Спосіб приготування аутовакцини

Спосіб приготування аутовакцини що перед бачае відбір біологічного зразка, накопичення матеріалу для імунізації ідентифікацію збудника інактивацію контроль стерильності і введення аутовакцини у фізіологічний розчин, який відрізняється тим, що як матеріал для імунізації використовують ДНК або РНК збудника, а накопичення та ідентифікацію здійснюють методом полімерної ланцюгової реакції Винахід відноситься до медицинської промисловості, зокрема до технологи одержання принципово нової так званої вакцини з нуклеїнових кислот, яка використовується для лікування хворих з різними ураженнями органів і систем, які викликані вірусами, бактеріями, а також їх асоціаціями з іншими збудниками Відомо, ЩО очищена молекула ДНК служить вакциною Введення ДНК-вакцини забезпечує синтез (чужорідних протеїнів) клітинами вакцинуємого організму, що призводить до наступної виробки антитіл та сприяє підвищенню імунітету проти ВІД готовлену таким чином аутовакцину зберігають при 4-6°С Аутовакцина залишається стерильною ПОВІДНОГО збудника Найближчим до заявляемого є спосіб приготування аутовакцини по методу Горпєва Г Б (див Горгиев Г Б О приготовлении аутовакцины с применением бактерицидных факторов рыбьего жира Ж Лабораторное дело, 1960 г, № 1, с 43) У ВІДПОВІДНОСТІ з відомим способом у лю дини відбирають біологічний матеріал (аутоштам) і висівають його на агар Добову культуру після просмотру мазків змивають фізіологічним розчином і зливають у 2 пробірки У першій пробірці бактеріальну суспензію доводять до заданої концентрації (1 млрд мікробних тіл), а у друпй пробірці необхідний титр одержують шляхом додавання такої ж КІЛЬКОСТІ бактерицидної рідини Одержану таким чином бактерицидну рідину піддають інкубації у термостаті при 3 7 Х протягом 2-3-х днів і контролюють стерильність Для цього аутовакцину висівають на цукровий бульон і агар Результати перевіряють на 3-4 день Суспензію аутовакцини вводять у фізіологічний розчин При протягом 6 МІСЯЦІВ Даний спосіб обрано прототипом Прототип співпадає з винаходом, що заявляється, у наявності спільних ознак - відбір біологічного матеріалу - накопичення матеріалу для імунізації, - ідентифікація збудника, - інактивація матеріалу для імунізації, - контроль стерильності, - введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин Але способом по прототипу одержують avтовакцину за допомогою якої можна лікувати захворювання, збудником яких є мікроорганізми роду Staphylococcus, що дуже обмежує функціональні можливості способу В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб одержання аутовакцини в якому за рахунок використання іншого бюлопчного матеріалу та заміни метода ідентифікації збудника та накопичення матеріалу для імунізації забезпечити прискорення і розширення функціональних можливостей способа за рахунок забезпечення одержання моновалентної та полівалентної аутовакцини з нуклеїнових кислот, придатних для л'кування захворювань, які викликані вірусами паразитичними грибами, бактеріями, найпростішими або їх асоціаціями Поставлена задача вирішена у способі одержання аутовакцини, що передбачає відбір бюлопчного зразка, накопичення матеріалу для імунізації, о о* 39702 ідентифікацію збудника, інактивацію, контроль стерильності і введення аутовакцини у фізіологічний розчин тим, що як матеріал для імунізації використовують ДНК або РНК збудника, в накопичення та ідентифікацію здійснюють методом полімерної ланцюгової реакції (ПЛР). Новим у винаході, що заявляється, є те, що: 1 Як матеріал для імунізації використовують ДНК або РНК збудника. 2. Накопичення та ідентифікацію збудника здійснюють методом полімерної ланцюгової реакції. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляється, і досягнутим результатом можна пояснити слідуючим. Використання мікрокількості ДНК або РНК збудника забезпечує більш сильну імунну відповідь, ніж при використанні значно більшої (у 1001000 разів) кількості вірусних і бактеріальних білків. Крім того ДНК-РНК-аутовакцину простіше і швидше виготовляти. їі стабільність краще, ніж аутовакцини по прототипу. А головне це те, що таким способом можна приготувати аутовакцини, які придатні для лікування широкого спектру хвороб, тому що крім антитіл, у відповідь на їх введення виробляються ще й клітини-кілери (Т-цитотоксичні лімфоцити), які вбивають заражені клітини людини і не дають таким чином вірусу, бактеріям розмножуватигя. Аутоващина на основі ДНК і РНК не є небезпечною для пацієнта, тому що ДНК і РНК не інфекційний матеріал. ідентифікація збудника методом полімерної лаицюгогзоі реакції дозволяє значно прискорити спосіб, зокрема цим методом можна ідентифікувати мікроорганізм або вірус протягом декількох годин, замість декількох днів (3-4) по прототипу. Це пояснюється тим, що накопичування необхідної кількості ДНК або РИК у методі ПЛР здійснюється на протязі декількох годин, а збільшування необхідної кількості білка у процесі вирощування культури займає декілька днів. Спосіб здійснюють слідуючим чином. У пацієнта відбирають біологнний матеріал, наприклад, зскріб слизової і виділяють ДНК або РНК. Далі методом ПЛР