Спосіб визначення мутацій гена notch1 у 3’utr некодуючому регіоні гена

Реферат: Спосіб визначення мутацій гена NOTCH1 у 3'UTR некодуючому регіоні включає отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові та проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступною рестрикцією отриманих продуктів реакції рестриктазою PfeI (TfiI). Проведення ампліфікації відбувається з набором оригінальних праймерів (прямий праймер: CCGACCAGAGGAGCCTTTT; зворотний праймер: TAACAGGCAGGTGATGCTG), оцінкою рестриктованих фрагментів у 3 % агарозному гелі, а також можливістю провести реакцію без спеціального обладнання за допомогою звичайного термоциклера. UA 123082 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ МУТАЦІЙ ГЕНА NOTCH1 У 3'UTR НЕКОДУЮЧОМУ РЕГІОНІ ГЕНА UA 123082 U UA 123082 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, зокрема до гематології і молекулярної біології, і може бути використана для визначення прогностично несприятливих мутацій гена NOTCH 1 при хронічній лімфоцитарній лейкемії (ХЛЛ), що важливо для тактики лікування хворих. ХЛЛ В-клітинного походження належить до найпоширеніших злоякісних новоутворень кровотворної системи дорослого населення України. Механізми, які призводять до появи клону трансформованих клітин, остаточно невідомі. Мутації гена NOTCH 1 виявляються вже на ранніх + стадіях розвитку злоякісно трансформованих лімфоцитів, зокрема в CD34 CD19 клітинахпопередниках, тому їх появу можна вважати одним з пускових механізмів розвитку пухлинного клону [1, 2]. Крім цього поява NOTCH 1 мутацій асоційована з несприятливим перебігом захворювання та чутливістю до застосування анти-СО20 моноклональних антитіл, тому їх визначення вкрай важливе для моніторингу та вибору тактики лікування хворих. Більшість мутацій гена NOTCH 1 при ХЛЛ представлена делецією двох нуклеотидів (c. 7544_7545delCT; p. Pro2514ArgfsX4) в послідовності 34-го екзона, що кодує PEST домен. Як наслідок, утворюється стоп-кодон, що призводить до появи білка NOTCH 1, позбавленого PEST домену, що унеможливлює його наступну деградацію і сприяє персистенції проліферативних сигналів, опосередкованих NOTCH 1 [3-5]. Нещодавно встановлено новий механізм утворення білка NOTCH 1 з втраченим PEST доменом - завдяки появі мутацій в 3'UTR некодуючому регіоні гена NOTCH 1, які призводять до появи сайту альтернативного сплайсинга мРНК і, як наслідок, делеції значної частини 34-го екзона, в тому числі і кодуючої ділянки PEST домена. Прогностичне значення таких мутацій таке ж саме, що і раніш описаної делеції c. 7544_7545delCT [6]. Слід зазначити, що одночасна наявність мутацій в PEST домені та 3'UTR некодуючому регіоні гена NOTCH 1 при ХЛЛ не описана. Аналогом корисної моделі є спосіб визначення мутацій гена NOTCH 1 в 3'UTR некодуючому регіоні прямим секвенуванням ДНК [6]. До недоліків методу слід віднести необхідність застосування спеціального обладнання і коштовних реагентів для проведення реакції. Технічною задачею корисної моделі є створення способу визначення мутацій гена NOTCH 1 в 3'UTR некодуючому регіоні методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступною рестрикцією отриманих продуктів реакції. Поставлена технічна задача вирішується через отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові, проведення ампліфікації з набором власно розроблених праймерів до фрагменту мутованого гена NOTCH 1 (прямий праймер: CCGACCAGAGGAGCCTTTT; зворотний праймер: TAACAGGCAGGTGATGCTG) з наступною рестрикцією продуктів реакції рестриктазою PfeI (TfiI) та оцінкою рестриктованих фрагментів у 3 % агарозному гелі. Умови проведення ПЛР: 95 °C-3 хв.; (95 °C-30 сек, 61 °C-30 сек, 72 °C-40 сек) - 35 циклів. Рестрикція проводиться протягом 6 годин при 37 °C. За відсутності мутацій утворюються фрагменти з молекулярною масою 219 і 159 пар нуклеотидів (п.н.). За умов утворення фрагментів 219, 145 і 14 п.