Спосіб діагностики новоутворень

Изобретение относится к медицине и фармакологии. Оно включает набор лектинов - биологически активных веществ рецепторного типа действия, впервые выделенных авторами из лекарственных растений. Изобретение касается способа оценки различий интенсивности и специфичности реакций рецептор-лектин у здорового организма и при злокачественной трансформации. Может быть использовано в здравоохранении для целей диагностики. Известно, что малигнизация приводит к количественным и качественным изменениям рецепторного аппарата клетки. Это позволило выделить рецепторы лектинов в отдельный класс гистологических маркеров, используемых для выявления раковых клеток. Обычно в гистохимических исследованиях лектин соединяют с меткой (радиоактивными изотопами, частицами коллоидного золота, гемоцианином, пероксидазой хрена, флуоресцирующими красителями и др.), а затем инкубируют с исследуемым материалом для уточнения гистогенеза новообразований, исследования гетерогенности клеточных популяций в составе опухоли, а также для картирования топографических различий в мембранах нормальных и злокачественно трансформированных клеток. Известен способ диагностики онкозаболеваний, основанный на поиске с помощью лектинов таких изменений состояния рецепторов на поверхности изолированных клеток периферической крови, которые коррелируют с развитием злокачественного процесса [1]. По известному способу диагностику проводят следующим образом. Используют коммерческие препараты пектинов шести наименований, выделенные из тетрагонолобуса, арахиса, сои, шампиньона, зародышей пшеницы и вики черной, в виде коньюгатов с флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ). Стоимость препаратов на мировом рынке составляет от 20 до 40$ за 1 мг. В качестве модели используют субпопуляцию лимфоцитов периферической крови, а именно, мо-нонуклеары, которые выделяют с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности фикола. Стандартизованную взвесь мононуклеаров плотностью 1*10^6 инкубируют с 5 мкг лектина в течение 30 мин при 4°С. Затем клетки трижды отмывают забуференным изотоническим раствором, готовят препарат и анализируют его с помощью лю-минисцентного микроскопа. По интенсивности люминисценции судят о числе клеток, присоединивших лектин, выраженном в % от общего числа клеток. Вывод о характере и достоверности наблюдаемых различий делают путем сравнения по критерию Стьюдента средних значений числа клеток, взаимодействующи х с каждым отдельным пектином, полученных для гр уппы пациентов из 20-27 чел и соответствующей гр уппы здоровых лиц. Однако известный способ имеет ряд ограничений, затрудняющих его широкое применение. Использование в качестве модели субпопуляции лимфоцитов отличается методической сложностью и требует дорогостоящего оборудования и реактивов. Этот способ показал хорошие результаты при диагностике множественной миеломы, но оказался малоэффективным в случае раковины опухолей желудка и тонкого кишечника, что может быть связано с применением небольшого набора препаратов пектинов, специфичных в отношении некоторых типов новообразований. Задача заявляемого изобретения -усовершенствование способа диагностики новообразований, путем применений большого набора лектинсодержащих экстрактов из лекарственного сырья увеличивается точность регистрации изменений состояния рецепторного аппарата клетки, коррелирующих с развитием онкозаболевания. Использованием в качестве модели эритроцитов периферической крови в тесте прямой гемагглютинации достигается упрощение процедуры диагностики. Вычисление интегрального показателя суммарной агглютинации со всеми 24 пектинами, составляющими набор, обеспечивает сравнительную количественную оценку результатов диагностики. Это позволяет выявлять общие тенденции, несмотря на индивидуальные колебания активности взаимодействия отдельных пектинов с эритроцитами больных. Поставленная задача решается тем, что проводят реакцию агглютинации эритроцитов больного с набором из 24 пектинов, полученных из березы белой (Betula alba), боярышника (Grataegus monogyna), бузины черной (Sambucus nigra), вахты (Men yanthes irlfollata), будры плющевидной (Glechoma hederacea), ежевики (Rubus caeslus), зверобоя (Hyperlcum petforatum), земляники (Fragaria vesca), змеевика (Polygonum bistorta). календулы (Calendula offlclnalls), кукурузы (Zea mays), хурмы восточной (DIospyros kaki), мать-и-мачехи (Tussllago farfara), мяты (Meptha piperita), ольхи (AInus glutlnosa), крапивы (Unica dioica), подорожника (Plantago major), пустырника (Leonurus cardiaca), спорыша (Polygonum aviculare), сушеницы (Gnaphallum ullginosum), тысячелистника (AcNIlea millefolium), шалфея (Salvia officinalis), хво ща (Eguisetum arvense), эвкалипта (Eucaliptus globulus), подсчитывают суммарную агглютинацию и при снижении показателя суммарной агглютинации на 30-60% по сравнению со здоровыми диагностируют новообразование. Способ осуществляется следующим образом. Для приготовления экстрактов, содержащих пектины, высушенное и тщательно измельченное лекарственное сырье экстрагируют 0.9% раствором хлорида натрия (физиологический раствор). Соотношение сырья и экстрагента 1:8-1:10. Экстракцию проводят при 37°С 2 ч при помешивании, центрифугир уют при 3000 об/мин 15 