Спосіб тестування сполук природного походження на наявність у них антимутагенної та антиканцерогенної активності

Спосіб тестування сполук природного походження на наявність у них антимутагенної та антиканцерогенної активності за допомогою штаму Е.соlі 3000-1 - нестабільний MS2-індукований мутант Е.соlі АВ259 Hfr 3000, при цьому для вирощування вихідного мутантного штаму відбирають типову колонію без вищеплених на її U МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ 3 цьому для вирощування вихідного мутантного штаму відбирають типову колонію без вищеплених на її поверхні вторинних щільних колоній (сегрегантів), ресуспендують в рідкому LBсередовищі і розносять по пробірках, подаючи до кожної пробірки крім контролю по 0,1мл екстракту у водній формі, а в контрольну пробірку вносять 0,1мл фізіологічного розчину NaCl, культури нарощують на шуттелі три доби при кімнатній температурі при повільному коливанні, а потім висівають на LB-агаризоване середовище в різних розведеннях для одержання ізольованих колоній, обчислюють загальний титр культури та кількість щільних колоній (сегрегантів), яку виражають у відсотках по відношенню до загального титру і тестують здатність тестованої сполуки пригнічувати вищеплення сегрегантів із вихідної мутантної культури, за яким визначають антимутагенну та антиканцерогенну активність тестованої сполуки. Пропонований спосіб дозволяє створити умови для демонстрування спонтанного вищеплення клітин зі структурними змінами оболонки і разом з тим здатних до інтенсивнішого темпу розмноження, в тому числі на збіднених середовищах, порівняно з клітинами вихідного штаму. Ці ознаки були вибрані як такі, що відповідають основним характеристикам трансформованих клітин вищих організмів. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами, де на Фіг.1 показано накопичення біомаси вихідної культури та сегрегантів, а на Фіг.2 - вихід сегрегантів у присутності екстрактів U.victoris (1), R.rosea культ. (2), P.filicifolia (3), R.rosea нат. (4), R.luteum (5) та фізіологічного розчину (К) в умовах короткотривалого (3 доби) -  та довготривалого (21 доба) - вирощування. Відсоток сегрегантів вираховували від кількості колоній вихідної культури та сегрегантів, що виросли в посівах. Вихідний мутантний штам Е.соlі 3000-1 характеризується ознаками, що відповідають ознакам трансформованої вищої клітини на ранніх стадіях, коли вона ще не набула властивостей злоякісного росту, а демонструє властивості так званої ініційованої клітини [4], здатної через більш або менш довгий (тривалий?) проміжок часу вищепити агресивну неопластичну форму. Період, що передує вищепленню такої форми, вважається найбільш сприятливим для первинного запобігання появи клітин з ознаками злоякісного росту [4]. Пропонована нами бактеріальна тестсистема імітує багатостадійний мультифакторний механізм канцерогенезу від ініційованої клітини до неопластичної і дає змогу для відбору речовин, здатних запобігти вищепленню нових, більш агресивних форм. Цей же процес можна розглядати як вищеплення спонтанних мутантів, а речовини, що запобігають йому, як антимутагени. Таким чином, пропонована тест-система дає можливість скринінгу речовин з властивостями як антимутагенів, так і антиканцерогенів, дія яких направлена не на одну мутацію, а на каскад перетворень, що надають клітині ознак неопластичного росту. 30865 4 Вихідний мутантний штам Е.соlі 3000-1, вибраний нами в якості тест-об'єкта, утворює нещільні прозорі колонії неправильної розпливчастої форми, оточені більш дрібними дочірніми колоніями, що організуються у своєрідну групу. Дочірні колонії мають вигляд легких ущільнень на кінцях прозорих ледь помітних виростів, які відходять від основного тіла мутантної колонії. Характерною ознакою цієї культури є її здатність постійно вищеплювати нові бактеріальні форми з іншими характеристиками росту в рідкому живильному середовищі та іншою структурою колоній на твердому середовищі. Здатність вищеплювати сегреганти зростає по мірі старіння вихідної культури. У рідкому живильному середовищі вихідна мутантна культура повільно накопичує біомасу, виявляючи тенденцію до її зниження за рахунок лізису частини клітин. Культура сегрегантів при вирощуванні у рідкому живильному середовищі суттєво перевищує показники росту вихідної мутантної культури, не виявляючи тенденцій до лізису (Фіг.1). Колонії сегрегантів щільніші порівняно з колоніями вихідної культури, мають чіткі обриси і добре видимі на газоні прозорої вихідної культури. Це свідчить про стабільність їх