Спосіб визначення кількості нітріфікуючих бактерій в досліджуваному матеріалі

Изобретение относится к технологическому контролю состояния ила в очистных сооружениях и биологической очистке сточных вод и может быть использовано для оперативной оценки его нитрифицирующей пробирки центрифугируют для отделения ила от надилоБОй жидкости К полученному осадку добавляют смесь фосфатного буфера с гидроксиламином в соотношении 10(1 01 2) а ззтем приливают трі/фенилтетразолий хлористый Полученную суспензию инкубируют в течение 10-60 мин при т" = - 30°С Экстракцию образовавшегося формазана осуществляют этанолом После центрифугирования надосадоыую жидкость колометрируют и по калибровочной кривой определяют дегидрогеназную активность выраженную в мкг формаззна образуемого Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения нитрифицирующей активности ила в процессе биологической очистки сточных вод Цель изобретения - упрощение и ускорение способа Способ осуществляют следующим обра зом Тщательно перемешанную иповую суспензию помещают в две пробирки Первую (контрольную) пробирку помещают на 15 мин в кипящую водяную баню затем обе *>s. 1730133 1 г беззольного вещества биомассы в мин. Количество нитрифицирующих бактерий 1 фазы определяют по формуле 4 равном 10:1,0 и 10:1,6, соответственно, количество накапливаемого формазана практ и ч е с к и не меняется, т е становится стабильным. Это свидетельствует о том, что 5 в этом интервале взятого соотношения комl Q L понентов наступает зона устойчивой реак~ 034 ' ции Поэтому дальнейшее увеличение количества гидроксиламина нецелесообгде С - количество нитрифицирующих бакразно. Таким образом, из приведенных дантерий, мл/кг беззольного вещества ила: А - дегидрогеназная активность, мкг 10 ных видно, что соотношением, при котором формазана/г беззольного вещества, мин. достигается поставленная цель, является П р и м е р 1. Иловую суспензию в интервал 10:(1,0-1,2). Количество нитрификоличестве 5 мл (концентрация ила по бенцирующих бактерий определяли по форзольному веществу 0,16-1,5 г/л) помещали муле л в часть пробирок и в течение 3 мин центри- 15 ' фугировали при 2 тыс. об./мин. Затем . г _ igA _ tg 4190 надсадочную жидкость сливали. К полученному осадку приливали 5,5 мл смеси М/15 фосфатного буфера с 5%-ным раствором Предлагаемая формула была проверена гидроксиламина. Объемное соотношение 20 на большом числе объектов и показала выфосфатного буфера к гидроксиламину сосокую достоверность Коэффициент корреставило: в первой пробирке. 10 0,4, во втол я ц и и составляет от 0,84 до 0,92 в рой: 10:1.0; в третьей; 10:1,1; в четвертой' зависимости от биоценоза. Нитрифицирую10:1,2 и в пятой: 10:1,6 рН смеси доводили щая способность активного ила является до значения 8 0 раствором NaOH К пол- 25 низкой при IgC < 7, наблюдаемая при этом ученной в каждой из пяти пробирок суспенскорость окисления азота аммонийного зии приливали 1 мл 10%-ного раствора 9 мг/г безз.ч). бирки центрифугировали надосадочную П р и м е р 2. Определение значения рН жидкость сливали, а к осадку приливали 5 смеси фосфатного буфера с гидроксиламимл этанола для экстракции образовавшегоном. при котором достигается максималься формазана Содержимое пробирок пере- 35 ное выделение формазана, проводили в м е ш и в а л и , в с т р я х и в а л и , после этого условиях, аналогичных примеру 1. Соотнопробирки вновь центрифугировали в течешение фосфатного буфера и гидроксиламиние 3 мин и надосадочную жидкость колорина было оптимальным и составило 10:1.1. метрировали в кюветах толщиной 0,5 см с Результаты опыта приведены в табл.2. зеленым светофильтром. АО Как видно и з табл,2, максимальное коЗатем по результатам определения отличество формазана выделилось при значеносительной плотности