Спосіб діагностики ph’ лейкемій за допомогою специфічних праймерів

Споаб діагностики Ph' лейкемій за допомогою специфічних праймерів, що включає операції отримання зразка крові хворого, приготування реакційної суміші для синтезу кДНК, яка містить РНК, ВІДПОВІДНИЙ праймер, зворотну транскриптазу МMLV (GibcoBRL), РНазін і dNTP та буфер для зворотної транскриптази, проведення синтезу при температурі +36,8 +37,2°С протягом 50-70 хвилин, використання аліквоти реакційної суміші для проведення ампліфікації, при цьому на першому етапі проводять серію циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням ВІДПОВІДНИХ праймерів при заданому температурному режимі синтезу, далі проводять другий етап полімеразної ланцюгової реакції з використанням ВІДПОВІДНИХ праймерів при заданому температурному режимі, а продукти ампліфікації аналізують у агарозному гелі і прогнозують подальший перебіг захворювання, який відрізняється тим, що як праймери під час приготування реакційної суміші для синтезу кДНК використовують, ВІДПОВІДНО, праймери Phl-f (5GTCTTCCTGTTCACCGAGCTG-31) та Phl-r (5іGCTTAGAGTGTTATCTCCACTGGC-31), а на другому етапі полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери Ph-f (5і1 CTGCAAATGGTACATTCCGCTCAC-3 ) та Ph-r (51AACGAGCGGCTTCACTCAGACC-31) Пропонована корисна модель відноситься до медицини, а більш конкретно - до засобів діагностики лейкемії Згадані засоби застосовують у повсякденній практиці Вони включають дослідження таких цитологічних критеріїв, як форма та розмір клітин, характер зернистості цитоплазми, ядерноцитоплазматичне співвідношення, структура ядра, а також доповнюються використанням протоколів для детекції характерної генномної перебудови за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з специфічними праймерами Згадані протоколи можуть бути застосовані в КЛІНІЧНІЙ гематології для детекції наявності гібридного bcr/abl у хворих на мієлопроферативні захворювання в тих випадках, коли стандартні протоколи не засвідчують наявності bcr/abl перебудови Методи діагностики лейкемій, які застосовують у повсякденній практиці, включають використання простих цитологічних критеріїв, таких як форма та розмір клітин, характер зернистості цитоплазми, ядерно-цитоплазматичне співвідношення, структура ядра тощо Ці методи доповнюються також циТОХІМІЧНИМИ методами (визначення активності кислої фосфатази, мієлопероксидази, PAS реакція) [1] На підставі результатів, що дають ці методи, можна встановити діагноз у більшості пацієнтів Для уточнення природи конкретного лейкемічного клону необхідне імунофенотипування та цитогенетичний аналіз Використання моноклональних антитіл, імунофлуоресцентних та імуноферментних методів дозволяє більш точно встановлювати рідкісні форми та варіанти лейкемій і, таким чином, застосовувати ВІДПОВІДНІ протоколи лікування [2, 3] Хромосомні транслокацп виявляють при більшості неоплазій людини і, переважно, саме вони зумовлюють один чи декілька етапів пухлинного розвитку У зв'язку з цим результати цитогенетичного аналізу, під час якого виявляють характерні аномалії (транслокацп, інверсії, делеци тощо) шляхом диференційного забарвлення хромосом, мають самостійне діагностичне і прогностичне значення [4, 6] Першим подібним маркером пухлинного росту була маленька G-забарвлена хромосома, описана в 1960р і названа філадельфійською (Ph) [7] Утворення даної хромосоми обумовлене реципрокною транслокацією між 9 і 22 хромосомами t ю CD CO о> 10385 (9:22) (q34: q11) [8]. її виявили приблизно у 95% хворих на хронічну гранулоцитарну лейкемію, а також у 25-30% дорослих та 2-10% дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) [9]. На молекулярному рівні утворення філадельфійскої хромосоми супроводжується утворенням нового злитого bcr/abl гена (представленого на 5і- кінці ділянкою гена bcr, а на З'-кінці -ділянкою гена abl [10]). Як показали численні експерименти, саме продукт транскрипції гена bcr/abl є головним