Спосіб приготування аутовакцини

Спосіб приготування аутовакцини, що передбачає відбір біологічного зразку, культивацію, накопичення матеріалу для Імунізації, ідентифікацію збудника, інактивацію, контроль стерильності і введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин, який відрізняється тим, що у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивацію та накопичення збудника здійснюють в епітеліальних клітинах, а Ідентифікацію збудника проводять методом полімеразної ланцюгової реакції. Винахід відноситься до медицинської промисловості, зокрема до технології одержання аутовакцини, яка використовується для лікування хворих з різними ураженнями органів І систем вірусами, бактеріями та їх асоціаціями з Іншими збудниками. Відомо, що очищена молекула антигена служить вакциною Введення антигена вакцини забезпечує продукування організмом антитіл проти цього антигена, що сприяє підвищенню імунітету прати відповідного збудника. Найближчим до заявляемого є спосіб приготування аутовакцини по методу Горгієва Г.Б. (див Горгиєв Г Б. О приготовлении аутовакцины с применением бактерицидных факторов рыбьего жира Ж. Лабораторное дело, 1960 г., Ne 1, с.43). У відповідності з відомим способом у людини відбирають біологічний матеріал (аутоштам) і висівають його на агар. Добову культуру після просмотру мазків змивають фізіологічним розчином і зливають у 2 пробірки. У першій пробірці бактеріальну суспензію доводять до заданої концентрації (1 млрд мікробних тіл), а у другій пробірці необхідний титр одержують шляхом додавання такої ж кількості бактерицидної рідини. при 4-6°С Аутовакцина запишається стерильною протягом б місяців. Даний спосіб обрано прототипом. Прототип співпадає з винаходом, що заявляється, у наявності спільних ознак; - відбір біологічно активного зразку; - культивація збудника; - накопичення матеріалу для Імунізації; - ідентифікація збудника; - інактивація матеріалу для імунізації; - контроль стерильності; - введення суспєнзіТ аутовакцини у фізіологічний розчин. Одержану таким чином бактерицидну рідину піддають інкубації у термостаті при 37вС протягом 2-3-х днів і контролюють стерильність Для цього аутовакцину висівають на цукровий бульон і агар. Результати перевіряють на 3-4 день. Суспензію аутовакцини вводять у фізіологічний розчин. Приготовлену таким чином аутовакцину зберігають Але способом по прототипу одержують аутовакцину. за допомогою якої можна лікувати захворювання, збудником яких є мікроорганізми роду Staphylococcus і Е.соїі, що дуже обмежує функціональні можливості способу. Зокрема, відомим способом неможливо приготувати аутовакцину з C.trachomalis за умов неможливості розвитку хламідій на середовищах, які використовуються у способі по Горгієву. В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб приготування аутовакцини, в якому за рахунок очищення зразка від сторонньої мікрофлори та заміни метода культивації, накопичення та Ідентифікації збудника, забезпечити прискорення І розширення функціональних можливостей способа, за рахунок забезпечення одержання моновалентної та полівалентної аутовакцин, придатних для лікування захворювань, які викликані збудниками віоусної. бактеоіальної мікотиинпї ппипппи О о иіерильниілі t введення сус пензії аутовакцини у фізіологічний розчин тим, що у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивацію та накопичення збудника здійснюють в епітеліальних клітинах, а ідентифікацію збудника здійснюють методом полімерної ланцюгової реакції (ПНР) Новим у винаході, що заявляється, є наявність слідуючих ознак: - у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору: - культивацію та накопичення збудника здійснюють в епітеліальних клітинах зразку; - ідентифікацію збудника проводять методом полімеразноі ланцюгової реакції. