Спосіб генетичної ідентифікації штаму гомобазидіальних грибів

Спосіб генетичної ідентифікації штаму гомобазидіальних грибів, заснований на тестуванні біологічних властивостей чистих культур, який відріз няється тим, що ідентифікують гени мультиалельної системи статевої несумісності, для чого розщеплюють досліджуваний дикаріотичний штам на дві гаплоїдні культури, зхрещують отримані гаплонти з тестерними гаплонтами базисного штаму, визначають позитивний наслідок схрещування за ознакою утворення дикаріотичного міцелію з пряжками, при цьому досліджуваний та базисний штами є ідентичними, якщо частота схрещування їх гаплонтів у видів з біполярною системою статевої несумісності становить 50%, а у видів з тетраполярною системою статевої несумісності – 25%. (13) 28162 (11) UA штамів споживного культурального гриба глива звичайна [3]. Однак, недоліком даного методу являється мінливість ізоферментних спектрів грибів в залежності від віку культури [3] або така, яка пов'язана з проявом біоритмів, що у базидіальних грибів проявляється у сезонспецифічності ізоформ деяких ферментів [4]. Така варіабельність ізоферментних спектрів приводить до того, що цей показник частіше використовують для визначення границь між окремими видами, наприклад у роді Agaricus [5], ніж для діагностики штамів. Суть пропонованого винаходу полягає у використанні для розмежування різних штамів одного виду гомобазидіального гриба, або встановлення їх ідентичності, таких незмінних сталих ознак, як наявність окремих генів мультиалельної системи статевої несумісності, комбінація яких є штамоспецифічною. Для ідентифікації специфічних генів мультиалельної системи статевої несумісності розщеплюють досліджуваний дикаріотичний штам на дві гаплоїдні культури та схрещують отримані гаплонти з тестерними гаплонтами базисного штаму. Позитивний наслідок схрещування кожної пари гаплонтів визначають за ознакою утворення дикаріотичного міцелію з пряжками в зоні контакту колоній гаплонтів, при цьому досліджуваний та базисний штами є ідентичними, якщо частота схрещування їх гаплонтів у видів з біполярною системою статевої несумісності становить 50%, а у видів з тетраполярною системою статевої несумісності 25%. (19) Винахід відноситься до біотехнології, а саме до способів визначення ідентичності міцеліальних культур, зокрема, гомобазидіальних грибів. Визначення видової приналежності гомобазидіоміцетів базується переважно на ознаках побудови плодового тіла грибів. Ідентифікація культур цих грибів базується на комплексі ознак макро- і мікроморфології, ферментативній активності міцелію (макрохімічні кольорові реакції) і лінійній швидкості росту колонії. Сукупність цих показників, однак, не являється надійним критерієм для розмежування видів базидіальних грибів, наділених на відміну від інших груп грибів досить однотипною структурою вегетативного міцелію [1, 2]. Наявні ключі для ідентифікації культур деяких дереворуйнівних афілофоральних грибів в багатьох випадках дозволяють провести визначення тільки до роду або один опис відповідає групі близьких видів [1, 2]. Аналогічні ключі для агарікальних грибів не опрацьовані. Відсутність надійних видових, а тим більше штамоспецифічних культуральних ознак гомобазидіальних грибів підкреслюють хемотоксономічні підходи в систематиці цієї групи грибів, базуються на визначені ізоферментних спектрів методом гель-електрофореза. При вирішенні завдання розмежування штамі в гомобазидіальних грибів найбільш близьким за технічним рішенням суті винаходу (прототип) являється спосіб визначення ізоферментного складу глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, зокрема, показана різниця за даним показником для чотирьох A ___________________________________ 28162 Порівняння даного рішення з прототипом виявляє відповідність його змісту критерію "новизна". При вивченні інших відомих рішень в даній галузі, ознаки, які б не відрізняли заявлюваний винахід від прототипу, не були виявлені, тому біотехнологічне рішення, яке пропонується, відповідав критерію "суттєві відмінності". Приклад 1. Треба визначити ідентичність двох штамів гомобазидіального гриба, який має біполярну систему статевої несумісності Спори з базидіоспорового відбитку Phlebia merismoides Fr. суспензують в стерильній водопровідній воді і готують з неї в малих хімічних пробірках з 5 мл стерильної водопровідної води 3-5 послідовних розведень 1:10. Розбавлену суспензію базидіоспор висівають по 0,5 мл у чашки Петрі на агаризоване пивне сусло (8% с.