Спосіб консервування тканин фетоплацентарного комплексу

Спосіб консервування тканин фетоплацентарного комплексу шляхом заморожування до -196°С у консервуючому середовищі, яке містить 10% диметилсульфоксида, який відрізняється тим, що середовище додатково містить 10% поліетиленоксиду молекулярної маси 400, а заморожування здійснюють спочатку зі швидкістю 1-2°/хв до 0°С, потім зі швидкістю 5-6°/хв до -10°С, далі витримують при -10°C 1,5-2 год, після чого занурюють у рідкий азот. (19) (21) 98062927 (22) 05.06.1998 (24) 15.12.2000 (33) UA (46) 15.12.2000, Бюл. № 7, 2000 р. (72) Грищенко Валентин Іванович, Юрченко Тетяна Миколаївна, Прокопюк Ольга Степанівна, Строна Віра Іванівна, Козлова Віра Пилипівна, Прокопюк Володимир Юрійович (73) ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАН УКРАЇНИ 30808 клітин на 46% вища, активність ЛДГ, МДГ, a-ГФДГ - на 80%, 25% і 22%, відповідно, вища ніж у прототипі і не відрізняється від показників нативних клітин. Приклад 5. Хоріальну оболонку плоду 1820 тижнів розвитку відмивали у фіз. розчині, фрагментували на шматочки розміром 3´5 см та інкубували 30 хв у середовищі 199, що містить 10% ДМСО і 10% ПЕО-400. Потім переносили до контейнера об'ємом 15 см 3, наповнений тим же середовищем і заморожували від кімнатної температури до 0°С зі швидкістю 1-2°/хв, потім до -10°С зі швидкістю 5-6°/хв, а після 1,5-2,0 годинної витримки занурювали у рідкий азот, де зберігали при -196°С протягом 1 місяця. Результати представлені в табл. 5 у порівнянні з даними, отриманими після консервування хоріальної оболонки за прототипом. 3 табл. 5 видно, що після консервування запропонованим способом кількість життєздатних клітин на 23% вища, а активність ЛДГ, МДГ і aГФДГ на 28%, 53% і 45%, відповідно, вища, ніж за прототипом і не відрізняється від нативних. Приклад 6. Вилочкову залозу після виділення обполіскували фізіологічним розчином кімнатної температури і занурювали на 30 хв у середовище 199, яке містить 10% ДМСО і 10% ПЕО-400. Потім переносили до пластикового контейнера об'ємом 15 см 3, наповненого таким же середовищем, і після 20 хвилин інкубації при 0°С заморожували зі швидкістю 5-7°/хв до -196°С. Розморожування здійснювали на водяній бані при 40-42°С. Результати представлені в табл. 6. З табл. 6 видно, що після заморожування залози в запропонованому середовищі, але за режимом прототипу, показники морфофункціонального збереження клітин є нижчими, ніж після заморожування за запропонованим режимом: кількість життєздатних клітин на 32%, активність ЛДГ - на 42%, МДГ на 38% і a-ГФДГ на 90%. Приклад 7. Вилочкову залозу після виділення обполіскували фізіологічним розчином кімнатної температури і занурювали на 30 хв у середовище Хенкса, що містить 10% ДМСО. Після цього її переносили до контейнера, наповненого таким же розчином, і охолоджували до 0°С зі швидкістю 12°/хв, потім до -10°С із швидкістю 5-6°/хв, витримували 1,5-2 год і занурювали у рідкий азот. Результати представлені в табл. 7. 3 табл. 7 видно, що після заморожування за запропонованим режимом, але в середовищі зa прототипом збереження клітин зменшується на 30%, активність ЛДГ - на 52%, МДГ - на 40%, aГФДГ - на 6%. Приклади 6, 7 свідчать про те, що тільки запропоноване сполучення середовища та режиму заморожування забезпечує досягнення високого морфофункціонального збереження тканин фетоплацентарного комплексу. Джерела інформації 1. Пат. України № 7862, А01N1/02, 1995. 2. Пушкарь Н.С., Белоус А.М., Цуцаева А.А. и др. Низкотемпературное консервирование костного мозга. – К.: Наук. думка, 1976. - С. 177. 3. Лилли Р. Патолистологическая техника и практическая гистология. - М.: Мир, 1969. - С. 354. нянні з даними, отриманими після консервування вилочкової залози за прототипом. З табл. 1 видно, що після консервування запропонованим способом кількість життєздатних клітин на 31% вища, активність ЛДГ, МДГ, a-ГФДГ на 77%, 42%, 7%, відповідно є вищою, ніж за прототипом, і не відрізняється від показників нативних клітин. Приклад 2. Селезінку отримували з плоду людини 18-20 тижнів розвитку, обполіскували фізіологічним розчином кімнатної температури, розсікали на 2 частини і після 30 хв експозиції в середовищі 199, що містить 10% ПЕО-400 і 10% ДМСО, вміщували до пластикового контейнера об'ємом 15 см 3, наповненого тим же середовищем. Заморожування здійснювали від кімнатної температури до 0°С із швидкістю 1-2°/хв, від 0°С до -10°С зі швидкістю 5-6°/хв, витримували при -10°С 1,52 год і потім занурювали в рідкий азот, де зберігали при -196°С протягом 1 місяця. Розморожування проводили на водяній бані при 40-42°С. Результати представлені в табл. 2 у порівнянні з даними, отриманими після консервування селезінки за прототипом. З табл. 2 видно, що після консервування запропонованим способом кількість життєздатнихклітин на 31% є вищою, а активність ЛДГ, МДГ і aГФДГ на 8%, 34% і 40%, відповідно, є вищою, ніж за прототипом