Гуанідинвмісний олігоетер як бактерицидна речовина

УКРАЇНА (19) UA (11) 22870 (13) U (51) МПК C07C 279/02 (2007.01) МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ Д ЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛ ЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ в идається під в ідпов ідальність в ласника патенту ДО ПАТЕНТУ НА КОРИСНУ МОДЕЛЬ (54) ГУАНІДИНВМІСНИЙ ОЛІГОЕТЕР ЯК БАКТЕРИЦ ИДНА РЕЧОВИНА 1 2 OH OH NH*X CH3 де R CH2 O C O CH 2 CH3 X=H 3PO4 (1) NH*X CH3 де R CH2 O O C CH2 CH3 X=H3PO4 (1) HCOOH (2) H2 N - C - NH - CH2 - CH - R - CH - CH2 -NH - C - NH 2 NH*X OH OH NH*X CH 3 де R CH2 O C CH3 X=H 3PO4 (1) HCOOH (2) (13) n=10-18 Він широко використовується як дезінфікуюча речовина для обробки приміщень тваринницьких ферм, ветеринарного, промислового та медичного обладнання. Але він характеризується незначною бактерицидною активністю щодо умовно-патогенних грампозитивних та грамнегативних бактерій. Крім того він не виробляється в Україні. Задачею корисної моделі є створення гуанідинвмісного олігоетеру, який забезпечує бактерицидну активність щодо грампозитивних та грамнегативних бактерій. Поставлена задача виконується одержанням гуанідинвмісного олігоетеру формули: U як бактерицидна речовина. HCOOH (2) як бактерицидна речовина та призначена для використання в мікробіологічній промисловості, а також для обробки води, як дезінфектант та антисептик. В літературі наведено бактерицидні речовини, які містять у своєму складі вторинні та третинні аміногрупи [1-4]. Відомою бактерицидною речовиною є алкоксиметилметиламонійметасульфат, комерційна назва алкамон ДС [5] формули: [CnH2n+1OCH2N+(СН3)(СН2СН3)2][СН3SО4-] OH 22870 NH*X OH (11) H 2N - C - NH - CH 2 - CH - R - CH - CH2-NH - C - NH2 NH*X UA Корисна модель відноситься до похідних гуанідину, його солей, комплексів або продуктів приєднання, конкретно до гуанідинвмісного олігоетеру формули: H2 N - C - NH - CH2 - CH - R - CH - CH2 -NH - C - NH2 (19) (21) u200613982 (22) 28.12.2006 (24) 25.04.2007 (46) 25.04.2007, Бюл. №5, 2007р. (72) Вортман Марина Яківна, Вакулюк Поліна Василівна, Завгородня Олександра Євгенівна, Фуртат Ірина Михайлівна, Бурбан Анатолій Флавіанович, Клименко Ніна Сергіївна, Шевченко Валерій Васильович (73) ІНСТИТУТ ХІМІЇ ВИСОКОМОЛЕКУЛЯРНИХ СПОЛУК НАН УКРАЇНИ, НАЦІОН АЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ "КИЄВО-МОГИЛЯНСЬКА АКАДЕМІЯ" (57) Гуанідинвмісний олігоетер формули: O CH2 3 22870 Суть корисної моделі пояснюється наступними прикладами: Приклад 1. В реактор завантажують 36г епоксидної смоли Epicot-828 (м.м. 360) (0,1моля) яку розчиняють у етанолі - концентрація 80%, та поступово додають краплинами спиртовий розчин 10,9г гуанідин фосфату (0,2молю) у 10,9г етанолу. Реакцію проводили 2 години за 60°С. Одержано гуанідинвмісний олігоетер вищенаведеної формули з Х=Н 3РО4. Контроль за завершеністю реакції проводили титрометричним методом за вмістом епоксидних груп та методом 14 спектроскопії за зникненням смуг поглинання епоксидних груп 920см -1 і титруванням кінцевих аміногруп. Приклад 2. В реактор завантажують 36г епоксидної смоли Epicot-828 (м.м. 360) (0,1моля) яку розчиняють у етанолі - концентрація 80%, та поступово додають краплинами спиртовий розчин 10,9г гуанідинової солі мурашиної кислоти (0,2молю) у 10,9г етанолу. Реакцію проводили 2 години за 60°С. Одержано гуанідинвмісний олігоетер вищенаведеної формули з Х=НСООН. Контроль за завершеністю реакції проводили титрометричним методом за вмістом епоксидних груп та методом ІЧ спектроскопії за зникненням смуг поглинання епоксидних гр уп 920см -1 і титруванням кінцевих аміногруп. Для дослідження дезінфікуючої та бактерицидної активності синтезованих сполук щодо грампозитивних та грамнегативних бактерій використовували штами бактерій Чеської (ССМ), 4 Американської (АТСС) та Української колекції мікроорганізмів (УКМ) та деякі ізоляти, які на даний час підтримуються у навчально-методичній лабораторії мікробіологічного профілю кафедри біології НаУКМА, зокрема: Escherichia coli BE, Pseudomonas aeruginosa ССМ 1961; Serratia marcescens CCM 1257; Enterobacter cloaceae; Klebsiella pneumoniae; Micrococcus luteus ССМ 169Тип; Staphylococcus