р., рН-5, 5) і рівномірно розподіляють на поверхні агару мікробіологічною петлею або шпателем. Через 24 години чашки поміщають під світловий мікроскоп з об'єктивом х10 і находять проросшу спору. Переконавшись у відсутності у полі зору інших пророслих або непророслих базидіоспор, виводять знайдену пророслу спору до центру поля зору мікроскопу і повністю закривають діафрагму поля мікроскопа. При цьому у товщині агару висвічується світовий стовпчик, на вершині якого находиться потрібний проросток. Повертають в сторону револьвер з об'єктивом і вирізають з чашки агаризований стовпчик зі спорою обрізаною медичною голкою з заточеними краями. Діаметр голки підбирають меншим за поле зору мікроскопа, але більше діаметра світлового пучка при закритій полевій діафрагмі. Повертають об'єктив у початкове положення і контролюють точність вирізу спори. Медичну голку приєднують до стерильного шприца і видувають агаровий стовпчик з пророслою спорою до чашки Петрі зі свіжим сусло-агаровим середовищем [6]. На одну чашку розміщують близько десяти виділених спор. Виросші колонії мікроскопують і ті, які не мають пряжок, відсівають на скошений агар у пробірки. Відбір комплементарних гаплонтів проводять на сусло-агаровому середовищі в чашках Петрі, розташовуючи тестуючі пари гаплонтів на віддалі 2 см один від одного. У випадку міцеліального контакту двох колоній, через 7-10 діб мікроскопують міцелій, який утворюється у зоні контакту і за наявністю пряжок відмічають такі кроси позитивною позначкою (табл. 1). Виявлені групи гаплонтів протилежного типу спарування маркірують (довільно) як групу з A1 и А2 фактором несумісництва. Кожна з гаплоїдних культур даної групи може бути тест-культурою для сконструйованого дикаріона. Наприклад, для дикаріона, компанованого з гаплонтів 2 і 7, які відрізняються від інших дикаріонів найвищою целюлазною активністю, як середник тест-культур даного дикаріотичного штаму можуть використовуватись не тільки гаплонти № 2 і № 7, але і інші гаплонти, які несуть A1 і А2 фактори статевої несумісності. Для визначення ідентичності дикаріотичного штаму P.merismoides складеного з гаплонтів 2 і 7 з іншими дикаріотичними штамами цього виду проводять розщеплення досліджуваного штаму на два гаплонти. А - вихідна таблиця схрещувань 8-ми гаплонтів; Б - перетворена таблиця схрещувань; "+" культури сумісні, які утворюють дикаріотичний міцелій з пряжками; "-" - культури несумісні, контакт гіф і утворення дикаріона не відбувається. Для цього міцелій досліджуваного штаму вносять до колби Ерленмейєра ємністю 0,5 л, за вмістом 0,15 л стерильного рідкого пивного сусла 4% с.р., рН 5,5. Вирощування проводять при температурі 25°С у стаціонарних умовах. Вирощену біомасу відділяють від культуральної рідини, переносять у склянку гомогенізатора, доводять до контрольної мітки стерильною водопровідною водою і роздрібнюють при 10 тис. оборотах в хвилину протягом 5 хв. Гомогенат містить фрагменти міцелію довжиною не більше 500 мкм, які складаються з декількох клітин гіфи. Одержаний гомогенат розводять стерильною водопровідною водою у співвідношенні 1:100 і використовують як інокулюм (0,5 мл) на 50 мл середовища такого складу, г/л: глюкоза - 20,0, гліцин - 5,0, м'ясний пептон - 10,0 [7]. Середовище такого складу стерилізують в колбах Ерленмейєра місткістю 0,5 л 15 хв. при тиску пари 0,1 мПа. З мірою росту глибинних кульок міцелію періодично проводять мікроскопіювання периферійних гіф на наявність пряжок через 7-10 діб вирощування на качалці, коли міцеліальні кульки досягають розмірів 2-4 мм і більшість з них не буде мати периферійних дикарістичних гіф, біомасу відділяють від середовища і проводять повторну гомогенізацію у згаданому вище режимі. Одержаний гомогенат розводять стерильною водопровідною водою 1:10 і висівають по 0,5 мл на агаризоване пивне сусло в чашки Петрі. Виросші колонії перевіряють під мікроскопом на відсутність пряжок і відсівають як об'єкт досліджуваних гаплонтів. Один з довільно виділених гаплонтів схрещують з 5-6-тью іншими гаплонтами або з великим числом до тих пір, доки не виявиться комплементарний гаплонт, який формує динарі етичний міцелій. Вибрані два комплементарних гаплонта досліджуваного штаму схрещують з тесторними гаплонтами базисного штаму. Якщо частота схрещування між ними рівна 50%, тоді зрівнюванні дикаріотичні штами ідентичні. При всіх інших значеннях частоти схрещування дикаріотичні штами іменують різне походження (табл. 2). A - фактор системи