етіологічним моментом у розвитку Ph' лейкемії. Наявність цього гена в клітинах крові та кісткового мозку дозволяє виявляти Ph' хромосому методами молекулярної біології. На сьогодні молекулярно-біологічні методи включають методи з використанням геномних зондів [11; 12], полімеразної ланцюговою реакції [13; 14], флюоресценцію in situ гібридизацію (FISH) [15], "PCR in cell" [16] тощо. Найбільш близьким до пропонованого способу за кількістю суттєвих ознак є відомий спосіб діагностики Ph1 лейкемій за допомогою специфічних праймерів, який включає операції отримання зразка крові хворого, приготування реакційної суміші для синтезу «ДНК, яка містить РНК, відповідний праймер, зворотну транскиптазу M-MLV (GibcoBRL), РНазін, і dNTP та буфер для зворотної транскриптази, проведення синтезу при температурі +36,8...37,2°С протягом 50-70 хвилин, використання аліквоти реакційної суміші для проведення ампліфікації, при цьому на першому етапі проводять серію циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі синтезу, далі проводять другий етап полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі, а продукти ампліфікації аналізують у агарозному гелі і прогнозують подальший перебіг захворювання [Г.Д. Телегеєв, М.В. Дибков, М.В. Божко, Н.М.Третяк, С.С.Малюта Молекулярно-біологічна діагностика неопластичних захворювань крові // Цитология и генетика, 1998, Т.32, N1,C.71-78.]. Недолік описаного способу полягає в недостатній достовірності отриманих результатів діагностики, зокрема, у хворих на мієлопрофілеративні захворювання. Це викликано тим, що праймери, які використовують у згаданому способі, не враховують факту високої нестабільності пухлинного генному. Це в деяких випадках призводить до неможливості отримання позитивної ланцюгової реакції при наявності характерної геномної перебудови (bcr/abl). В основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення такого методу діагностики, який би підвищив достовірність отриманих результатів діагностики у хворих на мієлопрофілеративні захворювання за рахунок створення умов для зменшення негативних моментів полімеразноі ланцюгової реакції шляхом врахування нестабільності пухлинного геному. Поставлена задача вирішується у пропонованому способі, який, як і відомий спосіб діагностики Ph' лейкемій за допомогою специфічних праймерів, який включає операції отримання зразка крові хворого, приготування реакційної суміші для синтезу кДНК, яка містить РНК, відповідний праймер, зворотну транскиптазу M-MLV (GibcoBRL), РНазін, і dNTP та буфер для зворотної транскриптази, проведення синтезу при температурі +36,8...37,2°С протягом 50-70 хвилин, використання аліквоти реакційної суміші для проведення ампліфікації, при цьому на першому етапі проводять серію циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі синтезу, далі проводять другий етап полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі, а продукти ампліфікації аналізують у агарозному гелі і прогнозують подальший перебіг захворювання, а, відповідно до пропозиції, як праймери під час приготування реакційної суміші для синтезу кДНК використовують, відповідно, праймери Phl-f (5іGTCTTCCTGTTCACCGAGCTG-3') та Phl-r (5іGCTTAGAGTGTTATCTCCACTGGC-31), а на другому етапі полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери Ph-f (5і1 CTGCAAATGGTACATTCCGCTCAC-3 ) та Ph-r (S1AACGAGCGGCTTCACTCAGACC-31). Використання пропонованого способу з праймерами Phl-f, Phl-r, Ph-f, Ph-r дає можливість підвищити достовірність отриманих результатів діагностики у хворих на мієлопрофілеративні захворювання за рахунок створення умов для зменшення негативних моментів полімеразної ланцюгової реакції і врахування факту високої нестабільності пухлинного генному та отримання позитивної ланцюгової реакції при наявності характерної геномної перебудови (bcr/abl). Використовували зразки крові хворих, які лікувалися в гематологічних клініках м. Києва. РНК отримували за відомою