aureus CCM 209; Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871КМ У Тип = Ac-732; Corynebacterium variable ATCC 15753Тип=УКМ Ac717; Rhodococcus erythropolis УКМ Ас-741Тип і Bacillus subtilis CCM 104 (Тип-штам, типовий для виду). Усі бактерії культивували на м'ясо-пептоновому агарі (МЛА), для культивування кишкової палички застосовували середовище Ендо. Бактерицидну активність визначали суспензійним методом [6,7]. Оптимальний час дії вказаної сполуки за певних концентрацій визначали через 15 та 30 хвилин шляхом висіву на чашки Петрі з середовищем МПА чи Ендо за методом Yould [8]. Кількість бактерій, що вижили після такої обробки, визначали за числом колонієутворювальних одиниць (КУО/мл) через 24 години інкубації за температури 37°С за вказаним методом. Ефективність бактерицидної дії сполук визначали за кількістю клітин, що вижили, розраховуючи їх життєздатність за формулою: C=lg Nt/Ntk, де Nt - кількість бактерій, що вижили після обробки дезінфіктантом, Ntk – кількість бактерій у контролі за той самий проміжок часу. Ефективність препаратів оцінювали за шкалою, наведеною в Таблиці 1. Таблиця 1 Шкала оцінки ефективності препаратів Значення С (lg N t/Ntk), КУО/мл від-2,0 до-2,9 від-3,0 до-3,9 від -4,0 до -4,9 від-5,0 до-5,9 від -6,0 та більше Досліди проводили у 3-х повторах, отримані результати обробляли математично на персональному комп'ютері. Мінімальну пригнічувальну концентрацію сполук щодо грамнегативних і грампозитивних бактерій визначали методом розведень в агаризованому середовищі у модифікації реплік [9]. Мінімальною пригнічувальною концентрацією (МІЖ) вважали ту найменшу концентрацію сполук в середовищі, за якої ріст мікроорганізмів на МПА був відсутній. Суспензії добових тест-к ультур готували у стерильному фізіологічному розчині NaCl, концентрацією 1х109кл/мл та в об'ємі 0,2мл вносили у Кількість клітин, що загинули, % 99,0 99,9 99,99 99,999 >99,999 лунки реплікатора після чого висівали паралельно на три чашки Петрі відповідно до схеми експерименту. Результати обраховували через 24 та 48 годин культивування бактерій за температури 3237°С. Як контроль використовували середовище МП А без додавання синтезованих сполук. Результати дослідження бактерицидної активності сполук щодо грамнегативної бактерії Escherichia соіі BE наведені в Таблиці 2. Згаданий вид бактерій застосовували у дослідженнях з огляду на те, що наявність Escherichia coli є показником фекального забруднення та використовується для оцінки санітарно-мікробіологічного стану якості води. 5 22870 6 Таблиця 2 Бактерицидна активність синтезованих сполук щодо грамнегативної бактерії Escherichia coli BE Приклад 1 2 алкамон ДС 10 ++++ ++++ ++++ Кінцева концентрація сполук у середовищі (ррт): 25 50 100 120 140 180 ++ + +++ ++ + ++++ ++++ ++++ +++ +++ ++ 200 + Контроль ++++ ++++ ++++ Примітка: у таблиці наведено зведені дані, після висіву культури на 3-х ча шках Петрі; "-" - ріст мікроорганзмів відсутній; "+"- поодинокі колонії; "++++" - суцільний ріст; У результаті порівнювання бактерицидної активності отриманої сполуки щодо грамнегативної бактерії Escherichia coli BE було встановлено, що максимальну бактерицидну дію сполука 1 та сполука 2 виявляють вже за концентрації 50ррm та 100ррm відповідно (Таблиці 2), натомість відома бактерицидна речовина алкамон ДС, порівняно з дослідженими сполуками, характеризується щодо цієї культури набагато нижчою бактерицидною активністю. Результати визначення мінімальної пригнічувальної концентрації гуанідинвмісного олігоетеру щодо грамнегативних та грампозитивних бактерій наведено в Таблиці 3. Таблиця 3 Мінімальні пригнічувальні концентрації гуанідинвмісного олігоетеру щодо грамнегативних та грампозитивних бактерій Рід, вид, штам Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 Staphylococcus aureus CCM 209 Приклад 1 Концентрація сполук, ррт Приклад 2 алкамон ДС 100 100 195 5 10 195 Порівняльний аналіз МПК гуанідинвмісного олігоетеру з відомою бактерицидною речовиною (алкамон ДС) засвідчує, що вона характеризується вищою бактерицидною активністю, ніж алкамон ДС як і до грамнегативних, так і до грампозитивних бактерій. Так, МПК алкамону ДС була вищою для