Інгібітор вірусу імунодефіциту людини першого типу – бактеріальна неметильована cpg днк

Інгібітор вірусу імунодефіциту людини першого типу - бактеріальна неметильована CpG ДНК, яка має виражену анти-ВІЛ-1-активність та є потужним індуктором інтерферонів типу і . (19) (21) u200507062 (22) 15.07.2005 (24) 16.01.2006 (46) 16.01.2006, Бюл. № 1, 2006 р. (72) Рибалко Світлана Леонтіївна, Олішевський Сергій Валерійович, Козак В'ячеслава Вадимівна, Яніш Юрій Вадимович, Завелевич Михайло Петрович, Шляховенко Володимир Олексійович, Максименок Олена Валентинівна 3 11972 4 ретного виконання та таблиці. оцінювали на 5 добу культивування за кількістю Приклад 1. Визначення інгібіторної активності вірусного антигену р24 за допомогою імунофермебактеріальної неметильованої CpG ДНК на репронтного аналізу (ІФА). дукцію ВІЛ. Інфекційний титр ВІЛ-1 визначали таким чиОтримання бактеріальної ДНК. Бактеріальну ном: десятикратні розведення супернатантів інфіДНК виділяли з фільтрату культуральної рідини кованих культур додавали до клітин МТ-4. ІнфікоBacillus subtilis загальноприйнятим методом видівані клітини культивували при 37°С протягом 5 діб лення плазмідної ДНК з використанням поліетилеу вологій атмосфері 5% СO2. Потім з кожної лунки нгліколю 6000 та 0,6М NaCI [8]. відбирали культуральну рідину і визначали в ній Присутність неметильованих CpG-мотивів вивміст антигену р24 методом ІФА за допомогою значали за допомогою рестрикційного аналізу з тест-системи "Genetic Systems™ HIV-1 Ag EIA" використанням специфічної рестрикційної ендону(BioRad), серія 4В0022, термін придатності клеази Нра II (Sigma, USA) [9] та подальшим імпу15.02.2005. Інфекційний титр ВІЛ при цьому станольсним електрофорезом в агарозі з інверсією елевив 4,2 lg ID50. ктричного поля [10]. Дослідження впливу бактеріальної неметильоДля проведення подальших досліджень видіваної CpG ДНК проводили на моделі продуктивної лену ДНК розчиняли у фосфатному буферному ВІЛ-1-інфекції в культурі клітин МТ-4. Для цієї мети розчині (рН 7,3) в концентрації 1мг/мл. у флакони з суспензійною культурою МТ-4 вносиІнфікування клітин МТ-4 ВІЛ-1 та дослідження ли різні концентрації бактеріальної неметильоваантивірусної дії бактеріальної неметильованої ної CpG ДНК: 5, 2,5 та 1,25мкг/мл. Через 30хв. інCpG ДНК. Для визначення анти-ВІЛ-активності кубування за кімнатної температури клітини бактеріальної неметильованої CpG ДНК викорисінфікували ВІЛ-1 та інку бували при температурі товували традиційну модель первинно37°С у вологій атмосфері 5% СO2 протягом 5 діб. інфікованих ВІЛ-1 суспензійних клітин МТ-4. ІнфіУ кожній пробі вищезгаданим методом визначали кування проводили шляхом додаванням вірусу до інфекційний титр. Результати визначення інфекклітинної суспензії МТ-4 (4-5х105клітин/мл) з мноційного титру ВІЛ-1 подані в таблиці1. жинністю інфікування 100 lg ІД50. Інгібуючий ефект Таблиця 1 Інгібіція інфекційного титру ВІЛ-1 при дії бактеріальної неметильованої CpG ДНК Досліджуваний препарат Контроль ВІЛ-1 Бактеріальна наметильована CpG ДНК Анти-сенсова РНК Азидотимідин Концентрація препарату, мкг/мл 1,25 2,5 5,0 0,1 0,2мкмоль Згідно з отриманими даними, бактеріальна неметильована CpG ДНК здатна дозозалежно пригнічувати репродукцію ВІЛ-1 на 0,2-3,2 