ряда спиртовых ниях р Н смеси, равных 7,8-8.2. растворов формазана с концентрацией от 1 до 25 мкг/мл, строили калибровочную криП р и м е р З . Определение интервала вую, откладывая по оси абсцисс концентра- 45 к о н ц е н т р а ц и й раствора трифенилтетразоции р а с т в о р о в формазана а по оси лия хлористого, п р и котором достигается ординат - значения экстинкций этих распоставленная цель, проводили в условиях, творов По калибровочной кривой опреаналогичных примеру 1, Соотношение фосделяли количество выделившегося фатного буфера и гидроксиламина составляформазана. Дегидрогеназную активность 50 ло 10.1,1, рН смеси 8. выражают в мкг восстановленного формазаРезультаты опыта приведены в табл 3. на, обазованного 1 г беззольного вещества Из табл.3 видно, что эффект достигается ила в 1 мин (см таол 1) п р и значениях к о н ц е н т р а ц и и трифенилтетразолия хлористого в воде равных 9 - 1 1 % , Результаты опыта представлены в 55 т е в этом интервале находится зона устойтабл.1. ч и в о й р е а к ц и и . Д а л ь н е й ш е е увеличение Как видно из табл.1, с увеличением кок о н ц е н т р а ц и и трифенилтетразолия хлориличества гидроксиламина увеличивается костого в воде нецелесообразно. личество выделившегося формазана. В четвертой и шестой пробирках при отношеПредлагаемый способ сравнивали с нии фосфатного буфера к гидроксиламину, прототопим. б 1730133 Результаты сравнения представлены в табл.4. По данным таблицы можно заключить, что согласно предлагаемому способу значительно ускоряется и упрощается процесс определения количества нитрифицирующих бактерий в сравнении с прототипом. фосфатный буфер, раствор трифенилтетразолия хлористого и гидроксиламина, при этом фосфатный буфер и гидроксиламин вводят одновременно при их соотношении 10:{1,0-1,2) и рН 7,8-8,2 и концентрации раствора трифенилтетразолия хлористого 9-11 % с последующим определением по калибровочной кривой дегидрогеназной активности, а количество нитрифицирующих Формула изобретения Способ определения количества нитри- 10 бактерий определяют по формуле: фицирующих бактерий в исследуемом материале, предусматривающий помещение Ig С = lg А/0,34, исследуемого материала в питательную среду и инкубацию до образования окрашенногде С - количество нитрифицирующих бакго продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, 15 терий, кл/г беззольного вещества; с целью упрощения и ускорения способа, в А ~ дегидрогеназная активность, мкг/г качестве питательной среды используют беззольного вещества, мин. 20 Таблица 1 Показатель Единица из- Объемное соотношение фосфатного буфера и гидроксиламина мерения 10:0,4 і 10. 1,0 10:1,1 10: 1,2 10: 1,6 Дегидроге- мкг форма3700 4190 4180 4200 4200 зана/г назная акбезз.в-ва, тивность мин L_ Таблица 2 Показатель Единица измерения Дегидроге- мкг форманазная акзана/г тивность безз.в-ва, мин рН смеси фосфатный буфер с гидроксиламином 8,0 8,2 6 7,8 9 3000 4200 4100 4190 3300 Таблица 3 Показатель Дегидрогеназная активность Единица измерения мкг формазана/г безз.вва, мин Концентрация р-ра трифенилтетразолия хлористого, % 2 6 9 10 11 17 3140 3950 4180 4200 4200 4000 _ 25 30 1730133 Таблица 4 Показатели Технологические операции и время их проведения, ч -стерилизация посуды. инструментов - разведение - помещение в питательную среду - центрифугирование - инкубация -оценка цветной реакции - обработка результатов ИТОГО: Предлагаемый способ Прототип Отсутствует Отсутствует 0,02 0,1 0,68 0,1 0,1 1 4 0.U 0,5 Отсутствует 720 0.1 Ъ1725 10 15 20 25 Редактор С.Лисина Составитель Л Лукомская Техред М.Моргентал Корректор Н Ревская Заказ 1488 Тираж Подписное ВНИІЛПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб , 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г Ужгород, ул.Гагарина, 101