунках у двохвильовому режимі. Підготовка зразків сироваток молока великої рогатої худоби. Свіжевідібране молоко піддають центрифугуванню при 1500об/хв. Протягом 10 хвилин для отримання молочної сироватки. Центрифужні стаканчики залишають при 4±2°С протягом 30 хвилин, після чого проводять відбір молочної сироватки з під шару сливок. Молочну сироватку використовують для постановки аналізу. Зразки молочної сироватки довгостроково зберігають в замороженому стані. Процес розморожування зразків сироватки повинен бути не більше 2 разів Приклад виконання способу на стриптовому планшеті. Готують розчин для промивання 12-5см3. Вміст флакона концентрату розчина інтенсивно струшують і розводять у 350см3 очищеної води та перемішують. Якщо концентрат розчину кристалізований, його нагрівають перед застосуванням при 35-37°С до повного розчинення кристалів. Розчин можна зберігати при температурі від 2 до 8°С не довше 5 діб. Виймають імуносорбент з пакувального пакету та вносять в усі лунки по 0,35см3 цього розчину, витримують стрипи залитими 30-40 секунд і видаляють розчин з лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. В кожну лунку вносять по 0,095см3 розчину для розведення сироваток. В лунки планшету вносять по 0,005см3 зразків досліджуваних сироваток, залишивши вільними 5 лунок першого ряду (лунки для контролів). В дві лунки (А1, В1) вносять по 0,005см3 позитивного контролю (К+), а в три інші (01-Е1) - по 0,005см3 негативного контролю (К-). Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при і температурі 37°С 60 хвилин. По закінченні інкубації видаляють вміст лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки чотири рази розчином №1, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. Приготування розчину кон'югату. В ампулу з кон'югатом вносять 0,3-0,4мл розчину для розведення кон'югату. Розчин кон'югату готують безпосередньо перед використанням. Приготування розчину проявника. В чистий флакон пінцетом вносять таблетку або хромогену ортофенілендіамін (ОФД) і додають 9см3 очищеної води, інтенсивно струшують і залишають флакон у темному місці до повного розчинення хромогену або використовують розчин хромогену тетраметилендіамін (ТМБ). Безпосередньо перед внесенням у лунки стрипів у флакон з розчином для приготування проявника додають розчин хромогену, суміш інтенсивно струшують. Розчин готують безпосередньо перед використанням. В лунки стрипів вносять по 0,1см3 розчину кон'югату. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при 37°С у термостаті 30 хвилин. По закінченні інкубації видаляють розчин кон'юганту з лунок за допомогою промивача або 8-канальної піпетки та промивають лунки шість разів розчином, після чого позбавляються зайвої вологи, постукуючи планшетом по фільтрувальному паперу. Вносять в лунки стрипів по 0,1см3 розчину проявника. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при 18-22°С в темному місці до 30 хвилин. Зупиняють кольорову реакцію внесенням до всіх лунок по 0,05см3 розчину стоп-реагенту. Не більше як через 1 хвилину після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (492нм відносно 620нм). Облік результатів аналізу. Розраховують середнє значення оптичної густини (ОГ) для лунок негативного контролю (ОГ К-) і для позитивного контролю (ОГ К+). Проведення аналізу вважають коректним, якщо ОГ К- не вище 0,1 оптичної одиниці (00), а ОГ К+ не нижче 0,6 00. Якщо одне з трьох значень ОГ К- більше 0,1 00 або більше ніж в два рази перевищує ОГ К-, його відкидають та ОГ К- розраховують за рештою значень ОГ К-. Граничне значення ОГ (ГЗ). ГЗ розраховують, додаючи константну для кожної серії наборів величину до значення ОГ К-. "Сіра зона" - зона значень ОГ, яка простягається від ГЗ до значень менших ГЗ на 10%. Результати аналізу вважаються негативними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка менше рівня ОГ "сірої зони". Результати аналізу вважаються позитивними, якщо значення ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ. Зразки, які мають значення ОГ в межах "сірої зони", вважаються невизначеними. Зразки, що, дали позитивний або невизначений результат, необхідно досліджувати повторно не менш як у двох лунках системи. Зразки, позитивні в одній або більше лунках, слід вважати позитивними. Зразки, негативні в двох або більше лунках, слід вважати негативними. В разі отримання позитивного або невизначеного результату у випадку дослідження пулів сироваток необхідно переставити кожний зразок сироватки окремо в розрахунку один зразок - одна лунка. Для автоматичного обліку результатів аналізу застосовують обчислювальну програму. Література 1. ГОСТ 9225 - 84, Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа, М., Стандарт. 1985.