Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб визначення мутацій гена NOTCH1, що включає отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові, ампліфікацію фрагмента гена в ділянці мутації у присутності барвника SYBR green в режимі реального часу та оцінку рівня ампліфікації порівняно з контрольним геном b-мікроглобуліну (В2М) за значенням порогового дельта циклу (DСТ) і характеристиками кривої плавлення, який відрізняється тим, що порівнюється рівень експресії мутованого NOTCH1 і контрольного генів, які ампліфікуються окремо, а оцінка наявності мутацій проводиться за двома параметрами: різниці у рівні ампліфікації гена NOTCH1 і контрольного гена за DСТ, а також наявності/відсутності одного піку плавлення, включаючи проведення реакції на звичайному термоциклері для real-time полімеразної ланцюгової реакції.

Текст

Реферат: Спосіб визначення мутацій гена NOTCH1 включає отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові, ампліфікацію фрагмента гена в ділянці мутації у присутності барвника SYBR green в режимі реального часу та оцінку рівня ампліфікації порівняно з контрольним геном -мікроглобуліну (В2М) за значенням порогового дельта циклу (СТ) і характеристиками кривої плавлення. Також порівнюється рівень експресії мутованого NOTCH1 і контрольного генів, які ампліфікуються окремо, а оцінка наявності мутацій проводиться за двома параметрами: різниці у рівні ампліфікації гена NOTCH1 і контрольного гена за СТ, а також наявності/відсутності одного піку плавлення, включаючи проведення реакції на звичайному термоциклері для real-time полімеразної ланцюгової реакції. UA 112949 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ МУТАЦІЙ ГЕНА NOTCH1 UA 112949 U UA 112949 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до гематології і молекулярної біології, і може бути використана для визначення прогностично несприятливих мутацій гена NOTCH1 при хронічній лімфоцитарній лейкемії (ХЛЛ), що важливо для тактики лікування хворих. ХЛЛ - найбільш поширена форма гемобластозів дорослого населення України, інших країн Європи та США. Існує декілька факторів, які впливають на прогноз перебігу захворювання та чутливість хворих до дії хіміотерапевтичних засобів. Одним з таких прогностичних факторів є мутації гена NOTCH1, наявність яких асоційована зі скороченням періоду, що передує необхідності починати терапію та зменшенням безрецидивного виживання хворих, а також з резистентністю до дії моноклональних антитіл проти антигена CD20, використання яких є "золотим стандартом" лікування хворих [1-8]. Мутації гена NOTCH1 виявляються у 8-15 % хворих на ХЛЛ і у переважній більшості випадків (85-90 %) вони представлені делецією двох нуклеотидів у ділянці c.7541_7542delCT. Ця делеція реалізується появою білка без термінального PEST домену, що збільшує його період напіврозпаду, активність як фактора транскрипції та призводить до нерегульованої активації генів проліферації та протоонкогенів [9]. Для виявлення мутацій гена NOTCH1 застосовується метод секвенування ДНК та ARMS (amplification refractory mutation system) модифікація полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) [1, 10]. Основним недоліком першого методу є висока вартість, необхідність дорогого обладнання, складність виконання. ARMS метод може бути виконаний у будь-якій молекулярно-генетичній лабораторії, але у частини пацієнтів він дає хибно-негативні або хибно-позитивні результати. Найближчим аналогом є спосіб визначення мутацій гена NOTCH1 методом ПЛР у реальному часі (real-time ПЛР), який базується на ампліфікації ДНК пацієнта з двома парами праймерів (що маркують фрагмент гена без наявності мутації та фрагмент гена у ділянці мутації) та аналізу кривих плавлення ампліфікованих продуктів методом плавлення високої чутливості (HRM, high resolution melting method) [11]. До недоліків способу слід віднести необхідність застосування спеціального обладнання і дорогих реагентів для проведення HRM. В основу корисної моделі поставлена задача створення способу визначення мутацій гена NOTCH1. Поставлена задача вирішується шляхом отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові, проведення ампліфікації з набором специфічних праймерів до фрагмента мутованого гена NOTCH1 методом real-time ПЛР у присутності барвника SYBR green, оцінку рівня ампліфікації гена NOTCH1 з мутацією c.7541_7542delCT порівняно з контрольним геном βмікроглобуліну (В2М) за значенням порогового дельта циклу (ΔСТ) та наявності одного піку плавлення. За умов наявності мутацій гена NOTCH1 рівень ампліфікації генів NOTCH1 і В2М співставний, а на кривій плавлення виявляється один пік продукту. За відсутності мутацій специфічної ампліфікації при використанні праймерів до мутованого гена NOTCH1 не відбувається, і на кривій плавлення специфічний пік відсутній. На відміну від найближчого аналога, в даному випадку, порівнюється рівень експресії мутованого NOTCH1 і контрольного генів, які ампліфікуються окремо; оцінка наявності мутацій проводиться за двома параметрами (різниця у рівні ампліфікації гена NOTCH1 і контрольного гена за ΔСТ, а також наявність/відсутність одного піку плавлення); в реакції використовується найбільш розповсюджений та загально доступний барвник SYBR green (у найближчому аналогу - специфічні для HRM і більш дорогі ResoLight та LC Green); реакція може бути проведена на звичайному термоциклері для real-time ПЛР, тоді як для способу-найближчого аналога необхідне спеціальне обладнання для способу плавлення високої чутливості. Спосіб визначення мутацій гена NOTCH1 був апробований нами при обстеженні 