Профілактичний біопрепарат субалін

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно: к биопрепаратам, предназначенным для ингибирования развития патогенных бактерий и вирусов. В настоящее время имеются биопрепараты, подавляющие развитие патогенных бактерий - лакто-; бифидум-; колибактерин, бификол, бактисубтил, бактерин-СЛ [1 - 4]. Известны также штаммы бацилл, вызывающие синтез эндогенного интерферона [5], однако с невысоким титром продуцируемого интерферона. Однако не известны биопрепараты, эффективные при вирусных инфекциях. Наиболее близким аналогом рассмотрен препарат бактерин-СЛ [4]. В основе этого биопрепарата - 2 культуры аэробных спорообразующих бактерий - B.subtilis и B.licheniformis. Препарат характеризуется высокой эффективностью при дисбактериозах, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами, однако не обладает выраженной антивирусной активностью. Целью настоящего изобретения является создание биопрепарата, обладающего одновременно антибактериальной и антивирусной активностью, а также способностью индуцировать в организме синтез gинтерферона. Поставленная цель достигается тем, что в качестве основы биопрепарата используют рекомбинантный штамм B.subtilis ВКПМ B-4759 (положительное решение по заявке №4836055/13/063118 от 07.06.1990), характеризующийся высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также антивирусной за счет продукции интерферона человека типа a-2. Рекомбинантный штамм, используемый в качестве основы биопрепарата, должен характеризоваться стабильностью введенной плазмидной ДНК при пассировании культуры через организм. Исследование стабильности плазмидной ДНК в штамме B.subtilis ВКПМ B-4759 проводили на белых мышах массой 18 - 20г. В опыт отбирали животных, у которых в предварительных исследованиях не высевались из фекалий бактерии рода Bacilius. Животным вводили перорально по 1 дозе препарата. Через 18 часов проводили высев микрофлоры фекалий на МПА. Выросшие изолированные колонии B.subtilis перекалывали на МПА с канамицином и без антибиотика на нитроцеллюлозный фильтр для подсчета количества клонов, потерявших рекомбинантную плазмиду. Из культуры, выросшей на МПА готовили суспензию в физиологическом растворе и вводили повторно животным перорально. Через 18 часов повторяли процедуру выделения B.subtilis и определения количества клонов, утративших плазмиду. Было проведено 10 пассажей культуры через организм. Из случайно отобранных клонов, полученных после 10 пассажей через организм, выделяли плазмидную ДНК и анализировали с помощью эндонуклеаз рестрикции. Установлено, что плазмидная ДНК стабильно сохраняется и наследуется в течение 10 пассажей через организм животных. Сохранность гена интерферона человека типа a2 в рекомбинантной плазмиде после пассажей через организм подтверждали методом гибридизации. Фильтры с отпечатками колоний после пассажей гибридизировали с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона типа a2, выделенным из плазмиды. Установлено, что все клоны, не потерявшие рекомбинантную плазмиду после пассажей через организм, гибридизировались с меченым фрагментом, содержащим ген интерферона, что свидетельствовало о сохранности гена интерферона типа a2 в составе плазмиды. Препарат содержит в качестве основы живые клетки B.subtilis ВКПМ B-4759 и наполнитель (в об.%). Биомасса B.subtilis ВКПМ B-4759 1 × 109 - 1 × 1010 живых микробных клеток в 1мл физиологического раствора 92 - 98 Наполнитель 8-2 Необходимость наполнителя обусловлена его защитным действием для бактериальных клеток при дальнейшем лиофильном высушивании препарата. В качестве наполнителя препарат может содержать сыворотку крови, молоко и т.