Штаммбактерій васіllus сіrсulаns бт вкпм в-5622продуцент комплексу пектолітичних ферментів і ксіланази

Изобретение относится к отраслям микробиологической промышленности, производящим бактериальные и ферментные препараты и может быть использовано при получении препаратов для сельского хозяйства с целью их использования для профилактики и лечения крупного рогатого скота, повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, а также для использования при обработке масличного сырья для повышения выхода эфирного и растительных масел, для интенсификации мочки лубо-волокнистого сырья и силосования трудносилосуемых сельскохозяйственных культур, и для повышения выхода и получения экстрактивных и других ценных веществ из растительного сырья. Известен Cl. pectinoformentas штамм 15 - анаэробный продуцент мацерирующих ферментов, Предназначенный для применения в льноперерабатывающей промышленности (1). Cl. pectinoformentas 15 синтезирует в процессе глубинного культивирования экзо-пектаттрансэлиминазу, экзо-полигалактуроназу, пектинэстеразу и не синтезирует эндо-полигалактуназу и целлюлазу. Отсутствие у комплекса ферментов, образуемых Cl. pectinoformentas эндо-ферментов гидролитического и элиминативного действия снижает мацерирующий эффект препаратов, полученных из этой культуры. Известен штамм B. macerans ЦМПМ В-2692 - продуцент пектолитических ферментов, который в условиях глубинного культивирования образует комплекс мацерирующих ферментов, в том числе экзополигалактуроназу с активностью 5,0 ед/см3, пектат-трансэлиминазу с активностью 9000 ед/см3, эндополигалактуроназу с активностью 6,5 ед/см3. Максимальное содержание ферментов в культуральной жидкости достигается к 18-20 часу культивирования (2). Существенным недостатком указанного штамма является низкая активность эндо- и экзо-полигацактуроназ, а также отсутствие синтеза ксиланазы. Из литературных источников известно, что мацерирующий эффект максимально проявляется при сочетании комплекса ферментов: пектат-трансэлиминазы, экзо- и эндо-полигалактуроназы (1), Кроме того, в описании изобретения отсутствует такой важный показатель как титр клеток, что не дает возможности использовать штамм без проведения специальных исследований при получении бактериальных препаратов. Условия культивирования штамма B.macerans характеризуются узким диапазоном температуры и рН (оптимальная температура от 32 до 35°С, рН - 6,8-7,2). Нейтральная рН и невысокая температура культивирования создает возможные предпосылки для инициирования, что является отрицательным фактором при промышленном внедрении штамма. Область применения штамма Вас. macerans распространяется только на первичную обработку льна и грубых кормов, что охватывает более узкую зону применения по сравнению с применением заявляемого штамма. Известен Вас. circulans - шт. 31 ЦМПМ В-1741 - продуцент мацерирующих ферментов (4). Вас. circulans-31 является факультативным анаэробом, оптимальными условиями культивирования являются: рН среды 8,18,3; температура - (37-42)°С, время культивирования - 36 часов. Продуцент синтезирует комплекс пектолитических ферментов: пектат-трансэлиминазу от 2 до 10 ед/см3 эндо-полигалактуроназу - 25 ед/см3. Существенными недостатками штамма Вас. circulans - 31 являются: - низкая активность пектат - трансэлиминазы (ПТЭ); - не достаточно высокая активность эндо-полигалактуроназы (эндо-ПГ); - отсутствие синтеза зкзо-полигалактуроназы (экзо-ПГ) и ксиланазы; - длительный период культивирования продуцента. Отсутствие в описании изобретения такого важного показателя как накопление биомассы не дает возможности использовать продуцент без проведения специальных исследований по накоплению биомассы при получении ферментно-бактериальных и бактериальных препаратов. Наиболее близким прототипом к заявляемому штамму является способ получения пектаттрансэлиминазы (А.С. №1349250) заключающийся в культивировании факультативно-анаэробного продуцента Вас. circulans-31 в аэробных условиях при постепенном увеличении концентрации растворенного кислорода в питательной среде, при температуре 35-50°С и дозе спорового посевного материала 0,015-0,03% к объему питательной среды, при использовании в составе среды в составе питательной среды в качестве индукторов биосинтеза пектат-трансэлиминазы продуктов щелочной деградации пектина свекловичного жома, в результате достигается повышение синтеза ПТЭ до уровня 1300-1600 ед/см3, экзо-ПГ до 87-114 ед/см3, эндо-ПГ до 4-9 ед/см3, увеличение синтеза биомассы до 1,4 х 109. Целью настоящего изобретения является получение нового штамма факультативно-анаэробной бактерии Вас. circulans БТ ВКПМ В-5622 с повышенной способностью синтезировать комплекс пектолитических ферментов и накапливать биомассу, и обладающим более широким спектром синтезируемых