н. результати реакції розцінюються як позитивні і свідчать про наявність мутацій гена NOTCH 1 у 3'UTR некодуючому регіоні, а пацієнт належить до групи несприятливого прогнозу. На відміну від найближчого аналога, вибраного за прототип, в даному випадку використаний інший підхід до визначення мутації, запропоновані оригінальні праймери, реакція може бути проведена на звичайному термоциклері для ПЛР, тоді як для способу-прототипу необхідне спеціальне обладнання (секвенатор). Приклади: Спосіб визначення мутацій гена NOTCH 1 в 3'UTR некодуючому регіоні був апробований при обстеженні 96 хворих на ХЛЛ, в яких раніше не була виявлена класична делеція c. 7544_7545delCT у 34-му екзоні. З цією метою проводили ампліфікацію ДНК пацієнтів з праймерами до фрагменту ДНК в ділянці 3'UTR некодуючого регіону (CCGACCAGAGGAGCCTTTT) та ділянки, що примикає до PEST домену (TAACAGGCAGGTGATGCTG) ієна NOTCH 1. Ампліфікаційна суміш включала: зразок ДНК - 3 мкл, праймери - кожен по 0,5 мкл, суміш для ампліфікації Master Mix ("Біолабтех", Україна) - 10 мкл, вода деіонізована - 6 мкл (загальний об'єм 20 мкл). Ампліфікацію проводили на термоциклері 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystem) в наступному режимі: 95 °C-3 хв.; потім 35 циклів, кожен з яких складався з етапу денатурації ДНК (95 °C, 30 сек), отжигу праймерів (61 °C, 30 сек) та елонгації (72 °C-40 сек). Результати ампліфікації контролювали методом електрофорезу у 3 % агарозному гелі. В усіх випадках утворювався продукт довжиною 441 п.н. Наступним етапом було проведення рестрикції продукту ПЦР-реакції рестриктазою PfeI (TfiI) (Thermo Fisher Sceintific) протягом 6 годин мри температурі 37 °C. Після рестрикції повторно проводили електрофорез у 3 % агарозному гелі. 1 UA 123082 U 5 10 15 20 25 30 У зразках ДНК п'яти пацієнтів після рестрикції були виявлені фрагменти довжиною 219, 145 і 14 п.н., що свідчить про наявність мутації в некодуючій частині гена. В зразках ДНК 91 хворих в електрофореграмах були присутні фрагменти з молекулярною масою 219 і 159 п.н., що свідчить про відсутність мутації в некодуючій частині гена NOTCH 1. Для підтвердження отриманих результатів було проведено секвенування продуктів ПЦРреакції в частини обстежених пацієнтів (5 хворих з присутніми мутаціями та 25 хворих без наявності мутацій). Виявлені за допомогою запропонованого методу мутації гена NOTCH 1 в 3'UTR некодуючому регіоні у 5 хворих були підтверджені секвенуванням в усіх випадках. V 25 із 91 хворих, в яких за нашим методом мутації в 3'UTR некодуючому регіоні не виявлялись, мутації при проведенні секвенування також не були виявлені. Таким чином, результати аналізу показали, що запропонований нами метод за чутливістю та специфічністю співпадає з прямим секвенуванням ДНК, однак значно простіший та дешевший. Корисна модель, що заявляється, може бути впроваджена в роботі науково-дослідних інститутів, молекулярно-генетичних лабораторій, медичних закладів, де проводяться обстеження і лікування хворих на хронічні лімфопроліферативні захворювання. Джерела інформації: 1. Quijada-AIamo Μ., Hernandez-Sanchez M., Robledo С. et al. (2017) Next-generation sequencing and FISH studies reveal the appearance of gene mutations and chromosomal abnormalities in hematopoietic progenitors in chronic lymphocytic leukemia. J. Hematol. Oncol., 10(1): 83. 2. Fabbri G., Dalla-Favera R. (2016) The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukemia. Nat. Rev. Cancer. 16 (3): 145-162. 3. Rossi D., Rasi S., Fabbri G. et al. (2012) Mutations of NOTCH 1 are an independent predictor of survival in chronic lymphocytic leukemia. Blood, 119 (2): 521-529. 4. Campregher P.V., Petroni R.C., Muto N.H. et al. (2016) A novel assay for the identification of NOTCH 1 PEST domain mutations in chronic lymphocytic leukemia. Biomed. Res. Int., 2016: 4247908. 5. Stilgenbauer S, Schnaiter A, Paschka P, et al. Gene mutations and treatment outcome in chronic lymphocytic leukemia: results from the СІЛ.8 trial. Blood, 2014. - 123: 3247-54. 6. Puente X.S., Beà S., Valdés-Mas R. et al. (2015) Non-coding recurrent mutations in chroniс lymphocytic leukaemia. Nature, 526 (7574): 519-524. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 40 Спосіб визначення мутацій гена NOTCH1 у 3'UTR некодуючому регіоні, що включає отримання генетичного матеріалу з клітин периферичної крові та проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) з наступною рестрикцією отриманих продуктів реакції рестриктазою PfeI (TfiI), який відрізняється тим, що проведення ампліфікації відбувається з набором оригінальних праймерів (прямий праймер: CCGACCAGAGGAGCCTTTT; зворотний праймер: TAACAGGCAGGTGATGCTG), оцінкою рестриктованих фрагментів у 3 % агарозному гелі, а також можливістю провести реакцію без спеціального обладнання за допомогою звичайного термоциклера. Комп’ютерна верстка О. Рябко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2