Спосіб виявлення мікроорганізмів роду helicobacter у стінках жовчного міхура

Реферат: Спосіб виявлення мікроорганізмів роду Helicobacter у стінках жовчного міхура полягає в отриманні біоптату (стінок жовчного міхура). При цьом виконують ПЛР-ампліфікації ДНК з подальшою детекцією методом гель-електрофорезу. UA 118606 U (12) UA 118606 U UA 118606 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Запропонований спосіб належить до медицини, а саме до методів лабораторної діагностики, і може бути використаний для пошуку в біоптатах стінок жовчного міхура бактерій роду Helicobacter (Hp) при жовчнокам’яній хворобі. Численні літературні повідомлення зарубіжних вчених висувають припущення що бактерії роду (Нр) можуть слугувати пусковим механізмом розвитку жовчнокам’яної хвороби. Зокрема, H.J. Monstein і співавт. при досліджені жовчних каменів виявили 50 % ДНК, причому у 60 % хелікобактеріоз виявляли у хворих із безсимтомним перебігом холециститу [1]. Незважаючи на те, що остаточно не встановлена клінічна роль Helicobacter у розвитку захворювань жовчного міхура, не доведено чи є даний мікроорганізм невинним спостерігачем чи активним учасником формування жовчнокам'яної хвороби, проте, від точності встановленого діагнозу залежить тактика лікування хворого на жовчнокам'яну хворобу, в тому числі і в післяопераційний період після холецистектомії. Отже, встановлення наявності Нр у післяопераційному біоптаті жовчного міхура є надзвичайно важливим для практикуючого лікаря. Є такі сучасні методи виявлення Нр в біологічних об’єктах: Прямий спосіб виявлення бактерій, або так званим «золотим стандартом» є гістологічне дослідження. Гістологічна ідентифікація Н. проводиться за допомогою світлового, фазовоконтрастного і люмінесцентного мікроскопів. У світловому мікроскопі досліджуються зрізи, пофарбовані за методами Гімзе, гематоксиліном і еозином. Також слід відмітити специфічне сріблення за Вартин-Старрі, яке відрізняється високою специфічністю та чутливістю. Разом з тим для проведення такої діагностики потрібно висококваліфікований персонал і морфологічна лабораторія. Істотним недоліком гістологічного методу є тривалим термін очікування результатів, які становлять 5-7 днів [2]. Прототипом є найбільш доступний спосіб виявлення Нр - уреазний тест, заснований на здатності мікроорганізмів Нр виділяти фермент уреазу який розщеплює сечовину на аміак та вуглекислий газ. Аміак здатен змінювати середовище у лужну сторону і таким чином відбувається індикація у експрес тест-системах, які використовуються у діагностичних дослідженнях [3]. Зазначимо, що уреазний тест не знайшов широкого застосування в клінічній практиці. Всі ці методи мають власні переваги та недоліки: - потребують наявності лабораторного обладнання та висококваліфікованих фахівців; - тяжкість візуальної оцінки змін кольору середовища, що понижує точність способу. В основу корисної моделі поставлена задача розробити спосіб виявлення мікроорганізмів роду Helicobacter у стінках жовчного міхура у хворих на жовчнокам'яну хворобу шляхом застосування прямого методу детекції ПЛР, в основі якого лежить виявлення специфічного фрагменту ДНК мікроорганізму шляхом накопичення (ампліфікації) копій даного фрагмента СДНК-мішені) у процесі синтезу нових ланцюгів ДНК, з детекцією продуктів ампліфікації горизонтальним електрофорезом у агаровому гелі, що забезпечить виявлення мікроорганізмів Helicobacter (Нр) та можливість формування тактики подальшого лікування. Дослідження виконують за допомогою сертифікованих наборів реактивів виробництва Компанії «ДНК-Технологія» (РФ): комплект реагентів для виділення ДНК «ПРОБА-ГС» та «Комплекта реагентів для ПЛР-ампліфікації ДНК для подальшої детекції методом гельелекгрофорезу - Helicobacter pylori». Ампліфікацію виконують на термоциклері GeneAmp® PCR System 2400 виробництва Applied Biosystems (США), детекцію продуктів ампліфікації здійснюють шляхом горизонтального електрофорезу у агаровому гелі з використанням блоку живлення Эльф-8 (РФ). Біоптат (стінки жовчного міхура) відмивають від жовчі у стерильному 0,9 %-ому розчині натрію хлористого. Стерильним скарифікатором здійснюють зіскоби слизової оболонки жовчного міхура у кількості 0,2-0,4 мкг на глибину 1-3 мм та переносять отриманий біологічний матеріал у пробірки із лізуючим розчином з набору реактивів «ПРОБА-ГС», далі працюють відповідно інструкції. Отримані ДНК піддають ампліфікації відповідно до інструкції до набору «Комплекти реагентів для ПЛР-ампліфікації ДНК для подальшої детекції методом гель-електрофорезу. Результати ампліфікації шляхом електрофорезу амплікона у 2 %-ому агаровому гелі який готують на 1ХТрісНСІ-буфері. Інтерпретацію результатів проводять відповідно рекомендацій інструкції до вищезгаданого набору реактивів. Перевагами способу є швидкість, висока чутливість, специфічність та можливість типувати і диференціювати штами бактерій, що дозволить здійснювати їх епідеміологічне вивчення. Спосіб забезпечує високу точність та специфічність діагностики бактерій роду Helicobacter, оцінку їх властивості з виявлення генів CagA, VacA, IceA, BabA, виявлення мікроорганізмів у 1 UA 118606 U 5 10 будь-якій формі, в тому числі коковій, а також різні по токсигенності та антигенній структурі штами та формування тактики лікування. Література 1. Monstein HJ.Jonsson Y.,Zdolsek J.et al.Indentification of Helicobacter pylori DNA in human cholesterol gallstones//Scand.J. Gastroenterol. - 2002. - Vol. 37, № l. - PH2-ll9. 2. Кишкун А.А. - Современные методы диагностики и оценки эффективности лечения инфекции, вызванной Helicobacter pylori.-Медицинский центр Банка России, Москва.Клиническая Лабораторная Диагностика,2002, No 8. - С. 41-46. 3. Патент UA 30681 МПК G01N33/62, C12Q1/00 Спосіб виявлення helicobakter pylori у біосубстраті / Гайдар Ю.А., Мосійчук Л.М., Філіпова О.Ю. - № 98041894; Заявлено 14.04.1998; Опубл. 15.12.2000, Бюл. № 7. - 2000 р. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 Спосіб виявлення мікроорганізмів роду Helicobacter у стінках жовчного міхура, що полягає в отриманні біоптату (стінок жовчного міхура), який відрізняється тим, що виконують ПЛРампліфікації ДНК з подальшою детекцією методом гель-електрофорезу. Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2