Спосіб тромболізису при експериментальному флеботромбозі

Спосіб тромболізису при експериментальному флеботромбозі, що включає внутрішньовенне введення рекомбінантного активатора плазміногену альтеплазе, який відрізняється тим, що одночасно з введенням альтеплазе підвищують рівень фібринолітичної активності крові шляхом внутрішньовенного крапельного введення плазміногену в дозі 1 мг/кг маси тіла впродовж 2 годин. (19) (21) u200704041 (22) 12.04.2007 (24) 25.07.2007 (46) 25.07.2007, Бюл. № 11, 2007 р. (72) Мішалов Володимир Григорович, Грабовий Олександр Миколайович, Миргородський Денис Сергійович (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. О.О.БОГОМОЛЬЦЯ 3 25201 швидкого покращення легеневої перфузії при лікуванні ТЕГЛА [13-15]. Відомі способи тромболізису [14-17] у якості тромболітичного агенту використовують стрептокіназу, яку отримують з культури бета-гемолітичного стрептококу групи С. Однак через виражену антигенність, високу частоту алергічних реакцій та неможливість повторного призначення препарату, в тому числі і при наявності в анамнезі (від 3 до 6міс.) стрептококової інфекції, проводився активний пошук інших фібринолітиків [11]. Урокіназу, що є прямим активатором плазміногену, о тримують з культури клітин нирок людини, завдяки чому вона не має антигенності. Урокіназа має високу фібринолітичну активність, активує плазміноген, перетворюючи його в плазмін, що викликає ферментативне руйнування фібрину [18]. Найбільш близьким за технічною суттю є спосіб [16, 17], який полягає у застосуванні внутрішньовенного введення альтеплазе - рекомбінантного активатора плазміногену, що є специфічним активатором фібринолітичної системи крові. Препарат має високоспецифічну фібринолітичну дію, ефективність якої перевищує таку стрептокінази та урокінази, на тлі відсутності антигенності. Висока фібриноспецифічність альтеплазе, теоретично, зменшує ризик геморагічних ускладнень. Ефективність застосування альтеплазе знаходиться у зворотній залежності від строків виникнення тромбу. Задачею корисної моделі є проведення лізису тромбу при сформованому флеботромбозі магістральних вен у експериментальних тварин шляхом введення тромболітичних засобів (тканинний активатор плазміногену, плазміноген) та оцінка його ефективності з використанням різних методів дослідження, у тому числі гістологічних. Технічний результат, що отримують в результаті вирішення задачі, полягає в більш ефективному лізисі сформованих тромбів у магістральних венах з можливістю різнобічної оцінки результату. Поставлена задача досягається тим, що у відомому способі тромболізису при експериментальному флеботромбозі, що включає внутрішньовенне введення рекомбінантного активатора плазміногену альтеплазе, згідно корисної моделі, одночасно з введенням альтеплазе підвищують рівень фібринолітичної активності крові шляхом внутрішньовенного крапельного введення плазміногену в дозі 1мг/кг маси тіла впродовж 2 годин. Відмінною особливістю запропонованого способу є одночасне застосування плазміногену в поєднанні з тканинним активатором плазміногену альтеплазе при проведенні тромболітичної терапії за умови експериментального флеботромбозу. Це забезпечує значне збільшення ефективності тромболізису у порівнянні із застосуванням окремо альтеплазе або гепарину. За відомими літературними даними такий спосіб тромболізису при експериментальному флеботромбозі невідомий. Запропонований спосіб тромболізису при експериментальному флеботромбозі здійснюють наступним чином: У експериментальних тварин моделюють флеботромбоз [12]. Через 1 або 2 доби після мо 4 делювання флеботромбозу тваринам проводять внутрішньовенне крапельне, протягом 2 годин введення комбінації плазміногену та тканинного активатору плазміногену альтеплазе - кожний в дозі по 1мг/кг маси тіла. Результат: через 1 годину після інфузії вказаної тромболітичної суміші у тварин, яким попередньо, за 2 доби, було змодельовано флеботромбоз, відбувається зменшення площі тромбу на поперечному