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляється, і досягнутим результатом можна пояснити слідуючим. Сторонню мікрофлору вилучають з відібраного зразку для того, щоб вона не змогла помішати Ідентифікації збудника, або привести до неточних результатів. Крім того, будь-який чужорідний білок при введенні в організм викликає появу алергічних реакцій. Для зведення їх до мінімума з препарата треба вилучити усі сторонні домішки, крім самих епітеліальних клітин пацієнта, в яких розмножується збудник, зокрема хламідії. Необхідність культивування збудника в епітеліальних клітинах зразка пояснюється слідуючим Для ефективного впливу аутовакцини необхідна достатня кількість матеріалу для Імунізації тобто антигену збудника, зокрема хламідій. Таку кількість можна накопичити тільки шляхом культивування, тобто розмноження збудника Виходячи з того, що хламідії - це внутрішньоклітинні паразити, їх куяьтизують не на поживних середовищах, а в кульгурах клітин. Але цей процес потребує наяпност: культур клітин, спеціального обладнання, реактивш; він досить тривалий (3-5 діб), та багато копте Запропонована операція культивування збудника зокрема хламідій, у власних епітеліальних клітинах пацієнта, які присутні в біологічному зразку, за своєю ефективністю не поступається описаному відомому способу, але значно дешевше, швидше (протягом 1 доби), не потребує дуже коштовного обладнання і реактивів. Крім того, культивування збудника у власних клітинах дозволяє /никнути занесення чужорідних білків і, за рахунок цього, уникнути появи у пацієнта алергічних реакцій на введення аутовакцини. Це значно підвищує якість препарату Доцшьн'сть застосування метода полімерної ланцюгової реакції для ідентифікації збудника пояснюється слідуючим. Для ідентифікації збудника, зокрема хламідій, у соскобному матеріалі необхідно виявляти їх світовою та люмінісцентною мікроскопією або іншими методами Але, як показано вище, культивування хламідій в культурі клітин має РЯД неполі операціи Спосіб здійснюють слідуючим чином. У відібраному біологічному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивують І накопичують збудник в епітеліальних клітинах зразку. Після культивування здійснюють ідентифікацію збудника методом полімеразної ланцюгової реакції, отриманий таким чином матеріал для імунізації піддають Інактивації, перевіряють (контролюють) стерильність і вміщують приготовлену аутовакцину у флакон з фізіологічним розчином та зберігають певний час при температурі 4'С. Приклад. Приготування аутовакцини C.trachomatis. У хворого протягом 3-х днів проводили відбір біологічного зразку. Для цього ложкою Фолькмана робили зскрібок зі слизової сечостатевих органів хворого. Для вилучення сторонньої мікрофлори відібраний зразок вміщували у флакони, кожен а яких містить по 3 мл охолодженого транс- • портного середовища з антибіотиками (поживне середовище 199 з 5%-ю сироваткою великої рогатої худоби І 2 мкг/мл гентаміцину). Після цього проводили культивацію та накопичення збудника у власних епітеліапьних «шітинах. Для цього флакони вміщували у холодильник і витримували при +4°С протягом 3-х годин. Після цього флакони вміщували в термостат на 48 годин при Зб°С Дослідний зразок центрифугували при 2500 g 10 хвилин Для Ідентифікації відбирали частку зразку і переміщували її у пробірку типу Еппендорф 3 відібраного таким чином зразку виділяли ДНК. В пробірку об'ємом 1,5 мл внесли 100 мкл аналізуємо! проби, додали 400 мкл лізуючого реагента, наприклад, 1 М розчину гідроксиду натрію, перемішали і вмістили в термостат при 65°С на 30 хвилин До одержаного таким чином супернатанта додали 20 мкл суспензії сорбенту (фірма "Бгаком"). Після ретельного перемішування додавали 800 мкл сольового буферу і знову інтенсивно перемішували Після цього центрифугували протягом 10 сек, при 5000 g І вилучили супернатант До осаду додавали 1 мл сольового буфера і повторно центрифугували 10 сек при 10000 д, супернатант вилучали, а осад підсушували при 6 5 Х 1,5 хвилин. У , пробірку додавали 100 мл елюірую^ого буферу і . одержували гомогенну суспензію Операцію сус- . лензирування проводили двічі, після чого супернатант переносили в стерильну пробірку і зберігали зразки ДНК збудника при - 2 0 Х Після цього проводили ідентифікацію ДНК збудника у два етапи. Спочатку приготували суміш для ампліфікації В необхідну кількість пробірок вносили по 2 мкл буферу для ампліфікації, 1 мкл прямого та зворотнього праймерів, 2 мкл розчину дезоксинуклеозідтрифосфатів, 1 мкл термостабільної ДНКТял пігпа ипгп ника. В пробірки для позитивного контрог маркіровані"+", вносили 15 мкл позитивной рольного зразка. Після введення зразків ДН* ника утворюється стійка трифазна систем ділена мінеральною олією на верхню І ниж* зи. Пробірки установлювали у термостат і вали до 65°С, при цьому мінеральна олія р лювалася і підіймалася уверх, а верхня І фази перемішувалися. Після цього прой ампліфікацію - багатократне