ферментов, а также характеризующегося быстрым циклом роста. Предлагаемый штамм выделен в результате многократного рассева исходного штамма Вас. circulans шт. 31 ЦМПМ В-1741 и выделения многоспоровых вариантов. Полученный штамм Вас. circulans БТ подвергали проверке на ферментативную активность, накопление биомассы и скорость роста. Причем основным критерием отбора продуцента по ферментативной активности является синтез ПТЭ, как одного из ведущих ферментов, ответственных за мацерацию тканей. Полученный штамм имеет следующие морфологические и физиологические характеристики. Морфологические признаки. Вегетативные клетки прямые, подвижные палочки, величиной 2,0-4,5 х 0,9-1,0 мкм. На 6-12 часу роста образуются цепочки из 2-4 клеток. Граммположительны. Споры эллиптические, без экзоспориума, размером 1,6 х 1,2 мкм, расположены центрально. Культурально-биохимические и физиологические признаки; - на картофельном агаре колонии плоские, середина складчатая, края колонии неровные, блестящие; непрозрачные, на 3-й сутки роста вся поверхность колонии становится блестящей, размер колонии от 3-8 мм, цвет колонии бежевый; - МПА - колонии плоские, с выпуклой серединой, в центре матовые, края колонии неровные блестящие, непрозрачные, размер колонии 1-2 мм, цвет колонии от светло-бежевого до бежевого; - на сусле агаре колонии плоские, шероховатые (R-форма), матовые, середина колонии блестящая, шероховатая, края колонии неровные, матовые, непрозрачные, размер колонии от 3 до 15 мм, цвет колонии бежевый; - на агариэованном капустном отваре колонии плоские с более темной выпуклой серединой, края колонии зубчатые, непрозрачные, на 3-й сутки роста вся поверхность колонии становится блестящей, размер колонии 2-5 мм, цвет колонии от светло-бежевого до бежевого; - на среде Чапека с глюкозой колонии выпуклые, непрозрачные, неблестящие (Реформа), с сильно складчатой и выпуклой серединой, края колонии неровные, неблестящие, непрозрачные, размер колонии от 2 до 7 мм, цвет колонии от бежевого до бордового; - на среде Чапека с крахмалом колонии выпуклые, непрозрачные, неблестящие (R-форма), с сильно складчатой и выпуклой серединой, края колонии неровные, неблестящие, непрозрачные, размер колонии от 2 до 6 мм, цвет колонии розово-бежевый. По отношению к кислороду является факультативным анаэробом. Оптимальными условиями культивирования штамма являются: рН среды 7,8-8,6; температура 36-45°С, время культивирования в анаэробных условиях 10-18 часов, в условно-анаэробных 18-36 часов, минимальная температура роста -5°С, максимальная +54°С. Казеин разлагает. Крахмал гидролизует. Усваивает галактозу, глюкозу, глицерин, ксилозу, ксилит, инозит, мальтозу, маннит, рафинозу, сахарозу, фруктозу, целлобиозу. Не усваивает рамнозу, арабинозу, лактозу, дульцит. Нитраты восстанавливает. Мидол не продуцирует. Фенилаланин не дезаминирует. Тирозин не расщепляет, Образует каталазу. Молоко "не пептонизирует. Растет на средах с 0,001% лизоцима и 7% хлористого натрия. Хорошо растет на ломтиках моркови, картофеля, репы, тыквы с полной мацерацией субстрата. Продуцент подвержен сезонным влияниям, так в весенний и осенний периоды допускается снижение ферментативной активности на 20-30%. Пример 1. Продуцент Вас. circulans-31 (прототип) выращивали в условно-анаэробных условиях в колбах 0,75 дм3 при коэффициенте заполнения 0,8 в течение 36 часов при температуре 40°С и рН нач. 8,2 на среде, имеющей следующий состав (г/дм3): Колбы засевали 48 часовой культурой выращенной на картофельном агаре. По окончании культивирования проводили определение ферментативных активностей и накопления биомассы. Результаты приведены в таблице. Для определения активности ферментов культуральную жидкость центрифугировали при 5000 об/мин в течение 10 мин и использовали супернатант. ПТЭ определяли прямым спектрофотометрированием ненасыщенных продуктов реакции пектолиза, имеющих максимальную оптическую плотность при длине волны 230-235 нм, определение проводили по ТУ оп. 64-13-167-90. За единицу активности принято такое количество фермента, которое за 1 час при 40°С вызывает образование ненасыщенных продуктов реакции, увеличивающих оптическую плотность на 0,1. Эндо-ПГ определяли вискозиметрическим методом по ГОСТ 20264.3-81. Экзо-ПГ определяли титрометрическим методом по увеличению восстанавливающих групп по ГОСТ 20334.3-81. Ксиланазную активность определяли по Appl. Microbiol. Blochem 1985, 22, р.177-180. Определение, накопления биомассы проводили методом предельных разведений. Пример 2, Продуцент Вас. circulans 31 (прототип) выращивали в аэробных условиях в колбах объемом 0,75 дм3 при коэффициенте заполнения 0,13 на среде, имеющей следующий состав (г/дм3): Компоненты питательной среды, за исключением мочевины, растворяют произвольным образом в 900 см3 