зрізі вени в 5 разів, а у тварин яким флеботромбоз було змодельовано 3 доби тому назад, відбувається зменшення площі тромбу на поперечному зрізі вени більш ніж у 2 рази. Прикладом конкретного виконання способу, що пропонується, є дослідження тромболізису за умови змодельованого флеботромбозу у стегнових венах кролів. У 24 кролів вагою 3,5кг змоделювали флеботромбоз з двох сторін [12]. Тварини були поділені на чотири групи по 6 особин в кожній. Через 2 й 3 доби (по 3 кролі на кожний строк) від початку досліду було проведено тромболізис наступним чином: 1 група - контрольна, тварини не зазнавали додаткових впливів; 2 група - тваринам провели внутрішньовенне крапельне, протягом 2 годин введення тканинного активатору плазміногену (альтеплазе - фірми Boehringer Ingelheim) в дозі 1мг/кг маси тіла; 3 група - тваринам провели внутрішньовенне крапельне, протягом 2 годин введення комбінації плазміногену та тканинного активатору плазміногену альтеплазе - кожний в дозі 1мг/кг маси. Плазміноген отримували методом афінної хроматографії на лізин-сефарозі (фірми Amersham Bioscience); 4 група - тварини отримали гепарин (ТОВ "Львівтехнофарм") в дозі 80ОД/кг підшкірно болюсом та далі внутрішньовенно крапельно протягом 6 годин під контролем часу згортання крові 9-12 хвилин в дозі 100Од/кг. Матеріал для дослідження, після евтаназії тварин передозуванням наркотичних засобів, забирався через 1 годину після закінчення інфузії тромболітиків. Фрагменти вен фіксували у формаліні та ущільнювали у парафіні. Гістологічні зрізи товщиною 7мкм забарвлювали гематоксиліном та еозином, азурії-еозином, фосфорновольфрамовим гематоксиліном за Маллорі, синім Евансапікриновою кислотою та кислим фуксином за Новеллі. Гістологічні препарати вивчали візуально і морфометрично. Вимірювали площу тромбів на поперечних зрізах вен. Виміри проводили на 8 гістологічних зрізах, отриманих з кожного експериментального зразка. Морфометрію проводили за допомогою дослідницького комплексу з мікроскопом Olympus BX51, цифрової камери Olympus C4040ZOOM, комп'ютера із програмним забезпеченням Olympus DP-Soft 3.2. Отримані цифрові дані оброблялися стандартними статистичними методами. Проведені дослідження показали, що через 2 доби після введення нитки у вени у всіх випадках навколо нитки спостерігались масивні червоні тромби, які закривали більшу частину просвіту 5 25201 вени, залишаючи по периферії тонку щілину від просвіту судини. Введення альтеплазе приводило до зменшення площі тромбу на поперечному зрізі вени у 3 рази, введення гепарину приводило до 6 зменшення площі тромбу більш ніж на 20%, інфузія альтеплазе разом з плазміногеном приводила до зменшення площі тромбу у 5 разів (Таблиця, креслення). Таблиця Площа тромбу через 2 й 3 доби після моделюванні флеботромбозу (контроль) та після проведення тромболізису за допомогою альтеплазе, комплексу альтеплазе плюс плазміноген та гепарину Контроль Площа тромбу (мм 2) 0,065±0,0021 2 доби Альтеплазе + Альтеплазе плазміноген 0,024±0,0065 0,013±0,0078 Гепарин Контроль 0,05±0,0016 0,057±0,002 Через 3 дні після початку досліду у всі х випадках навколо ниток виявляються масивні тромби, що закривають майже весь просвіт вени. У порівнянні з попереднім строком спостерігаються зміни якісного стану тромбів, а їх фрагменти з червоних переходять у білі. В ни х виявляється більш або менш щільна сітка волокон фібрину, серед яких зустрічаються дуже товсті. З боку інтими спостерігається продуктивна реакція, в ній збільшується кількість фібробластів. Іноді молода сполучна тканина починає проявляти тенденції до вростання у тромб. Через 3 дні після початку досліду у всі х випадках навколо ниток виявляються масивні тромби, що закривають майже весь просвіт вени. У порівнянні з попереднім строком спостерігаються зміни якісного стану тромбів, а їх фрагменти з червоних переходять у білі. В ни х виявляється більш або менш щільна сітка волокон фібрину, серед яких зустрічаються дуже товсті. З боку інтими спостерігається