lg ID50. В концентрації 5,0мкг/мл вона достовірно пригнічує репродукцію ВІЛ-1 на 3,2 lg ID50. Таким чином, найбільш ефективною в даному дослідженні виявилась концентрація CpG ДНК-5,0мкг/мл. Крім того, з наведених даних видно, що CpG ДНК бактеріального походження в концентрації 5,0мкг/мл пригнічує репродукцію ВІЛ-1 на рівні АЗТ, та на 1.0 lg ID50 активніше за анти-сенс РНК. Інфекційний титр, lg ID50 4,2 4,0 3,0 1,0 2,0 1,0 Інгібіція інфекційного титру, lg ID50 0,2 1,2 3,2 2,2 3,2 Наступним етапом досліджень було вивчення противірусної дії бактеріальної неметильованої CpG ДНК до та після інфікування культури клітин МТ-4 ВІЛ-1. З цією метою бактеріальну CpG ДНК вносили в ефективній дозі (5,0мкг/мл) до суспензійної культури МТ-4 за 24год до інфікування та через 24год після інфікування ВІЛ-1. Противірусну активність оцінювали згідно вищеописаних методів і виражали у вигляді інгібіції інфекційного титру. Результати проведеного дослідження наведені у таблиці 2. Таблиця 2 Дослідження впливу бактеріальної неметильованої CpG ДНК на репродукцію ВІЛ-1 в клітинах МТ-4 Варіант впливу CpG ДНК Контроль ВІЛ-1 Профілактичне введення Лікувальне введення Інфекційний титр, lg ID50 5,0 3,0 2,0 Аналізуючи отримані результати, слід відмітити, що бактеріальна неметильована CpG ДНК в концентрації 5,0мкг/мл статистичне достовірно Інгібіція інфекційного титру, lg ID50 2,0 3,0 пригнічує репродукцію ВІЛ-1 в режимі як профілактичного, так і терапевтичного застосування. Отримані результати свідчать, що досліджуваний поте 5 11972 6 нційний інгібітор репродукції ВІЛ-1 - бактеріальна Активність інтерферону у обох випадках винеметильована CpG ДНК має досить виражену значали методом пригнічення цитопатогеної дії противірусну активність, при цьому абсолютно не вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) у культурі проявляючи токсичності. Таким чином, проведені клітин А549 [11]. Для цього до моношару клітин дослідження свідчать, що бактеріальна неметидодавали розведення культуральної рідини та льована CpG ДНК є перспективним кандидатом в інкубували при 37°С протягом 24 годин, після чого антиретровірусні препарати та може бути ефектизмінювали поживне середовище та інфікували вно застосована як для профілактики, так і для клітини ВВС в 100ТЦД50/мл. В якості негативних лікування СНІД. контролів були інтактні клітини та клітини, інфікоПриклад 2. Визначення інтерфероногенної дії вані ВВС, позитивного контролю - клітини оброббактеріальної неметильованої CpG ДНК. лені супернатантами, від стимульованої стандартІнтерфероногенну активність досліджували в ним індуктором інтерферонів polyI:polyC культури експериментах in vitro. Для цього були використані лейкоцитів периферичної крові людини. Активність лейкоцити периферичної крові людини в кількості інтерферону визначали через 24год., коли доза 3млн/мл. Лейкоцити інкубували з різними концентвнесеного ВВС викликала повну дегенерацію кліраціями бактеріальної CpG ДНК при 37°С у вологій тин у негативному контролі (контроль вірусу), при атмосфері СО2 протягом 24год. Після інкубації відсутності такої в інтактній культурі. За титр інтезбирали надосадкову рідину та розділяли її на 2 рферону приймали величину, зворотну до розвечастини. Одну частину