водопроводной воды, разливают по 90 см3 раствора в колбы и стерилизуют при избыточном давлении 0,1 МПа или 1 кгс/см2 в течение 45 мин. Раствор карбамида с массовой долей 7,5% готовят и стерилизуют отдельно в течение 30 мин при избыточном давлении 0,05 МПа или 0,5 кгс/см2 и вносят в асептических условиях по 10 см3 в колбы со стерильной питательной средой перед засевом. Посевным материалом являются споры штамма Вас. circulans 31, образующиеся на поверхности скошенного картофельного агара. Смывом с 1 косяка засевали 3 колбы. Культивирование проводили в качалочных колбах при температуре 42°С на качалке при перемешивании 190 ± 10 об/мин в течение 16 часов, рН 8,2. Примеры 3-7. Продуцент Вас. circulans БТ выращивали на среде примера 1 в аэробных условиях. Питательную среду разливали по 100 см3 в качалочные колбы объемом 750 см3. В качестве посевного материала использовали споры штамма Вас. circulans БТ, которые образуются на поверхности скошенного картофельного агара после инокулирования и выращивания в течение 48 часов при 40°С. Смывом с одного косяка засевали колбы. Культивирование проводили в колбах на качалке при перемешивании 190 ± 10 об/мин в течение 8-24 час при температуре от 33 до 48°С и рН 7,4-9,0. Примеры 8-12. Продуцент Вас. circulans БТ выращивали в качалочных колбах объемом 750 см3. Состав среды по примеру №2, условия культивирования аэробные. Примеры 13-17. Культивирование продуцента Вас. circulans БТ проводили на питательной среде по примеру №1, в условно-анаэробных условиях. Примеры 18-22. Продуцент В. circulans БТ выращивали в условно-анаэробных условиях. Состав среды соответствовал примеру 2. Примеры 23-27. Продуцент В. circulans БТ выращивали на среде, имеющей следующий состав (г/дм3): Картофельный крахмал, входящий в состав питательной среды, предварительно осахаривали амилосубтилином. Питательную среду разливали в колбы объемом 2 дм3 по 300 см3 и стерилизовали при 1,5 ати 30 мин. Культивирование проводили в течение 18-84 часов при температуре 42°С без перемешивания в термостате. Примеры 28-32. Состав среды и условия культивирования соответствовали примерам 23-27. Отличие: продуцент В. circulans 31. Все опыты проводили в 3-х кратной повторности. Данные по результатам опытов представлены в таблице. Анализ данных, представленных в таблице, позволяет сделать вывод о том, что заявляемый штамм Вас. circulans БТ отличается от прототипа: 1 - снижением продолжительности культивирования продуцента (в заявляемом решении продолжительность культивирования в аэробных условиях от 10 до 18 часов, в условно-анаэробных от 18 до 36 часов; в прототипе - 10-20 часов, в условно-анаэробных - 24-36 часов); 2 - синтезом биомассы (в заявляемом решении титр клеток от 1,3 х108 до 2,8 х1011; в прототипе от 3,1x105 до 1,2 х 109); 3 - значительным синтезом пектат-трансэлиминазы (в заявляемом решении активность ПТЭ на среде, содержащей в качестве источника углерода свекловичный жом, в условно-анаэробных и аэробных условиях 2310-6700 ед/см3 против 38-1600 ед/см3 соответственно в прототипе; на среде содержащей в качестве источника углерода крахмал в условно-анаэробных условиях 10000-25000 ед/см3); в прототипе - 2200 ед/см3); 4 - увеличением эндо-полигалактуроназной активности (в заявляемом решении активность достигает 32,57-87,7 ед/см3; в прототипе - 3,0-9,0 ед/см3); 5 - увеличением экзо-полигалактуроназной активности (в заявляемом решении до 270 ед/см3, в прототипе от 8 до 114 ед/см3); 6 - диапазоном синтеза ферментов (в заявляемом решении, синтез ксиланазы - 30,8 ед/см3, в прототипе синтез ксиланазы отсутствует). Использование предлагаемого штамма Вас. circulans БТ по сравнению с прототипом имеет следующие преимущества: 1 - сверхсинтез пектат-трансэлиминазы, которая является основным показателем при получении ферментного препарата мацерирующего действия; 2 - увеличением эндо-полигалактуроназной и экзо-полигалактуроназной активностей; 3 - наличием синтеза ксиланазы; 4 - значительным усилением роста биомассы; 5 - возможность получения высокоактивного ферментного препарата как в аэробных, так и в условноанаэробных условиях, Таким образом предлагаемый штамм дает возможность получать высокоактивный ферментнобактериальный препарат или высокоактивную культуральную жидкость, характеризующиеся широким спектром действия ферментов. Препарат, получаемый на основе Вас. circulans БТ может использоваться для профилактики и лечения ацидоза крупного рогатого скота, как биологическая добавка в рационы сельскохозяйственной птицы с целью повышения усвояемости корма и увеличения прироста животной массы, а также при обработке лубоволокнистого (например льна и конопли) и масличного сырья, и при силосовании и для повышения выхода или получения экстрактивных и других ценных веществ из растительного сырья.