325 хворих на ХЛЛ у співставленій з ARMS методом та прямим секвенуванням ДНК. За допомогою ARMS способу мутації гена NOTCH1 були виявлені у 33 хворих (10,1 %), однак у двох випадках результати дослідження були сумнівні через слабкість мутаційного сигналу. Ще у 5 випадках розташування смуги ампліфікованого продукту дещо відрізнялось від розташування смуги у випадку типового продукту за наявності делеції c.7541_7542delCT ("хибно-позитивні" випадки). При проведенні секвенування делеція c.7541_7542delCT була виявлена у 33 позитивних за ARMS методом випадках, в тому числі і при слабкому сигналі, і була відсутня в ARMSнегативних випадках, включаючи і 5 "хибно-позитивних" випадків. Такі ж самі результати були отримані і розробленим нами методом real-time ПЛР: в 33 мутованих випадках спостерігалась ампліфікація мутованого гена NOTCH1 при середніх значеннях значеннями СТ=28,17±1,87(М±SD). Середні значення СТ для гена В2М становили 23,77±0,84, відповідно М±SD для ΔСТ дорівнювало 3,9±1,4. Специфічність реакції підтверджувалась наявністю одного піку на кривій плавлення. У відсутності мутацій протягом періоду ампліфікації (40 циклів) специфічний продукт гена NOTCH1 не утворювався, а ампліфікація контрольного гена відбувалась з показниками СТ=24,51±1,24. При серійному розведенні зразків ДНК було 1 UA 112949 U 5 10 15 20 25 30 35 40 встановлено, що чутливість способу дорівняє щонайменше 10 % мутованих алелей у зразку. Результати аналізу показали, що запропонований нами спосіб real-time ПЛР по своїй чутливості та специфічності співпадає з прямим секвенуванням ДНК, однак значно простіше та дешевше. Перевагою запропонованого способу над ARMS є відсутність сумнівних реакцій та можливість підтвердити специфічність ампліфікованого продукту результатами плавлення. Таким чином, при здійсненні запропонованої корисної моделі можливо проводити визначення мутацій гена NOTCH1 у хворих на ХЛЛ, що важливо для прогнозу перебігу захворювання та призначення терапії на основі анти-СD20 моноклональних антитіл. Корисна модель, що заявляється, може бути впроваджена в роботі науково-дослідних інститутів, молекулярно-генетичних лабораторій, медичних закладів, де проводяться обстеження і лікування хворих на хронічні лімфопроліферативні захворювання. Джерела інформації: 1. Rossi D., Rasi S., Fabbri G., et al. Mutations of NOTCH1 are an independent predictor of survival in chronic lymphocytic leukemia^ Blood 2012; 119: 521-9. 2. Villamor N, Conde L, Martinez-Trillos A, et al. NOTCH1 mutations identify a genetic subgroup of chronic lymphocytic leukemia patients with high risk of transformation and poor outcome. Leukemia 2013; 27: 1100-6. 3. Lionetti M, Fabris S, Cutrona G, et al. High-throughput sequencing for the identification of NOTCH1 mutations in early stage chronic lymphocytic leukaemia: biological and clinical implications. Br J Haematol 2014; 165: 629-39. 4. Baliakas P, Hadzidimitriou A, Sutton LA, et al. Recurrent mutations refine prognosis in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2015; 29: 329-36. 5. Stilgenbauer S, Schnaiter A, Paschka P, et al. Gene mutations and treatment outcome in chronic lymphocytic leukemia: results from the CLL8 trial. Blood 2014; 123: 3247-54. 6. Bo MD, Del Principe MI, Pozzo F, et al. NOTCH1 mutations identify a chronic lymphocytic leukemia patient subset with worse prognosis in the setting of a rituximab-based induction and consolidation treatment. Ann Hematol 2014; 93:1765-74. 7. Tausch E, Beck P, Schlenk RF, et al. NOTCH1 mutation and treatment outcome in CLL patients treated with chlorambucil (Chi) or ofatumumab-Chl (O-Chl): results from the phase III study complement 1 (OMB110911). Blood 2013;122: 527. 8. Pozzo F, Bittolo T, Arruga F, et al. NOTCH1 mutations associate with low CD20 level in chronic lymphocytic leukemia: evidence for a NOTCH 1 mutation-driven epigenetic dysregulation. Leukemia 2016; 30: 182-9. 9. Di Ianni M, Baldoni S, Rosati E, et al. A new genetic lesion in B-CLL: a NOTCH1 PEST domain mutation. Br J Haematol 2009; 146: 689-91. 10. Fabbri G, Rasi S, Rossi D, et al. Analysis of the chronic lymphocytic leukemia coding genome: role of NOTCH1 mutational activation. J Exp Med 2011; 208:1389-1401. 11. Wang Ming; Fan Shaoan. Quick detection method for Notch1 gene mutation / Patent CN102925580; C12Q1/68. Application N CN2012146165820121116; Priority N CN20121461658 20121116. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Спосіб визначення мутацій гена NOTCH1, що включає отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові, ампліфікацію фрагмента гена в ділянці мутації у присутності барвника SYBR green в режимі реального часу та оцінку рівня ампліфікації порівняно з контрольним геном -мікроглобуліну (В2М) за значенням порогового дельта циклу (СТ) і характеристиками кривої плавлення, який відрізняється тим, що порівнюється рівень експресії мутованого NOTCH1 і контрольного генів, які ампліфікуються окремо, а оцінка наявності мутацій проводиться за двома параметрами: різниці у рівні ампліфікації гена NOTCH1 і контрольного гена за СТ, а також наявності/відсутності одного піку плавлення, включаючи проведення реакції на звичайному термоциклері для real-time полімеразної ланцюгової реакції. Комп’ютерна верстка О. Рябко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/68

Мітки: гена, спосіб, визначення, мутацій, notch1

Код посилання

<a href="https://ua.patents.su/4-112949-sposib-viznachennya-mutacijj-gena-notch1.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення мутацій гена notch1</a>

Подібні патенти