залишали незмінною, а у дення досліджуваних супернатантів, при якому другій змінювали рН до 2,0 і залишали при 4°С на клітинна культура у 50% лунок була повністю за48-72год. Потім рН надосадової рідини доводили хищена від цитопатогенної дії ВВС. Результати до 7,3. проведених досліджень наведені в таблиці 3. Таблиця 3 Інтерфероногенна активність препаратів Концентрація препарату, мкг/мл 1,0 Бактеріальна 2,5 СрG ДНК 17,5 PolyI:polyC 10 Активність інтерферонів, МО/мл -рН2+рН2 2560 1280 2560 640 2560 1280 >2560 >2560 Отримані дані свідчать про значну інтерфероногенну активність бактеріальної неметильованої CpG ДНК. За маркером кислоточутливості і кислоторезистентності та даними визначення активності можна зробити висновок, що бактеріальна неметильована CpG ДНК індукує і -інтерферон на рівні еталонного індуктора інтерферонів polyI:polyC. Отримані результати дозволяють рекомендувати бактеріальну неметильовану CpG ДНК як сильний індуктор інтерферонів типу і . Таким чином, показано, що ДНК з неметильованими CpG мотивами, виділена з культуральної рідини бактерії Bacillus subtilis має виражену противірусну та інтерфероногенну активність. Здатність бактеріальної неметильованої CpG ДНК пригнічувати репродукцію ВІЛ-1 та індукувати синтез інтерферонів і дає підставу стверджувати про можливу перспективність її застосування в арсеналі противірусних та імуномодулюючих речовин. Джерела інформації: 1. Mitsaya H., Breder S. Inhibition of the in vitro infectivity and cytopathic effect of human Tlymphotropic vims type III/ lymphadenoma thy associated was (HTLV-III/LAV) by 2',3'dideoxynucleasides // PNAS. - 1986. - 83. - P.19111915. 2. Richman D.D. HIV chemotherapy // Nature, 2001. - 410. - P.995-1001. 3. Лукаш Л., Швед А., Рибалко С. Створення модельної векторної конструкції, що експресує антисенсові РНК проти ВІЛ // Інф хвороби, - 1997. Тип інтерферонів і і і 1. - С. 16-20. 4. Field A.K. Oligonucleotides as inhibitors of human immunodeficiency virus // Curr Opin Моl Ther. - 1999. - 1. - P.323-331. 5. Wagner H. Bacterial CpG DNA activates immune cells to signal infectious danger // Adv Immunol. - 1999. - 73. - P.329-368. 6. Krieg A.M. CpG motifs in bacterial DNA and their immune effects // Annu Rev Immunol. - 2002. 20. - P.709-760. 7. Ballas Z., Krieg A.M., Warren T.L., Rasmussen W.L., Davis H.L., Waldschmidt M., Weiner G.J. Divergent therapeutical and immunologic effects of oligodeoxynucleotides with distinct CpG motifs // J Immunol. - 2003. - 167. - P.4878-4886. 8. Молекулярная клиническая диагностика под ред. С. Херрингтона и Дж. Макги, - «Мир», - 1999. 560с. 9. Sun S., Cat Z., Langlade-Demoyen P., Kosaka H., Brunmark A., Jackson M. R., Peterson P.A., Sprent J. Dual function ofdrosophila cells as APCs for naive CD8+ Т cells: implications for tumor immunotherapy // Immunity. - 1996. - 4. - P.555-564. 10. Elia M.C., DeLuca J.G., and Bradley M.O. Significance and measurement of DNA double strand breaks in mammalian cells // Pharmac Therap. 1991. - 5L - P.291-327. 11. Ho M., Enders J. An inhibitory of viral activity appearing in infected cell cultures // PNAS. - 1959. 45. - P.385-389. 7 Комп’ютерна верстка В. Мацело 11972 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601