накопичують та ідентифікують збудник, інактивують шляхом стерипізації при 100°С протягом 10 хвилин. Після стерилізації здійснюють контроль на стерильність, висіваючи біологічний матеріал на м'ясопептонний агар, живильний бульон та живильне середовище Сабуро. На 3-4-й день посів перевіряють ДНК або РНК у вигляді суспензії вводять у фізіологічний розчин, вміщають в стерильні ампули і запаюють. На кожну ампулу наносять прізвище, ім'я та по батькові пацієнта, рік народження, назву збудника та дату виготовлення аутовакцини. Приклад. Приготування аутовакцини Chlamidia trachomatis. Дослідний біологічний матеріал узяли ложкою Фолькмана зі слизової уретри хворого хронічним уретропростатитоїл і вмістиш в одноразовий посуд (пробірку типу Єппендорф) з 1,0 мл фізіологічного розчину. З відібраного таким чином зразку виділяли ДНК. В пробірку об'ємом 1.5 мл внесли 100 мкл аналізуємо? проби, додали 400 мкл лізуючого реагента наприклад, 1 М розчину гідроксиду натрію, перемішали і вмістили в термостат при 65вС на ЗО хвилин. До одержаного таким чином супернатанта додали 20 мкл суспензії сорбенту (фірма "Біоком"). Після ретельного перемішування додавали 800 мкл солевого буферу і знову інтенсивно перемішували. Після цього центрифугували протягом 10 сек, при 5000 g і вилучили супернатант. До осаду додавали 1 мл солевого буфера і повторно центрифугували 10 сек при 10000 д, супернатант вилучали, а осад підсушували при 65°С 1,5 хвилин. У пробірку додавали 100 мл елюіруючого буферу і одержували гомогенну суспензію. Операцію суспензирування проводили двічі, після чого супернатант переносили в стерильну пробірку і зберігали зразки ДНК збудника при - 20лС. Після цього проводили накопичення та ідентифікацію ДНК збудника у два етапи Спочатку приготували суміш для ампліфікації. В необхідну кількість пробірок вносили по 2 мкл буферу для ампліфікації, 1 мкл прямого та зворотнього праймерів, 2 мкл розчину дезоксинуклеозідтрифосфагів, 1 мкл термостабільної ДНКполімерази Taq, після чого доводили загальний об'єм рідини до 25 мкл стерильною деіонизсваною водою. До готового розчину додавали до 20 мкл мінеральної олії, щоб запобігти випаровуванню і зберегти стабільність об'єму розчину. В пробірки для негативного контролю, які маркіровані "-", вносили по 15 мкл негативного контрольного зразка. В пробірки для зразків, що підлягають аналізу вносили по 15 мкп ДНК збудника. В пробірки для позитивного контролю, які маркіровані "+", вносили 15 мкл позитивного контрольного зразка Після введення зразків ДНК збудника утворюється стійка трифазна система, поділена мінеральною олією на верхню і нижню фази. Пробірки установлювали у термостат і нагрівали до 65"С, при цьому мінеральна олія розтоплювалася і підіймалася уверх, а верхня і нижня фази перемішувалися. Після нього проводили ампліфікацію багатократне збільшення числа копій специфічної ділянки ДНК, каталізуємої ферментом ДНК-полімеразою (Taq-полімераза) з термофільних бактерій Thermis aguaticus по програмі: спочатку 1 хвилину при 95"С, 1 хв. при 64°С, 1 хв. при 72СС - один цикл; ЗО сек при 95°С, ЗО сек при 64°С, ЗО сек при 72еС- ЗО циклів; 2 хв. при 72°С - один цикл, після чого зразки охолоджували до'+4°С і зберігали при даній температурі. Для подальшої ідентифікації відібрали дослідній зразок в об'ємі 5 мкл і проводили електрофорез. Спочатку приготували робочий розчин ТВЕбуфера для електрофорезу. Після готували 1,7 %-й агарозний гель, вміщували його в конічну колбу і додавали 15 мкл броміда етідію, обережно перемішуючи. Розтоплену агарозу охолоджували до 50"С і заливали на платформу з гребінкою товщиною шара - 4 мм. Після застигання обережно виймали гребінку, а платформу переносили в електрофоретичну камеру і заливали 800 мл буфер ТВЕ так, щоб він укривав гель шаром - 3-4 мм. Далі 15 мкл продукту ампліфікації змішували з 5 мкл барвника (бромфеноловий синій). Далі камеру накривали кришкою і вмикали на 25 хв. Після сеансу електрофорезу агарозний гель поклали на екран УФ-трансілюмінаторз, увімкнули 39702 його і облічували отримані результати. Проба з пробірки з позитивним контролем, яка маркірована "+", повинна дати одну смугу, яка світиться жовтим кольором, а в пробі з негативним контролем, яка маркірована "-", такої полоси не повинно бути. Наявність смуги, яка світиться жовтим кольором підтверджує про позитивну реакцію зразка на наявність ДНК C.trachomatis. Основну частину ДНК інактивували шляхом стерилізації при 100"С протягом 10 хвилин. Після стерилізації здійснювали контроль на стерильність, висіваючи розчин ДНК на м'ясопептонний агар, живильний бульйон та середовище Сабуро. На 3-й перевіряли посів. Контроль підтвердив відсутність бактеріального росту. Отриману таким чином аутовакцину стерильним шприцем залили в ампули з фізіологічним розчином і запаяли. На ампулах наклеїли етикетки з прізвищем, ім'ям та по батькові хворого, рік народження та дату виготовлення аутовакцини. Ампули з аутовакцини зберігали при 5 е С протягом 6 місяців. Аналогічно описаному Прикладу готують РНК аутовакцину. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 ( 0 3 1 2 2 ) 3 - 7 2 - 8 9 (03122)2-57-03