Спосіб діагностики стану слизової оболонки бронхів у дітей молодшого віку з рецидивуючим бронхітом в період ремісії

Спосіб діагностики стану слизової оболонки бронхів у дітей молодшого віку з рецидивуючим бронхітом в період ремісії, що включає отримання досліджуваного матеріалу, дослідження мазків з подальшим вивченням стану миготливого епітелію та наявності запальної реакції слизової оболонки бронхів, який відрізняється тим, що використовують малоінвазивний метод забору харкотиння з наступним морфоцитохімічним дослідженням 3 Проте, даний спосіб має ряд недоліків, які обумовлені складністю виконання, високою інвазивністю, небезпекою ймовірності летальних випадків при проведенні бронхоскопії та досить високою вартістю проведення електронної мікроскопії. Все це не дає змоги широко використовувати бронхоскопію та електронну мікроскопію для визначення стану слизової оболонки бронхів. В основу винаходу поставлена задача створити спосіб діагностики стану слизової оболонки бронхів у дітей молодшого віку з рецидивуючим бронхітом в період ремісії, удосконаленням відомого, а саме заміною бронхоскопії на малоінвазивний метод забору харкотиння шляхом його індукції з наступним морфо-цитохімічним дослідженням отриманого матеріалу, досягти високої безпечності та інформативності оцінки стану слизової оболонки бронхів у даного контингенту хворих. Поставлену задачу вирішують створенням способу діагностики стану слизової оболонки бронхів у дітей молодшого віку з рецидивуючим бронхітом в період ремісії, що включає отримання досліджуваного матеріалу, дослідження мазків з подальшим вивченням стану миготливого епітелію та наявності запальної реакції слизової оболонки бронхів, який відрізняється тим, що використовують малоінвазивний метод забору харкотиння з наступним морфо-цитохімічним дослідженням отриманого матеріалу шляхом додаткового використання спеціальних патогістохімічних методик забарвлення в декілька етапів: І - забарвлення за Папенгеймом, II - НСТ - та ЛКБ-тест, III етап - забарвлення амідо-чорним і при зниженні співвідношення миготливих клітин до бокалоподібних (4:1 до 2:1), порушенні цілісності мембрани миготливих клітин та переважання стадії секреції у бокалоподібних клітинах, наявності більше 70% дистрофічно змінених клітин, присутності лейкоцитів (до 1520 в полі зору), бактерій, макрофагів (7-8 в полі зору) та плазматичних клітин діагностують запальну реакцію на слизовій бронхів (ендобронхіт), а переважання макрофагів, нейтрофілів в стадії цитокінезу та утворення гнійних тілець зі зниженими показниками НСТ - (до 3%) та ЛКБ-тестів (до 30%) є ознакою в'ялості фагоцитозу та виснаження захисних механізмів в бронхах. Запропонований спосіб здійснюють наступним чином, проводили інгаляцію препарату -агоністів (венталін) після чого через 15 хвилин здійснювали індукцію харкотиння інгаляцією 0,9% розчину натрію хлориду через небулайзер протягом 15-20 хвилин, що дозволяє отримати харкотиння у дитини будь-якого віку. З отриманого харкотиння готувалися 4 серії мазків-відбитків, 1 - фарбувалася по способу Папенгейма (азур-еозином), 2 - нітросинім тетразолем, 3 - ЛКБ-тест та 4 - амідо-чорним і за допомогою імерсійного збільшення ( 1000) світлового мікроскопу "Olimpus" С 3040-ADU проводилось цитологічне та цитогістохімічне дослідження епітеліальних клітин, макрофагів та нейтрофілів, наявних у харкотинні. З метою одержання об'єктивного тесту, нами на мазках-відбитках вивчалось не менше 5 полів зору. При цьому визначався НСТ-тест та ЛКБ-тест у процентному співвідношенні, стадії морфо-функціонального стану мак 46515 4 рофагів та нейтрофілів: стадія спокою, стадія адгезії, цитокінезу (формування цитоплазматичних псевдоподій) та стадія руйнування цитоплазми та ядра лейкоцита з утворенням гнійних тілець. Патологічні зміни в індукованому харкотинні оцінювали за наступною шкалою (Табл.1). Таблиця 1 Шкала ++++ +++ ++ + – Ознака сильно виражена виражена помірно виражена слабо виражена відсутня Запропонована методика забарвлення дає можливість визначити 3 типи мазка індукованого харкотиння. Так, в мазках-відбитках І типу спостерігається нормальне співвідношення миготливих та бокалоподібних клітин (5:1), переважають в харкотинні макрофаги в стадії спокою з високими показниками ЛКБ-тесту (70%) та негативним НСТтестом, що свідчить про спокійний стан клітин та відсутність запальної реакції. Присутність одиничних макрофагів вказує на правильність проведеного дослідження, тобто матеріал одержано з нижніх відділів бронхів. Виявлені патологічні зміни в II типу мазківвідбитків відповідають