мин, затем надосадок фильтруют. Этанольное фракционирование пектинов проводят при рН 4,5-5,5 прибавляя к водно-солевому экстракту этанол при температуре 0°С. Малоактивные белки, осаждаемые при 20%-н6м спиртовом насыщении, отбрасывают. Белки, осаждаемые при 36-70%-ной концентрации этанола, растворяют в физиологическом растворе и используют для постановки реакции гемагглютинации, при дальнейшем Изложении: раствором пектинов. Фиксированные объемы растворов пектинов (0,05 мл) помещают в лунки иммуноло-гического планшетас полукруглым дном и готовят серию их двухкратных последовательных разведении. Затем в каждую лунку добавляют 0,05 мл 2 %-ной суспензии трижды отмытых эритроцитов и выдерживают 60 мин при t 25 С. Оценку гемагглютинирующей способности пектинов ведут визуально по балльной системе в соответствии с формой осадка эритроцитов: 3 балла - интенсивная агглютинация. Эритроциты в виде тонкой пленки распределяются по всему дну лунки, иногда образуя фигур у с завернутыми краями, которая квалифицируется как "зонтик"; 2 балла умеренная агглютинация. Эритроциты расходятся от центра лунки на расстояние, превышающее в диаметре 2 мм, образуя кольцо с выраженной зернистостью по краям; 1 балл - слабая агглютинация. Эритроциты расходятся от центра лунки на расстояние менее 2-х мм, образуя колечко или диск. О баллов - отсутствие агглютинации. Эритроциты компактно оседают в центре лунки. Для сравнительной количественной оценки интенсивности гемагглютинации эритроцитов больных и доноров при взаимодействии с растворами пектинов лекарственных растений вычисляют два показателя: видовая интенсивность агглютинации (1) -интенсивность агглютинации эритроцитов с пектинами одного вида лекарственного растения, суммированная по всемразведени-ям: суммарная интенсивность агглютинации (N= 2 1) - интенсивность агглютинации эритроцитов донора или больного со всем набором лектинсодержащих растворов, полученных из 24 лекарственных растений. Сравнивают значения 1 и N у обследуемого лица или группы лиц с условным этанолом, которым служат соответствующие показатели для группы доноров. О достоверности различий судят по критерию Стьюдента. Пример. Группа пациентов урологического отделения проходила обследования по предлагаемому способу, именуемому лектинотест, после чего результаты сопоставлялись с клиническими диагностиками. Предлагаемый способ, также как прототип, является сравнительным. Предпочтительно с помощью лектинотеста была обследована группа доноров станции переливания крови в количестве 76 чел, получены средние значения видовой и суммарной интенсивности гемагглютинации по ранее указанной балльной системе. В отличие от известного способа, где характер реакции с каждым из препаратов пектинов рассматривался отдельно от других, предлагаемый способ опирается на показатель суммарной агглютинации - N со всеми пектинами, входящими в набор, величина которого у доноров колеблется вокруг среднего значения - 210 баллов. У пациентов урологического отделения, обследованных по предлагаемому способу, отмечались значительные индивидуальные колебания значений интенсивности реакции гемагглютинации с отдельными пектинами. Тем не менее, использование показателя суммарной агглютинации с большим набором препаратов лектиноа позволяет выявить общую тенденцию к снижению активности взаимодействия эритроцитов с пектинами при развитии новообразования на 30% и более по сравнению с донорами (больные N 1-4). У больных с неонкологическим диагнозом показатель суммарной агглютинации либо не отличался от уровня доноров, либо превышал его. Таким образом, предлагаемый способ позволяет выявить новообразование в тех случая х, когда известный способ не является результативным, что подтверждает его большую точность. Результаты представлены в таблице. Диагностическая ценность способа подтвердилась для новообразований с различной локализацией (рак легкого, рак желудка, рак простаты), что свидетельствует о его большей универсальности по сравнению с известным способом. Данные приведены на графике. Установлено 80-90% совпадение результатов по заявляемому способу и клинических исследований. На чертеже представлены ранжированные ряды по признаку "Суммарная интенсивность агглютинации" эритроцитов доноров и эритроцитов онкологических больных с пектинами 24 лекарственных растений. Для сравнительного анализа показателей различных групп онкологических больных в сравнении с группой доноров и между собой применили непараметрический критерий знаков. Отправной момент анализа -построение вариационного ряда, ранжированного по убывающей, по показателям суммарной интенсивности агглютинации. Затем проводят сравнение попарно вариант, занимающих одинаковый порядковый номер в вариационном ряду показателей доноров и больных. Различия статистически достоверны, если 9 из 10 вариантов одного ряда превосходят (уступают) вариантам другого ряда. По горизонтали - порядковый номер обследуемого лица, присвоенный по рангу от больши х значений суммарной интенсивности гемагглютинации с набором пектинов из 24 лекарственных растений к меньшим. По вертикали - суммарная интенсивность гемагглютинации с пектинами 24 лекарственных растений в условных баллах - N. Каждая точка отвечает значению показателя N одного обследуемого лица.