збільшення чиє . пій специфічної ділянки ДНК, каталізуємо"! ментом ДНК-полімеразою (Тад-полімераза) мофільних бактерій Thermis aguaticus no np< спочатку 1 хвилину при 9 5 Х , 1 хе. при 64°С при 7 2 Х - один цикл; ЗО сек при 95°С, ЗО с 6 4 Х , ЗО сек при 7 2 Х - ЗО циклів; 2 хв. прі - один цикл, після чого зраки охолоджуве + 4 Х І зберігали при даній температурі. Для подальшої ідентифікації відібрал лідний зразок в об'ємі 5 мкл і проводили ел форєз. Спочатку приготували робочий розчи» буфера для електрофорезу, Після готували 1,7%-й агарозний гелі щували його в конічну колбу і додавали 1 броміда етідію, обережно перемішуючи. Роз 8KL Україна, 88ООС УКРАЇНА (19) UA (и) 39700 (із) А (51) 7А61К39/00 МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ОПИС ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54) СПОСІБ ПРИГОТУВАННЯ АУТОВАКЦИНИ (21)2000127520 (22)26 12 2000 (24)15 06 2001 (46) 15 06 2001, Бюл № 5, 2001 р (72) Лебедюк Михайло Миколайович, Федчук Володимир Петрович, Бажора Юрій Іванович, Ніколаєвський Владислав Владленович (73) ЛЕБЕДЮК МИХАЙЛО МИКОЛАЙОВИЧ, ФЕДЧУК ВОЛОДИМИР ПЕТРОВИЧ, БАЖОРА ЮРІЙ ІВАНОВИЧ, НІКОЛАЄВСЬКИЙ ВЛАДИСЛАВ ВЛАДЛЕНОВИЧ Винахід відноситься до медицинсько» промисловості, зокрема до технології одержання аутовакцини яка використовується для лікування хворих з різними ураженнями органів і систем вірусами, бактеріями та їх асоціаціями з іншими збудниками ВІДОМО, ЩО очищена молекула антигена служить вакциною Введення антигена вакцини забезпечує продукування організмом антитіл проти цього антигена, що сприяє підвищенню імунітету прети ВІДПОВІДНОГО збудника Найближчим до заявляемого є спосіб приготування аутовакцини по методу Горпєва Г Б (див Горгиєв Г Б О приготовлении аутовакцины с применением бактерицидных факторов рыбьего жира Ж Лабораторное дело, 1960 г, № 1, с 43) У ВІДПОВІДНОСТІ з відомим способом у лю дини відбирають біологічний матеріал (аутоштам) і висівають його на агар Добову культуру після просмотру мазків змивають фізіологічним розчином і зливають у 2 пробірки У першій пробірці бактеріальну суспензію доводять до заданої концентрації (1 млрд мікробних тіл), а у другій пробірці необхідний титр одержують шляхом додавання такої ж КІЛЬКОСТІ бактерицидної рідини Одержану таким чином бактерицидну рідину піддають інкубації у термостаті при 37"С протягом 2-3-х днів і контролюють стерильність Для цього аутовакцину висівають на цукровий бульон і агар Результати перевіряють на 3-4 день Суспензію аутовакцини вводять у фізіологічний розчин Приготовлену таким чином аутовакцину зберігають (57) Спосіб приготування аутовакцини, що передбачає відбір біологічного зразку, культивацію, накопичення матеріалу для імунізації, ідентифікацію збудника, інактивацію, контроль стерильносте і введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин, який відрізняється тим, що у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивацію та накопичення збудника здійснюють в епітеліальних клітинах, а ідентифікацію збудника проводять методом полімеразної ланцюгової реакції при 4-6вС Аутовакцина залишається стерильною протягом 6 МІСЯЦІВ Даний спосіб обрано прототипом Прототип співпадає з винаходом, що заявляється, у наявності спільних ознак - відбір біологічно активного зразку, - культивація збудника, - накопичення матеріалу для імунізації, • ідентифікація збудника, - інактивація матеріалу для імунізації, - контроль стерильності, - введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин Але способом по прототипу одержують аутовакцину, за допомогою якоТ можна лікувати захворювання, збудником яких є мікроорганізми роду Sfaphylococcus і Е coif, що дуже обмежує функціональні можливості способу Зокрема, відомим способом неможливо приготувати аутовакцину з С trachomatis за умов неможливості розвитку хламщій на середовищах, які використовуються у способі по Горпєву В основу винаходу поставлено задачу створити спосіб приготування аутовакцини, в якому за рахунок очищення зразка від сторонньої мікрофлори та заміни метода культиваціі, накопичення та ідентифікації збудника, забезпечити прискорення і розширення функціональних можливостей способа, за рахунок забезпечення одержання монова лентної та полівалентної аутовакцин, придатних для лікування захворювань, які викликані збудниками вірусної, бактеріальної, мікотичної природи о ф а* 