морфологічним ознакам катарального ендобронхіту, про що свідчить початок порушення нормального співвідношення клітин миготливого епітелію, з підвищенням секреції бокалоподібних клітин. Переважання лейкоцитів та макрофагів в стадії адгезії та цитокінезу є діагностичним маркером фази розрішення запального процесу та збереженої фагоцитарної здатності лейкоцитів. Даний висновок підтверджують дані НСТ- (16-20%) та ЛКБ-тестів (40%). Враховуючи, що НСТ-тест свідчить про активацію лізосомальних протеолітичних ферментів, можна дійти висновку, що саме завдяки цим ферментам відбувається фагоцитарне розщеплення мікробів по мірі посилення адгезії до мікробного фактору НСТ тест значно виражений. А зниження ЛКБ-тесту до 40% свідчить про фазу розрішення запального процесу, наявність не живих бактерій в лейкоцитах, що забарвилися в зелений колір є сприятливою ознакою завершеності фагоцитозу. Патологічні зміни в мазках III типу відповідали стадії мукоїдизації ендобронхіту з початковими проявами перибронхіту, тобто при цій формі наявним було порушення структури бронхіального епітелію і виявлялися ознаки початку плоскоклітинної метаплазії. Переважання стадії цитокінезу та утворення гнійних тілець, зниження ЛКБтесту до 31% та наявність окремих гранулоцитів з фагоцитованими живими бактеріями всередині свідчили про присутність протеолітичних ферментів поза клітинами, незавершеність фагоцитозу та зниження рівня неспецифічної резистентності. Про виснаження захисних механізмів в слизовій оболонці бронхів свідчить різке зниження НСТ-тесту до 3%, тобто разом з деструкцією лейкоцитів та макрофагів їхні протеолітичні ферменти здійсню 5 46515 вали пошкоджуючий вплив на оточуючі тканини. Приклад конкретного виконання. Хворий Найко В.М., 3 роки, мешкає у Полтавській області, м. Гадяч, вул. Шевченка 38, кв. 62; перебував на стаціонарному лікуванні в алергологічному відділенні, імунологічне ліжко, Полтавської обласної дитячої клінічної лікарні з 09.01.08 по 23.01.08 р. з приводу рецидивуючого бронхіту, період ремісії. Дитина поступила зі скаргами на часті ГРВІ, що ускладнюються бронхітами. З анамнезу відомо, що часто хворіти (7 разів на рік) почав з 6 місячного віку, після перенесеної ГРВІ, 3 рази на рік мав загострення рецидивуючого бронхіту, що тривали, в середньому, 2 тижні. При обстеженні супутньої соматичної патології не виявлено, із носоглотки висівався Staphilococcus aureus, при імунологічному обстеженні виявлений дефіцит фагоцитарної ланки імунної системи (фагоцитарне число - 3,7, фагоцитарний показник 38%), зниження активності показників клітинного та гуморального імунітету (CD3+ - 28%, CD4+ 16%, CD8+ - 9%, CD20+ - 14%, IgA - 0,55г/л), незначне підвищення НСТ тесту (16%), дисбаланс в системі цитокінів (підвищення ІЛ-2 до 12,9пг/мл проти 8,75-11,19пг/мл у здорових дітей, ІЛ-5 до 37,5пг/мл проти 24,05-32,35пг/мл, ІЛ-12 до 450,9пг/мл проти 142,3-186,7пг/мл, зниження рівня -ІНФ до 3,3пг/мл проти 87,2-106,6пг/мл, рівень ІЛ10 (45,2пг/мл) залишався в межах показників здорових дітей (36,8-68,6пг/мл) відповідно), пригнічення активності показників місцевого імунітету слизових дихальних шляхів (slgA - 76мг/л проти 264,5-335,5мл/л у здорових дітей та лактоферрину - 416нг/мл проти 4017,4-6772,6нг/мл відповідно). З метою уточнення стану миготливого епітелію та фази запального процесу на слизовій бронхів дитині було призначено індукцію харкотиння через 15 хвилин після інгаляції венталіну проводилась інгаляція 0,9% розчину натрію хлориду через небулайзер протягом 15-20 хвилин, отримано 2мл слизового, прозорого та в'язкого харкотиння. З отриманого харкотиння готувалися 4 серії мазківвідбитків, 1 - фарбувалась по способу Папенгейма 6 (азур-еозином), 2 - нітросинім тетразолем (НСТтест), 3 - ЛКБ-тест, 4 - амідо-чорним та за допомогою імерсійного збільшення ( 1000) світлового мікроскопу "Olimpus" С 3040-ADU проводилось цитологічне та цитогістохімічне дослідження стану епітеліальних клітин, макрофагів та нейтрофілів, наявних у харкотинні. В мазках харкотиння визначалася велика кількість епітеліальних клітин, співвідношення бокалоподібних клітин до миготливих було значно знижене і складало 1:2. При забарвлені амідо-чорним зустрічалися миготливі клітини з порушенням цілісності мембрани на апікальній частині клітин. Бокалоподібні клітини з великими світлими слизистими гранулами. Поряд зі стадією гіперсекреції у бокалоподібних клітинах, також визначалась їх дегенерація та зменшення секреторних гранул. Практично у всіх мазках визначалося близько 78% дистрофічно змінених клітин. Крім епітеліальних