і не відрізняється від показників нативних клітин. Приклад 3. Плаценту людини перфузували через пупкову вену фізіологічним розчином протягом 10 хв. Після цього її відмивали від елементів крові, готували фрагменти розміром 3´2 см, уміщували на 30 хв у середовище 199, що містить 10% ДМСО і 10% ПЕО-400, потім переносили до контейнера об'ємом 15 см 3, наповненого тим же середовищем. Заморожування здійснювали від кімнатної температури до 0°С зі швидкістю 1-2°/хв, потім до -10°С зі швидкістю 5-6°/хв і після 1,5-2 годинної витримки занурювали у рідкий азот, де зберігали при -196°С протягом 1 місяця. Результати представлені в табл. 3. у порівнянні з даними, отриманими після консервування плаценти за прототипом. З табл. 3 видно, що після консервування запропонованим способом кількість життєздатних клітин на 32% вища, а активність ЛДГ, МДГ і aГФДГ на 39%, 32% і 26%, відповідно, вища ніж за прототипом і не відрізняється від показників нативних клітин. Приклад 4. Тестис плоду 18-20 тижнів розвитку після виділення з оточуючи х тканин обполіскували у фізіологічному розчині, наносили 3-4 насічки на капсулу і 30 хв інкубували у середовищі 199, що містить 10% ДМСО і 10% ПЕО-400. Потім вміщували у контейнер об'ємом 15 см 3, наповнений тим же середовищем і після 30 хвилин витримки при кімнатній температурі, заморожували до 0°С зі швидкістю 1-2°/хв, потім до -10°С зі швидкістю 56°/хв, тримали при -10°С протягом 1,5-2 год і занурювали у рідкий азот, де зберігали при -196°С протягом 1 міс. Результати представлені в табл. 4 у порівнянні з даними, отриманими після консервування тестисів за прототипом. З табл. 4 видно, що після консервування запропонованим способом кількість життєздатних 2 30808 4. Авцин А.П., Струхов А.И., Фукс Б.В. Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии. - М.: Медицина, 1971. - С. 185. 5. Плохинский Н.А. Биометрия. – М.: Московский университет, 1970. - 175 с. Таблиця 1 Морфо функціональне збереження клітин тканини вилочкової залози після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Спосіб консервування нативна запропонований за прототипом Кількість життєздатних клітин 180,1±3,4 175,7±2,8* 134,3±1,7 ЛДГ 133,4±0,99 132,8±0,87* 75,0±0,67 Активність ферментів МДГ 53,7±0,83 54,1±0,15* 38,2±1,06 a-ГФДГ 9,4±0,3 9,3±0,4* 8,7±0,1 * - відмінності у порівнянні з прототипом достовірні, р>0,999 Таблиця 2 Морфо функціональне збереження клітин тканини селезінки після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Спосіб консервування Нативна Запропонований За прототипом Кількість життєздатних клітин 196,6±2,4 205,4±1,8* 156,3±2,9 ЛДГ 187,1±0,6 186,9±0,3* 176,5±1,0 Активність ферментів МДГ 64,4±0,9 63,4±0,3* 38,7±0,4 a-ГФДГ 11,8±0,6 12,0±0,1* 8,6±0,8 * - відмінності у порівнянні з прототипом є достовірними, р>0,999 Таблиця 3 Морфо функціональне збереження клітин тканини плаценти після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Спосіб консервування Нативна Запропонований За прототипом Кількість життєздатних клітин 88,1±2,2 86,4±1,4* 65,5±1,8 ЛДГ 169,3±0,60 168,9±0,32* 121,1±0,14 Активність ферментів МДГ 72,1±0,8 71,9±0,1* 54,5±0,5 a-ГФДГ 15,4±0,9 15,5±0,1* 12,3±0,5 * - відмінності у порівнянні з прототипом є достовірними, р>0,999 Таблиця 4 Морфо функціональне збереження клітин тканини тестису після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Спосіб консервування Нативна Запропонований За прототипом Кількість життєздатних клітин 84,2±1,0 85,1±0,3* 58,4-0,9 ЛДГ 111,3±0,81 110,9±0,42* 61,7-0,66 Активність ферментів МДГ 98,9±0,1 99,1±0,1* 79,3-0,7 * - відмінності у порівнянні з прототипом є достовірними, р>0,999 3 a-ГФДГ 16,4±0,7 16,9±1,0* 13,9-0,4 30808 Таблиця 5 Морфо функціональне збереження клітин тканини хоріальної оболонки після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Спосіб консервування Нативна Запропонований За прототипом Кількість життєздатних клітин 145,6±0,9 144,9±0,1* 117,4±1,0 ЛДГ 145,4±0,64 145,0±0,51* 113,1±0,71 Активність ферментів МДГ 98,3±0,6 97,9±0,1* 64,0±1,7 a-ГФДГ 6,5±0,4 6,4±0,1* 4,4±0,3 * - відмінності у порівнянні з прототипом є достовірними, р>0,999 Таблиця 6 Морфо функціональне збереження клітин тканини вилочкової залози після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Режим заморожування Запропонований По прототипу Кількість життєздатних клітин 174,9±1,2* 132,7±1,9 ЛДГ 132,9±0,57* 93,6±0,59 Активність ферментів МДГ 55,0±0,2* 39,9±0,88 a-ГФДГ 9,4±0,7* 8,6±0,4 * - відмінності у порівнянні з прототипом є достовірними, р>0,999 Таблиця 7 Морфо функціональне збереження клітин тканини вилочкової залози після консервування запропонованим способом і за прототипом (п=8) Середовище заморожування Запропонована За прототипом Кількість життєздатних клітин 175,0±1,5 135,1±2,0 ЛДГ 129,9±0,99 85,6±0,88 Активність ферментів МДГ 56,1±0,5 40,0±0,56 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4 a-ГФДГ 9,3±0,8 8,8±0,5