39700 та їх асоціаціями з найпростішими класу джгутикових Поставлена задача вирішена у способі приготування аутовакцини, що передбачає відбір біологічного зразку, культивацію, накопичення матер'алу для імунізації', ідентифікацію збудника, інактивацію, контроль стерильності і введення суспензії аутовакцини у фізіологічний розчин тим, що у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивацію та накопичення збудника здійснюють в епітеліальних клітинах, а ідентифікацію збудника здійснюють методом полімерної ланцюгової реакції (ПЛР). Новим у винаході, що заявляється, є наявннггь слідуючих ознак: - у відібраному зразку вилучають сторонню мікрофлору - культивацію та накопичення збудника здійснюють в епітеліальних клітинах зразку; - ідентифікацію збудника проводять методом полімеразної ланцюгової реакції. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляється, і досягнутим результатом можна пояснити слідуючим. Сторонню мікрофлору вилучають з відібраного зразку для того, щоб вона не змогла помішати ідентифікації збудника, або привести до неточних результатів. Крім того, будь-який чужорідний білок при введенні в організм викликає появу алергічних реакцій. Для зведення їх до мінімума з препарата треба вилучити усі сторонні домішки, крім самих епітеліальних клітин пацієнта, в яких розмножується збудник, зокрема хламідії. Необхідність культивування збудника в епітеліальних клітинах зразка пояснюється слідуючим. Для ефективного впливу аутовакцини необхідна достатня кількість матеріалу для імунізації тобто антигену збудника, зокрема хламідій. Таку кількість можна накопичити тільки шляхом культивування, тобто розмноження збудника Виходячи з того, що хламідії - це внутрішньоклітинні паразити, їх культивують не на поживних середовищах, а в культурах клітин. Але цей процес потребує наявності культур клітин, спеціального обладнання, реактивів; він досить тривалий (3-5 діб), та багато коштів Запропонована операція культивування збудника, зокрема хламідій, у власних епітеліальних клітинах пацієнта, які присутні в біологічному зразку, за своєю ефективністю не поступається описаному відомому способу, але значно дешевше, швидше (протягом 1 доби), не потребує дуже коштовного обладнання і реактивів. Крім гого, культивування збудника у власних клітинах дозволяє уникнути занесення чужорідних Ьїлкіа і, за рахунок цього, уникнути появи у пацієнта алергічних реакцій на введення аутовакцини. Це значно підвищує якість препарату Доцільність застосування метода полімерної ланцюгової реакції для ідентифікації збудника пояснюється слідуючим. Для ідентифікації збудника, зокрема хламідій, у соскобному матеріалі необхідно виявляти їх світовою та люміиісцєнтною гшросчопіею або іншими методами. Але, як показано вище, культивування хламідій в культурі клітин мав ряд недоліків. Крім того, після культивування треба проводити сам процес Ідентифікації різними методами Використання метода ПЛР дозволяє: а) значно (у 3-5 разів) скоротити витрати праці та часу - цю роботу можна виконати протягом 1 робочого дня; б) значно підвищити точність ідентифікації; в) спростити процес за рахунок зменшення операцій. Спосіб здійснюють слідуючим чином. У відібраному біологічному зразку вилучають сторонню мікрофлору, культивують І накопичують збудник в епітеліальних клітинах зразку. Після культивування здійснюють ідентифікацію збудника методом полімеразної ланцюгової реакції, отриманий таким чином матеріал для імунізації піддають інактивації, перевіряють (контролюють) стерильність і вміщують приготовлену аутовакцину у флакон з фізюлогічним розчином та зберігають певний час при температурі 4'С. Приклад. Приготування аутовакцини C.trachomatis. У хворого протягом 3-х днів проводили відбір біологічного зразку. Для цього ложкою Фолькмаиа робили зскрібок зі слизової сечостатевих органів хворого. Для вилучення сторонньої мікрофлори відібраний зразок вміщували у флакони, кожен з яких містить по 3 мл охолодженого транспортного середовища з антибіотиками (поживне середовище 199 а 5%-ю сироваткою великої рогатої худоби і 2 мкг/мл гентаміцину). Після цього проводили культивацію та накопичення збудника у власних епітеліальних кп\тинах. Для цього флакони вміщували у холодильник і витримували при -*4°С протягом 3-х годин. Після цього флакони вміщували в термостат на 48 годин при 36°С. Дослідний зразок