статевої несумісності; "+" гаплоїдні культури сумісні, які утворюють дикаріотичний міцелій; "-" - культури несумісні, контакт гіф і утворення дикаріону не відбувається. Приклад 2. Потрібно визначити ідентичність двох гаплонтів, які мають тетраполярну систему статевої несумісності. Виділяють гаплонти Pleurotus ostreatus (Fr.)Kumm. з базидіоспор, як це описано у прикладі 1. Для виділення тестерних гаплонтів проводять схрещування 14-16 культур, виділених з базидіоспор, як це описано в прикладі 1 (табл. 3). "+" - культури сумісні; "-" - культури несумісні. Виявлені групи гаплонтів противостатевого типу спарування маркують (довільно) як групи з A1B1, A2B2, A1B2 і A2B1 факторами несумісності. В кожній групі з чотирьох типів спарування вибирають одну гаплоїдну культуру як тестерну. Наприклад, підібрані гаплонти 3, 6, 5, 12 і з перших двох складено динаріотичний штам 36. Для визначення ідентичності дикаріотичного штаму 36 з іншим дикаріотичним штамом цього ви 2 28162 ду здійснюють розщеплення досліджуваного штаму на два комплементарних гаплонта, як це описано у прикладі 1. Ці два гаплонти схрещують з тестерними гаплонтами базисного штаму. Якщо частота схрещування між ними дорівнює 25%, тоді порівняльні дикаріотичні штами ідентичні. При загально інших значеннях частоти схрещування дикаріотичні штами мають різне походження (табл. 4). "+" - культури сумісні, при яких утворюється міцелій з пряжками; "-" - культури несумісні, контакт гіф і утворення дикаріону не відбувається. Таким чином, пропонований спосіб генетичної ідентифікації штаму гомобазидіальних грибів може бути реалізований на підставі загальновизначених мікробіологічних процесів маніпуляцій з культурами грибів, при чому експресія унікальних генів системи статевої несумісності схрещуваних гаплонтів визначається за морфологічним маркером (пряжці) на гіфах міцелію методом світлової мікроскопії. Практична реалізація винаходу створює засади для вирішення проблеми захисту права інтелектуальної власності при реалізації ліцензій на штами вищих базидіальних грибів і способи їх використання. Джерела інформації 1. Nobles М.К. Identification of cultures of wood inhabiting Hymenomycetes // Can. I. Bot. - 1965. - 33, № 1 - P. 1097-1139. 2. Stalpers I.A. Indentification of wood - inhabiting fungi in pure culture // Studies in mycology. - Baarn, 1978. - № 16. - P. 1-248. 3. Дудченко Л.Г. Динамика активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и изменчивости ее изоформ в мицелии некоторых базидиальных грибов // Укр. ботан. журнал. - 1981. - 38, № 3. С. 21-27. 4. Дудченко Л.Г. Биохимическое проявление биоритмов // Укр. ботан. журнал. - 1978. - 35, № 6. - С. 585-591. 5. Kerrigan R.W., Ross I.K. Extracellular laccases: biochemical markers for Agaricus sustematics // Mycologia. - 1988. - 80, № 5. - P. 689-695. 6. Решетников С.В. Простой метод получения моноспоровых культур под микроскопическим контролем // Укр. ботан. журнал. - 1987. - 44, № 3. С. 81-82. 7. Lеаl-Lara Н., Eger-Hummel G.A. Monocaryotisation method and its use for. genetic studies in wood - rotting Baeidiamycetes // Theor. Appl. Genet. 1982. - 62, № 1. - P. 65-68. Таблиця 1 1 + + + 2 + + + + + 1 + + + Визначення комплементарних гаплонтів P.merismoldes А 3 4 5 6 7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Б 4 7 8 5 2 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 3 + + + 8 + + + 1 2 3 4 5 6 7 8 6 5 2 6 1 3 4 7 8 А1 А2 Таблиця 2 Варіанти схрещування тесторних гаплонтів базисного дикаріона Phlebia meriemoіdes з гаплонтами дикаріонів, які мають різні алеї спарування Штам , ідентичний з базисним Тестерні гаплонти базисного дикаріону Частота схрещування шт. 2А1 А1 А2 + шт. 7А2 + Штам має одну загальну алель з базісним А1 А2 + + 50% + 75% 3 Штам має обидві алелі, які відрізняються від базисного А3 А4 + + + + 100% 28162 Таблиця 3 Визначення комплементарних гаплонтів P.ostreatus А1В1 А2В2 А1В2 А2В1 2 6 8 10 13 1 4 11 14 5 9 7 12 1 + + + + + 3 + + + + + 4 + + + + + 11 + + + + + 14 + + + + + 2 + + + + 6 + + + + 8 + + + + 10 + + + + 13 + + + + 7 + + 12 + + 5 + + 9 + + Таблиця 4 Варіанти схрещування тестерних галлонтів базисного дикаріону № 6 A1B1 Тестерні гаплонти базис№ 3 А2В2 ного дина№ 5 A1B2 ріону № 6 A1B2 Частота схрещування Штам, ідентичний з базисним A1B2 А2В2 + + 25% Штам відрізняється однією алелею A1B1 A3B2 + + + 37,5% Штам не має загальних алелей з базовим A3B3 A4B4 + + + + + + + + 100% __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4