методикою [17]. Реакційна суміш для синтезу кДНК містила 1-5мкг РНК, 10 рМ праймера А1 (5'-TGATTATAGCCTAAGACCCGGA3'), 20 од. зворотної транскиптази M-MLV (GibcoBRL), 10-20 од. РНазіну, ІмМ dNTP, буфер для зворотної транскриптази. Загальний об'єм суміші склав 40мкл. Синтез проводили при 37°С протягом 1 год. Аліквоти реакційної суміші (5-10 мкл) використовували для проведення ампліфікації. На першому етапі проводили ЗО циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймерів Phl-f та Phl-r в об'ємі ЗО мкл, за умов, що рекомендовані фірмою-виготовлювачем Taqполімерази. Температурний режим синтезу: 94°С 18 сек, 55°С - 18сек, 72°С- 1хв. Далі проводили другий етап ПЛР з використанням праймерів Ph-i та Ph-r 94°C - 24 сек, 58°С -18 сек, 72°С - 1 хв. Продукти ампліфікації аналізували в 3% агарозному гелі. Полімеразна ланцюгова редакція застосовується для отримання значної кількості певних ділянок молекули ДНК. Це досягається проведенням декількох (до 40) циклів, кожен з яких складається із стадії денатурації, стадії віджигу та стадії синтезу. На стадії синтезу відбувається копіювання ДНК ланцюга (на ділянці, обмеженій спеціально підібраними праймерами) термостабільним ферментом. У нашому випадку напрацьовували ділянку 10385 гібридного гена bcr/abl. У зв'язку з тим,що розрив у генах bcr та abl відбувається на значних за розміром ділянках, це робить проблематичним застосуванням ДНК в полімеразній ланцюговій реакції, тому в діагностиці використовують дослідження РНК, яка має значно менший розмір. Через те ПЛР розпочинали з отримання ДНК копії (кДНК), яку синтезували за допомогою зворотної транскриптази, використовуючи РНК як матрицю і праймер А1 як затравку. Перший етап ПЛР, що проводили з використанням праймерів Phl-f та Phl-r, не дав необхідної для візуального виявлення в агарозному гелі такої кількості продукту. Тому проводили другий етап ПЛР, використовуючи аліквоту ПЛР продукту з першого етапу та інші (внутрішні) праймери Ph-f та Ph-r. Приклад 1. Отримана електрофореграма продукту ПЛР при дослідженні крові хворого К. Хворий 1956 р.н., ліквідатор аварії на ЧАЕС. Вперше на прийомі в травні 1999 року, в гемограмі з 1992р. - нейтрофільний лейкоцитоз з тенденцією до зростання. Аналіз крові 7.07.1999р.: Ер - 5x10", НЬ - 143 г/л, L - 11,4x109, є - 2%, п - 5%, с - 66%, л-18%, м - 10%, ШОЕ - 12мм/год. Наступний аналіз крові 31.08.2000 р.: Ер - 5x10 12 , НЬ-168г/л, тр - 250x10 9 , L - 18,9x10й, є - 2%, п - 7%, с - 64%, л - 20%, м 7%, ШОЕ -7мм/год. Стаціонарне лікування проводили з 5.09.2000 р. по 19.09.2000 р. При надходжені: скарги за загальну слабкість, болі в суглобах. Об'єктивно: шкіра чиста, печінка та селезінка не збільшені. Аналіз крові 6.09.2000 p.: Ер 5,3x1012, НЬ - 176г/л, тр - 275x10 9 , L - 15.7x109, Є 2%, п - 7%, с - 66%, л-16%, м - 9%, ШОЕ - 1 мм/год. Дослідження кісткового мозку: бласти - 2,0%, нейтроф., пром - 0,5%, мієл -8,5%, п -24%, с 27,5%, еоз - 0,5%, л - 10,5%, м - 2,0%, пл. кл -1,5%, еритробл - 0,5%, нормоцити баз. -1,5%, нормоцити поліхр. 4,5%, нормоцити кс. - 8,0%. При цитохімічному дослідженні лужної фосфатази нейтрофілів не виявили. Біохімічний аналіз крові 6.09.2000 р. незначне підвищення тимолової проби, інші показники в нормі. УЗД: печінка та селезінка - не збільшені. Невизначеність клінічної картини обумовило проведення тесту на наявність Ph' хромосоми. Використання стандартного набору праймерів (В1, А1, В2, A3) не виявило bcr/abl -перебудову. При проведенні аналізу крові методом ПЛР з використанням праймерів, що згадані у пропонованому способі, виявили фрагмент гену bcr/abl розміром 530 п.н. На підставі цього поставили діагноз: хронічна мієлоїдна лейкемія (XMJU, вперше виявлена, початкова стадія. Приклад 2 Аналіз крові хворого Є. (гостра лімфобластна лейкемія L2, не Т-клітинний варіант, 1 гострий період) проводили з використанням на першому раунді праймерів Phi-i та Phl-r, а на другому - праймерів ВЗ та А2. Виявлено перебудований фрагмент гену bcr/abl розміром 200 п.