центрифугували при 2500 g 10 хвилин. Для ідентифікації відбирали частку зразку і переміщували її у пробірку типу Еппендорф 3 відібраного таким чином зразку виділяли ДНК. В пробірку об'ємом 1,5 мл внесли 100 мкл аналізуємо'! проби, додали 400 мкл лізуючого реагента, наприклад, 1 М розчину гідроксиду ьатрію, перемішали і вмістили в термостат при 65°С на ЗО хвилин. До одержаного таким чином супернатанта додали 20 мкл суспензії сорбенту (фірма "Біоком"). Після ретельного перемішування додавали 800 мкл сольового буферу і знову інтенсивно перемішували. Після цього центрифугували протягом 10 сек, при 5000 g і вилучили супернатант До осаду додавали 1 мл сольового буфера і повторно центрифугували 10 сек при 10000 д, супернатант вилучали, а осад підсушували при 65°С 1,5 хвилин. У пробірку додавали 100 мл елюірую^ого буферу і одержували гомогенну суспензію Операцію суспензирування проводили двічі, після чого супернатант переносили в стерильну пробірку і зберігали зразки ДНК збудника при - 20°С. Після цього проводили ідентифікацію ДНК збудника у два етапи. Спочатку приготували суміш для ампліфікації В необхідну кількість пробірок вносили по 2 мкл буферу для ампліфікації, 1 мкл прямого та зворотнього праймерів, 2 мкл розчину дезоксинуклеозідтрифосфатів, 1 мкл термостабільної ДНКполімерази Taq, після чого доводили загальний об'єм рідини до 25 мкл стерильною деіонізованою водою. До готового розчину додавали до 20 мкл 39700 мінеральної олії, щоб запобігти випаровуванню і зберегти стабільність об'єму розчину. В пробірки для негативного контролю, які маркіровані "-". вносили по 15 мкл негативного контрольного зразка. 8 пробірки для зразків, що підлягають аналізу, вносили по 15 мкл ДНК збудника. В пробірки для позитивного контролю, які маркіровані"+", вносили 15 мкл позитивного контрольного зразка. Після введення зразків ДНК збудника утворюється стійка трифазна система, поділена мінеральною олією на верхню і нижню фази. Пробірки установлювали у термостат і нагріаали до 65°С, при цьому мінеральна олія розтоплювалася і підіймалася уверх, а верхня і нижня фази перемішувалися. Після цього проводили ампліфікацію - багатократне збільшення числа копій специфічної ділянки ДНК, каталізуємо*»' ферментом ДНК-полімеразою (Tag-полімєраза) з термофільних бактерій Thermis aguaticus no програмі: спочатку 1 хвилину при 95Х, 1 ха. при 64 в С, 1 хв. при 72°С - один цикл; ЗО сек при 95°С, ЗО сек при 6 4 Х , ЗО сек при 72*С - ЗО ииклів; 2 хв. при 72°С - один цикл, після чого зраки охолоджували до +4°С і зберігали при даній температурі. Для подальшої ідентифікації відібрали дослідний зразок в об'ємі 5 мкл і проводили електрофорез. Спочатку приготували робочий розчин ТВЕбуфера для електрофорезу. Після готували 1,7%-й агарозний гель, вміщували його в конічну колбу і додавали 15 мкл броміда етідію, обережно перемішуючи. Розтопле ну агарозу охолоджували до 50°С і заливали на платформу з гребінкою товщиною шара - 4 мм. "Після застигання обережно виймали гребінку, а платформу переносили в електрофоретичну камеру і заливали 800 мл буфер ТВЕ так, щоб він укривав гель шаром - 3-4 мм. Далі 15 мкл продукту ампліфікації змішували з 5 мкл барвника (бромфеноловий синій). Далі камеру накривали кришкою і вмикали на 25 хв. Після сеансу електрофорезу агарозний гель клали на екран УФ-трансілюмінатора, увімкнули його і облічували отримай» результати Проба з пробірки з позитивним контролем, яка маркірована "-*•", повинна дати одну смугу, яка свігкться жовтим кольором, а в пробі з негативним контролем, яка маркірована "-", такої полоси не повинно бути. Наявність смуги, яка світиться жовтим кольором, підтверджує про позитивну реакцію зразка на наявність ДНК C.trachomatis. Інактивацію G.trachomatis проводили кип'ятінням протягом 5 хв. при 100°С. Після інактивації проводили контроль на стерильність, висіваючи суспензію клітин на м'ясопєптонний агар, живильний бульон і середовище Сабуро. На 3-й день перевіряли посів. Проростання не було відмічено Отриману таким чином аутовакцину стерильним шприцем залили в ампули з фізіологічним розчином і запаяли. На ампулах наклеїли етикетки з прізвищем, ім'ям та по батькові хворого, рік народження та дату виготовлення аутовакцини. Ампули з аутовакцини зберігали при 5°С протягом б місяців. Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122)3-72-89 (03122)2-57-03