д., предпочтительно сахарозожелатиновую смесь (4% сахарозы, 1% желатины). Препарат характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов (табл.1). Антивирусную активность препарата определяли по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита мышей (ЕМС). Установлено, что препарат характеризуется антивирусной активностью в отношении КМС за счет синтеза интерферона типа a2, уровень которого составлял 2 × 105 - 5 × 105МЕ/л. Изучали также уровень содержания интерферона в организме мышей, получавших препарат. Для этого препарат вводили перорально мышам 1 раз в день в течение 3 дней из расчета 1 доза/кг веса. Уровень содержания a- и g -интерферона в сыворотке крови мышей исследовали через 24 часа после одно-, двух- и трехразового введения препарата. За титр интерферона принимали величину, обратную разведению исследуемой сыворотки, вызывающему 50% защиты клеток диплоидных фибробластов мыши Л-929 от 100 ЦДД50 тест-вируса ЕМС. Результаты представлены в табл.2, из которой видно, что при трехкратном пероральном введении препарата регистрируются максимальные уровни продукции как a-, так и gинтерферона. Такие уровни содержания интерферона в крови по данным литературы обеспечивают выраженный антивирусный эффект. Препарат характеризуется безвредностью для животных (табл.3). Пример 1. На основе штамма B.subtilis ВКПМ B-4759 с типичными морфологическими, культуральными, биохимическими свойствами приготовлены пять вариантов препарата с различным содержанием микробных клеток в составе препарата. Вариант I. Препарат, содержащий (в об.%) Биомасса B.subtilis ВКПМ B-4759 0,5 × 108 живых микробных клеток в 1мл физиологического раствора 92 Наполнитель (сыворотка-крови КРС) 8 Вариант II. Биомасса B.subtilis ВКПМ B-4759 1 × 109 живых микробных клеток в 1мл физиологического раствора 94 Наполнитель (молоко) 6 Вариант III. Биомасса B.subtilis ВКПМ B-4759 5 × 109 живых микробных клеток в 1мл физиологического раствора 95 Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатина) 5 Вариант IV. Биомасса B.subtilis ВКПМ B-4759 1 × 1010 живых микробных клеток в 1мл физиологического раствора 97 Наполнитель (сыворотка крови КРС) 3 Вариант V. Биомасса B.subtilis ВКПМ B-4759 5 × 1010 живых микробных клеток в 1мл физиологического раствора 98 Наполнитель (4% сахарозы + 1% желатины) 2 Изготовленные варианты препарата разливали в стерильные ампулы, высушивали лиофильно, ампулы запаивали. Проверяли безвредность полученных вариантов препарата для лабораторных животных, специфическую активность в отношении тест-культур - представителей различных групп патогенных и условно патогенных микроорганизмов, а также продукцию интерферона типа a2. Для определения безвредности содержимое ампулы разводили в 0,5мл физиологического раствора и вводили эту дозу перорально мыши. Для каждого варианта препарата использовали не менее 10 мышей массой 18 - 20г. Препарат считали безвредным, если все мыши оставались живыми в течение пяти суток наблюдения. Для определения специфической активности исследовали антагонистическую активность вариантов препарата в отношении тест-культур. Исследование осуществляли методом отсроченного антагонизма. Для этого содержимое ампулы растворяли в 1мл физиологического раствора. Полученную взвесь высевали петлей в центре чашки Петри с агаризованной средой Гаузе №2. Посевы инкубировали в термостате при 37°C в течение 72 часов. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500-миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18 часов инкубирования при 37°C по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе №2 без исследуемой культуры. Полученные данные результатов испытания вариантов препарата представлены в табл.4. Как видно из представленных в таблице данных, оптимальные количества живых микробных клеток B.subtilis ВКПМ B-4759 в 1мл физиологического раствора составляют 1 × 109 - 1 × 1010 клеток при их объемном содержании 92 - 98%. Дальнейшее увеличение количества микробных клеток не изменяют существенным образом специфическую активность препарата в отношении тест-культур микроорганизмов. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что исследованные варианты препарата безвредны для животных, характеризуются антагонистической активностью в отношении тест-культур, а также способностью продуцировать интерферон типа a-2. Поэтому предлагаемые количественные характеристики живых микробных клеток в препарате экспериментально подтверждаются. Источники информации 1. Медицинские аспекты микробной экологии. - М., 1991. - С.222. 2. Блохина И.Н., Дорофейчук В.Г. Дисбактериозы. - Л., 1979. - С.387. 3. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека. Автореф. дисс. ... д-ра биол. наук. - М., 1982. 4. Смирнов В.В. и др. Спорообразующие аэробные бактерии - продуценты биологически активных веществ. - К., 1982. - С.280. 5. Авторское свидетельство СССР №1311243, кл. C12N1/00, 1982.