продуктивна реакція, в ній збільшується кількість фібробластів. Іноді молода сполучна тканина починає проявляти тенденції до вростання у тромб. Введення альтеплазе через 3 доби після моделювання флеботромбозу приводить до зменшення площі тромбу на поперечному зрізі на третину, введення гепарину призводить до зменшення тромбу понад 10%, інфузія альтеплазе разом з плазміногеном приводить до зменшення площі тромбу більш ніж у 2 рази (Таблиця, креслення). Таким чином, проведені спостереження показали, що одночасне застосування альтеплазе та плазміногену забезпечує значне збільшення ефективності тромболі-зису у порівнянні із застосуванням окремо альтеплазе або гепарину. Джерела інформації: 1. Oger E. Incidence of venous thromboembolism in a community-based study in western France // Thromb Haemost. - 2000. - v.83. - p.657-60. 2. Modam B, Sharon E, Jelin W. Factors contributing to the incorrect diagnosis of pulmonary embolism // Chest. - 1972. - v.62. - p.388-93. 3. Morpurgo M, Schmid C. Clinico-pathological correlations in pulmonary embolism. A prospective evaluation // Prog Respir Res. - 1980. - N.13. - p.815. 3 доби Альтеплазе ± Альтеплазе плазміноген 0,037±0,0017 0,024±0,0005 Гепарин 0,049±0,002 4. Dalen J.E. Pulmonary embolism - what have we learned since Virchov Natural history, pathophysiology and diagnosis // Chest/ - 2002. - N122. p.1440-1456. 5. The Columbus Investigators. Low molecular weight heparin in the treatment of patients with venous thromboembolism // N Engi J Med.-1997.-v. 337.-p.657-62. 6. Simonneau G, Sors H, Charbonnier S for the THESEE study group. A comparison of low molecular weight heparin with unfractionated heparin for acute pulmonary embolism // N Engi J Med. - 1997. - v.337. - p.663-9. 7. Dalen J.E, Banas JS, Brook FOC, et al. Resolution rate of acute pulmonary embolism in mice // N EnglJ Med. - 1969. - v.280. - p.1194-99. 8. Arcasoy S.M, Kreit JW. Thrombolytic therapy for pulmonary embolism-a comprehensive review of the current evidence // Chest. - 1999, - v.115. p.1695-707. 9. Alpert J.S, Smith R, Carlson J, et al. Mortality in patients treated for pulmonary embolism // JAMA. 1976. - v.236. - p.1477-80. 10. Perler B. Thrombolytic therapies: the current state of affairs // J Endovasc Ther. -2005. - Vol.3, N12. - p.224-232. 11. Kasper W, Konstantinides S, Greibel A, et al. Prognostic significance of right ventricular afterload stress detected by echocardiography in patients with clinically suspected pulmonary embolism // Heart. 1997.v.77. - p.346-9. 12. Мішалов В.Г., Грабовий О.М., Миргородський Д.С., Тодуров Б.М. Спосіб моделювання флеботромбозу. №14749. МПК G09B23/28 (2006.01) 13. Bottiger BW, Bode С, Kern S. Efficacy and safety of thrombolytic therapy after initially unsuccessful cardiopulmonary resuscitation: a prospective clinical trial // Lancet-2001. - v.357. - p.1583-5. 14. Pineda LA, Hathwar VS, Grant BJ. Clinical suspicion of fatal pulmonary embolism // Chest. 2001. -v.120. - p.791-5. 15. Konstantinides S, Geibel A, Heusel G, et al. Heparin plus alteplase compared with heparin alone in patients with sub massive pulmonary embolism //NEJM. - 2002. - v.347. - p.1143-50. 16. Meneveau N, Schiele F, Vuillemenot A, et al. Streptokinase versus alteplase in massive PE: a randomized trial assessing right heart haemodynamics 7 25201 and pulmonary vascular obstruction // Eur Heart Jl. 997. -v.18. - p.1141-48. 17. Meneveau N, Schiele F, Metz D, et al. Comparative efficiency of a 2 hour regimen of Streptokinase versus alteplase in acute massive pulmonary embolism: immediate clinical and Комп’ютерна в ерстка В. Мацело 8 haemodynamic outcomes and one year follow up // J Am Coil CardioL-1998.-v.31. - p.1057-63. 18. Goldharber S, Heit S, Sharma GVRK et al. Randomized controlled trial of recombinant tissue plasminogen activator versus urokinase in treatment of acute pulmonary embolism. Lancet 1988; 2:293298. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601