грампозитивних в 10 разів і вдвічі - для грамнегативних. Рез ультати порівняльної оцінки чутливості тест-культур - представників грампозитивних і грамнегативних бактерій представлено в Таблиці 4. Таблиця 4 Бактерицидна активність гуанідинвмісного олігоетеру щодо грампозитивних та грамнегативних бактерій Тест-культура (рід, вид, штам) Грампозитивні бактерії Micrococcus luteus CCM 169Тип Corynebacterium ammoniagenes УКМ Ас-732Тип Corynebacterium variable УКМ Ас-717Тип Rhodococcus erythropolis УКМ Ас-741Тип Staphylococcus aureus CCM 209 Bacillus subtilis CCM 104 Грамнегативні бактерії Enterobacter cloaceas Serratia marcescens CCM 1257 Escherichia coli BE Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 Klebsiella pneumoniae Кінцева концентрація сполук у середовищі (ppm): Приклад 1 Приклад 2 5 5 5 10 5 10 5 5 10 10 10 10 500 1000 50 100 500 500 1000 100 100 500 Примітка: у таблиці наведено зведені дані, після висіву культур на 3-х чашках Петрі. 7 22870 У результаті вивчення бактерицидності гуанідинвмісного олігоетеру щодо різних груп бактерій було встановлено, що максимальну бактерицидну дію він виявляє до грампозитивних бактерій. При концентрації 10ppm не росла жодна з досліджених тест-культур - досліджених представників грампозитивних бактерій. Мінімальною пригнічувальною концентрацією для штамів Micrococcus luteus CCM 169Тип; Staphylococcus aureus CCM 209; Corynebacterium ammoniagenes АТСС 6871Тип=УКМ Ас -732; Corynebacterium variable АТСС 15753Тип=УКМ Ас 717; Rhodococcus erythropolis УКМ Ac-741Тип і Bacillus subtilis CCM 104 була концентрація 10ppm. Більш стійкими до гуанідинвмісного олігоетеру виявилися представники грамнегативних бактерій. Серед усіх досліджених грамнегативних бактерій найбільш чутливими були штами Escherichia coli BE і Pseudomonas aeruginosa CCM 1961. Так, наприклад, для штаму Escherichia coli BE МІЖ становила 50 та 100ррт відповідно, а для Pseudomonas aeruginosa CCM 1961 100ррm. Практично однаково гуанідинвмісний олігоетер впливав на штами Klebsiella pneumoniae і Enterobacter cloaceas - МПК для цих культур становила 500ррm. Найбільш стійким до гуанідинвмісного олігоетеру виявився штами Serratia marcescens CCM 1257 - лише за умови підвищення концентрації гуанідинвмісного олігоетеру до 1000ррm спостерігалося повне пригнічення росту згаданої культури. Таким чином, у результаті проведених досліджень було встановлено, що за концентрації 1000ррт гуанідинвмісного олігоетеру у середовищі не росте жоден із досліджених штамів, тобто саме ця концентрація гарантує 100% загибель усіх досліджених тест-культур. Перевагою синтезованого гуанідинвмісного олігоетеру є більш висока бактерицидна актив Комп’ютерна в ерстка М. Ломалова 8 ність щодо грамнегативних і грампозитивних бактерій, порівняно з такою відомою бактерицидною речовиною як алкамон ДС. Джерела: 1. Патент ГДР №215708, Спосіб одержання епоксидних амінних адуктів, 21.01.1981р. 2. Заявка ФРН №3736995, Синтетична смола, що містить азотні групи та її призначення, 11.05.89р. 3. N. Destais, D. Ades, J.Saue. Polym. Bull., 2000, 44, 401. 4. Macromolec. Mater. Eng., 2001, 286, №2, p.63-87. 5. Радченко О.С., СтепураЛ.Г., ФуртатІ.М., Михальський Л.О., Крамарєв CO., Перспективність застосування четвертинних амонійних сполук для санації слизових оболонок та дезинфекції ран// Інфекційні хвороби. - 2002. - №1. - С.59-63. 6. Фуртат І.М., Нів'євська Т.В., Горбатьмо Л.О., Ми хальський Л.О. Дезінфікуюча дія перекису водню та лізоформіну на грамнегативні бактерії, які контамінують виробництва харчової промисловості // Інфекційні хвороби. - 2002. - №1. - С.59-63. 7. Степура Л.Г., Радченко О.С., Фуртат І.М., Ми хальський Л.О. Бактерицидні властивості катіонних та інших поверхнево-активних речовин //Агроекологічний журнал.- 2002. - №4. - С.60-63. 8. Yauld J.P. Quantity and anality in the diagnosis of ururory troot infection// Brit. J. Urol. - 1965. - 37. №1. - P.7-12. 9. Василевская И.А., Сергейчук М.Г., Згонник В.В., Фуртат И.М., Ми хальский Л.А. Усовершенствование метода бактериологического контроля в производстве лизина // Мікробіол.журн.- 1996.- 58, №5.- С.66-76. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601