оболонки, що визначає ступінь ригідності клітин, їх схильність до спонтанного лізису та форму утворюваних ними колоній. Оскільки обриси бактеріальних колоній визначаються структурною організацією мембран клітинної оболонки [5-7], то спонтанне вищеплення клітин, які утворюють колонії, відмінні від вихідних, пов'язано в нестабільній вихідній культурі з переорганізацією мембранних шарів оболонки її клітин у процесі їх росту та ділення. Властивості вибраного нами тест-об'єкту та його здатність до вищеплення сегрегантів з ознаками більш активного накопичення біомаси порівняно з вихідною культурою аналогічні подіям, що супроводжують процеси канцерогенезу і можуть бути використані для тестування не тільки антимутагенних, а й антиканцерогенних властивостей речовин. Суть пропонованої корисної моделі пояснюється графічними матеріалами (Фіг.2). Пропонована корисна модель вирішує задачу швидкого попереднього скринінгу антимутагенних та антиканцерогенних властивостей речовин на прикладі препаратів природного (рослинного) походження. Приклад Визначали придатність вихідного мутанта для швидкого первинного скринінгу речовин з антимутагенною та антиканцерогенною активністю. Пропонований мутантний штам характеризується повільним накопиченням біомаси з поступовим її зменшенням за рахунок часткового лізису клітин. Ознакою цієї культури є також її здатність до вищеплення нових бактеріальних форм з більш високими порівняно з вихідною культурою показниками накопичення біомаси без будь-яких тенденцій до її зниження в умовах довготривалого культивування. Вищеплені сегреганти утворюють щільні колонії з чіткими 5 обрисами, що явно відрізняються від прозорих розпливчатих колоній вихідного мутанта. Характеристики цієї системи бактеріальних мутантів аналогічні процесу канцерогенезу у вищих організмів, починаючи від стадії ініційованої клітини і закінчуючи появою форм з ознаками агресивного типу розмноження. Така подібність дозволяє припустити, що обробка вихідного мутантного штаму деякими речовинами може впливати на вищеплення сегрегантів і стати передумовою для подальшого вивчення реакції цього штаму на обробку сполуками, для яких показана антимутагенна або антиканцерогенна активність. Позитивний результат міг би стати передумовою для широкого скринінгу речовин різного походження на наявність антимутагенної антиканцерогенної активності. Досліджували вищеплення сегрегантів культурою вихідного мутанта, вирощеного в рідкому живильному середовищі в присутності 5% рослинних екстрактів, для яких показана антиканцерогенна та протипухлинна активність: екстракт рододендрона жовтого Rhododendron luteum L (R.luteum) [8], екстракт культивованих клітин родіоли рожевої Rhodiola rosea L (Rh.rosea) та екстракт натурального кореня родіоли рожевої (місце походження - Алтай, Російська Федерація) Rh.rosea нат. [9]. Випробовували також екстракт культивованих клітин полісціасу папоротелистого Poliscias filicifolia Bailey із родини Araliaceae (P.filicifolia), для якого показана антимутагенна активність [10] та екстракт культивованих клітин унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuchenko із родини Amarillidaceae (V.victoris), для якого в нашій попередній роботі показаний сильний протекторний ефект та наявність дуже незначної або навіть відсутність антимутагенної активності [10]. Випаровували 40% етанольні екстракти, отримані методом перколяції (кінцеве співвідношення спирт:суха тканина становило 10:1). Екстракти деалкоголізували (випаровували за допомогою вакуумно-ротаційного випаровувача при 40°С майже до сухого залишку) і розчиняли у стерильній дистильованій воді до вихідного об'єму екстракту. Для вирощування вихідного мутантного штаму відбирали типову колонію без вищеплених на її поверхні вторинних щільних колоній (сегрегантів), ресуспендували із рідкому LB-середовищі і розносили по пробірках по 1,9мл. У кожну пробірку крім контролю добавляли по 0,1мл екстракта у водній формі. В контрольну пробірку вносили 0,1мл фізіологічного розчину NaCl. Культури нарощували на шуттелі 3 доби при кімнатній температурі і повільному коливанні, а потім висівали на LB-агаризоване середовище в різних розведеннях так, щоб одержати ізольовані колонії. Вираховували загальний титр культури та кількість щільних колоній (сегрегантів), яку виражали у відсотках по відношенню до загального титру. Оскільки при довготривалому вирощуванні відсоток сегрегантів підвищується, висіви із одних і тих же культур проводили 2 рази - зразу після вирощування і через 3 тижні після вирощування 30865 6 (культури витримували при t° кімнатній без аерації). Метою повторного висіву було перевірити, наскільки антимутагенна антикацерогенна активність екстрактів виражена в умовах довготривалого контакту з культурою без повторного додавання екстракту. Шуканим ефектом вважали здатність досліджуваного препарату пригнічувати вищеплення сегрегантів із вихідної мутантної культури. Результати дослідів представлені в таблиці 1. Умови вирощування LВ+5% фіз.