н. Виходячи з результату аналізу, було поставлено діагноз Phпозитивна лейкемія та скориговано протоколи лікування. Приклад З Також аналогічно проводили аналіз крові хво рого П. з підозрою на ХМЛ. Використання розроблених (Phl-f, Phl-r, Ph-f, Ph-r) та стандартних праймерів (В1, А1, В2, A3) не виявило bcr/abl перебудови, що визначило подальшу тактику лікування хворого. Ці дані свідчать про високу ефективність пропонованого способу у діагностиці хворих з невизначеним діагнозом. Використання пропонованого способу дає змогу виявляти мінімальну кількість патологічних клітин (10-4-10-5), що дозволяє проводити ранню діагностику. Даний метод дозволяє прогнозувати подальший перебіг захворювання, оцінювати цитогенетичну ремісію та ефективність лікування. Таким чином, пропонований спосіб, у якому використовують праймери Phl-f (511 GTCTTCCTGTTCACCGAGCTG-3 ) та Phl-r (5 і GCTTAGAGTGTTATCTCCACTGGC-31), а на другому етапі полімеразної ланцюгової реакції праймери Ph-f (S'-CTGCAAATGGTACATTCCGCTCAC3і) та Ph-r (5'-AACGAGCGGCTTCACTCAGACC-3'), дає змогу детектувати наявність гібридного bcr/abl гена у випадку, коли стандартний набір праймерів не дозволяє це зробити. Література: І.Бутенко ЗА., Глузман Д.Ф., Зак К.П. и др. Цитохимия и електронная микроскопия клеток крови и кроветворных органов //Киев, Наукова Думка, 1074,244с. 2.Глузман Д.Ф., Бебешко В.Г., Надгорная В.А. и др. Эмбриональное кроветворение и гемобластозы у детей. // Киев, Наукрва Думка, 1988,200с. 3. Пинчук В.Г., Глузман Д.Ф., Надгорная В.А. и др. Иммуноцитохимические методы и моноклональные антитела в онкогематологии // Киев, Наукова Думка, 1990,233 с. 4.Boehm, Т.Н. Rabbits A chromosomal basis of lymphoid malignancy in man // E.J.Biochem, 1989V.185.P.1-17. 5. M.J. Cline The molecular basis ofleukemia // The New England Journal of Medicine, 1994.V.330,N5.-P.328-336. 6. Т.Н. Rabbits Chromosomal translocations in human cancer //Nature, 1994.- V.372, N.6502-P.143149. 7. Nowell PC, Hunderford DA. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia // Science I960.- V.I 32, P. 1497-1499. 8. Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining//Nature- 1973.-V.243, N5405-P.290-293. 9. Телегеев Г.Д., Дыбков М.В., Карпенко О.И., Черепенко Е.И. Молекулярные основы Phлейкемий и пути их лечения Биополимеры и клетка 1994; 10(5):78-92. 10. Gishizky ML. Molecular mechanisms of BcrAbl-induced oncogenesis // Cytokines Molular Therapy 1996-V2, N4. - P.251-261. 11. E.M. Southern Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electroforesis. / / J . Mol.Biol.-1975- V.98, N.3- P.503517. 12. G. Grosveld, T. Verwoerd, T van Agthoven et al. The chronic myelocytic cell line К 562 contains a breakpoint in bcr and produces a chimeric bcr/c-abl 10385 transcript // Molecular and Cellular Biology, 1986VAN2.-P.607-616. 13. E.S. Kawasaki, S.S. Clark, M.Y. Coyne et al Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by deletion of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988. - V.85, N15.-P.5698-5702. 14. Maurer J., Janssen J., Thiel E., et al. Deletion oi chimeric BCR-ABL genes in acute lymphoblastic leukemia by the polymerase chain reaction // The Lancet-1991.-V.337, N 8749.-P. 1055-1058. 15. Tkachuk D.C., Westbrook C.A., AndreeffM., Комп'ютерна верстка Д. Дорошенко 8 et al. Detection of bcr-АЫ fusion in chronic myelogenous leukemia by in situ hybridization // Science -1990 - V.250, N.4980, P.559-562 16. N.Teston, G-Martinelli, P.Farabedoh et al. A new method of "/n-cell reverse transciptasepolymerase chain reaction" for detection of Bcr/abl transcripts in chronic myeloid leukemia patients. // Blood- 1996.-V.87, N.9 - P.3 884-3 892. 17. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Analyt. Biochem. -1987. -V.I 62, P. 156-159. Підписне Тираж 26 прим Міністерство освгги і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ-42, 01601