клітин в мазках індукованого харкотиння, також присутніми були лейкоцити до 15-20 в полі зору, бактерії, підвищена кількість макрофагів (7-8 в полі зору) та 5-6 плазматичних клітин переважно великих, що синтезують slgA. Слід відзначити, що на цитологічних препаратах в різних полях зору виявляються переважно ті чи інші морфо-функціональні стани лейкоцитів або макрофагів (табл.2). Встановлено, що в стадії спокою ці клітини характеризуються чітко вираженими контурами як цитоплазми, так і ядра. Підтвердженням положення того, що різні форми лейкоцитів знаходяться у стані спокою, являються результати гістохімічної реакції на НСТ - тест та ЛКБтест. Встановлено, що цитоплазма лейкоцитів не містить активованих лізосом у вигляді темнофіолетових гранул та містить високий процент катіонних білків. Друга стадія запального процесу (адгезивна) характеризується властивістю лейкоцитів та макрофагів при гістохімічному забарвленні амідочорним деякою конденсацією гетерохроматину ядер, проте цитоплазма має гладкі зовнішні контури. Таблиця 2 Морфо-функціональний стан лейкоцитів та макрофагів наявних в індукованому харкотинні обстеженої дитини Стадії запального процесу Показник НСТ-тест (%) ЛКБ-тест (%) спокою адгезії цитокінезу Дані хворого 3 31 + + ++ Третя стадія морфо-функціонального стану лейкоцитів проявляється формуванням цитоплазматичних відростків у вигляді псевдоподій. При забарвленні азур-еозином за методом Папенгейма дана фаза характеризується крайовим розташуванням сегментів ядер по відношенню до цитоплазми з конденсацією хроматину. Найбільш інформативні показники фагоцитозу лейкоцитів нами отримані при забарвленні амідо-чорним. Встановлено, що в III фазу запального процесу Бактерії Утворення гнійних тілець + + визначаються лейкоцити у яких поряд із розпадом гетерохроматину ядра на окремі глибки, входженням останнього гетерохроматину в цитоплазматичні відростки (псевдоподії). Вказані морфологічні структури мають радіальне розгалуження відносно центра клітини і нагадують "голки їжачка". IV фаза морфо-функціонального стану лейкоцитів характеризується наявністю гнійних тілець. Останні характеризуються різними стадіями часткового або повного зруйнування лейкоцитів. Саме 7 46515 завдяки процесу зруйнування ядер та цитоплазми, утворюються так звані гнійні тільця. Останні, маючи високу протеолітичну активність ферментів, зумовлюють не тільки зруйнування мікробів, а й навколишньої тканини. Патологічні зміни в індукованому харкотинні даної дитини відповідали III типу мазка, тобто мала місце стадія мукоїдизації ендобронхіту з початковими проявами перибронхіту, тобто при цій формі виявлялися порушення структури бронхіального епітелію та ознаки початку плоскоклітинної метаплазії. Необхідно зазначити, що у мазках даної дитини переважали стадії цитокінезу та утворення гнійних тілець. Зниження ЛКБ-тесту та НСТ-тесту (табл.2) свідчить про виснаження захисних механізмів в слизовій оболонці бронхів. Таким чином, можна зробити висновок, що у хворого з рецидивуючим бронхітом в період клінічної ремісії спостерігається запальна реакція на слизовій бронхів, наявність незавершеного фагоцитозу в поєднанні з недостатністю місцевого імунітету слизових сприяє хронічному запальному процесу і хворий потребує більш тривалого, пагогенетично обумовленого реабілітаційного лікування. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська 8 Запропонованим способом в умовах алергологічного відділення Полтавської обласної дитячої клінічної лікарні було обстежено 34 дитини з рецидивуючим бронхітом у стадії ремісії. Доцільність запропонованого методу обумовлена високою доступністю, малоінвазивністю, безпечністю та досить нескладним виконанням, що дозволяє визначати стан миготливого епітелію та фазу запального процесу в слизовій бронхів. Застосування даного діагностичного методу дає можливість індивідуально для кожної дитини розробити комплекс реабілітаційних заходів залежно від ступеня деструктивних змін та фази запального процесу на слизовій оболонці бронхів та диференційовано підійти до призначення імуномодулюючих та антибактеріальних препаратів. Проведені нами дослідження патогенетично обґрунтовують тривалість відновного лікування при рецидивуючому бронхіті у дітей. Впровадження даного способу діагностики дозволило підвищити ефективність комплексної реабілітації рецидивуючого бронхіту у дітей в період ремісії захворювання, зменшити частоту та тривалість виникнення загострень, що позитивно позначилося на показниках якості життя хворих дітей. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601