розчину NaCl контроль LВ+5% екстр. U.victoris LB+5% екстр. R.rosea культ LВ+5% екстр. R.rosea нат LВ+5% екстр P.filicifolia LВ+5% екстр Rhod.luteum Як можна бачити з даних, представлених на Фіг.2 та в табл.1, найбільш ефективним виявився екстракт R.rosea нат., який пригнічував вищеплення сегрегантів до 0,06% на третю добу вирощування і до 0,00% на 21 добу вирощування. Екстракт R.luteum пригнічував вищеплення сегрегантів майже на такому ж рівні - 0,00% на 3 добу вирощування, але виявляється менш активним при довготривалому вирощуванні 2,08% сегрегантів на 21 добу. Найменш активним виявився екстракт U.victoris, в присутності якого відсотковий вміст сегрегантів на 21 добу вирощування був таким же, як і в контрольному варіанті. Таблиця та графік демонструють також, що вплив екстрактів виражений значно більше на ранніх стадіях вирощування ініційованої культури порівняно з більш пізніми стадіями. Отже, випробувані нами препарати рослинного походження демонструють вибіркову дію в даній бактеріальній тест-системі і в залежності від своєї здатності інгібувати вищеплення сегрегантів можуть бути розташовані в послідовності R.luteum > R.rosea нат. > P.filicifolia > R.rosea культ. > U.victoris > Контроль - для ранніх стадій вирощування та R.rosea нат. > R.luteum > P.filicifolia > R.rosea культ. > U.victoris » Контроль для довготривалого вирощування. Таким чином, пропонований спосіб може бути придатним для тестування сполук природного походження на наявність у них антимутагенної та антиканцерогенної активності, що реалізується не на організменному, а на клітинному рівні. Джерела інформації: 1. Ames B.N., McCann J., Yamasaki E. Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella / mammalian microsome mutagenesity test // Muant.Res. - 1975. - vol.31. - P.347-364. 2. Порошенко Г.Г., Абилев С.К. Антропогенные мутанты и природные антимутагены // Под ред. В.А. Шевченко (Итоги науки и техники; Серия Общая генетика; Т.1) - М.: ВИНИТИ, 1988. - С.207. Чи 3 доби вирощуван 6,54 1,46 0,3 0,06 0,16 0 7 3. Wand Z. Y., Agarwal R., Zhou Z. C., Bickers D. R., Muktar H. Inhibition of mutagenicity in Salmonella typimurium and skin tumour initiating and tumour promoting activities in SENCAR mice by glycyrrhetinic acid: Comparison of 18 a - and 18 b -stereoisomers. // Carcinogenesis. - 1991. - 12. - P.187-192. 4. S.DeFlora, A.Izzotti, C.Bennicelli. Mechanisms of antimutagenesis and anticancerogenesis: role in primary prevention. // Antimutagenesis and Anticarcinogenesis Mech. IІІ Proc. 3-rd Int. Conf., Zacca, Italy. May 5-10, 1991. - Plenum Press, New York. - 1993. - P.1-16. 5. Cadmus M.C., Rogovin S.P., Burton K.A., Pittsley J.E., Knutson C.A., Jeans A. Colonial variation in Xanthomonas campestris NRRL B-1459 and characterization of the polysaccharide from a variant strain // Can. J. Microbiol. - 1976. - 22. P.942-948. 6. Prehm P., Schmidt G., Stirm S. On the mutations responsible for the rough phenotype of Escherichia coli В // J.General Microbiol. - 1976. - 97. - P.121-124. 7. Thompson E. D., Parks L.W. Genetic and biochemical studies on mannose-negative mutants with colonial morphological alteration // Molec.Gen.Genet. - 1976. - 149. - P.187-193. 8. Дзюба О.I., Головко E.A. Сапоніни рододендрона жовтого та їх біологічна активність // Физиология и биохимия культурных растений. 2000. - т.32. - №6. - с.469-473. 9. Бочарова О. А.,Серебрякова Р. В. Испытание препаратов растительного происхождения для профилактики и нетоксической терапии онкологических заболеваний на экспериментальных моделях // Вестник РАМН. - 1994. - №2. - с.52-55. 10. Дворник А. С., Перерва Т. П., Кунах В. А. Скринінг препаратів, отриманих із культури тканин лікарських рослин, на антимутагенну активність у системі Escherichia coli - бактеріофаг А // Цитология и генетика. - 2002. - №2. - с.3-10. 11. Бариляк И.Р., Дуган A.M. Исследование антимутагенного действия спиртовых вытяжек из культуры тканей Rhdiola rosea и Poliscias filicifolia в опытах на Salmonella typhimurium // Докл. АН Украины. - 1994. - №11. С.164-167. 30865 8