Спосіб отримання модифікованого варіанта карциноми легень льюїса

Спосіб отримання модифікованого варіанта карциноми легень Льюїса, основу якого складає вихідний штам карциноми легень Льюїса, що виник спонтанно, який відрізняється тим, що проводять 9 послідовних циклів експериментальної прогресії цього штаму протипухлинним препаратом цисплатин. (19) (21) u200908956 (22) 28.08.2009 (24) 25.03.2010 (46) 25.03.2010, Бюл.№ 6, 2010 р. (72) ПЯСКОВСЬКА ОЛЬГА МИКОЛАЇВНА, СОЛЯНИК ГАЛИНА ІВАНІВНА, ФЕДОРЧУК ОЛЕКСАНДР ГРИГОРОВИЧ, ДАСЮКЕВИЧ ОЛЬГА ЙОСИПІВНА, ГОРБИК ГРИГОРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ, КОЛЕСНИК ДЕНИС ЛЕОНІДОВИЧ (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ ТА РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕ 3 В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб отримання модифікованого варіанту карциноми легень Льюїс шляхом проведення 9 послідовних циклів експериментальної прогресії LLC в напрямку формування лікарської резистентності до протипухлинного препарату цисплатин, що дасть можливість отримати нову експериментальну пухлинну модель з ангіогенез-залежним ростом та високою чутливістю до дії протипухлинних антиангіогенних засобів. Поставлена задача вирішується наступним чином. Експериментальна прогресія LLC в напрямку формування лікарської резистентності до цисплатину проводиться in vivo шляхом послідовних циклів перещеплення пухлини мишам лінії С57/ВІ6, та проведення курсів хіміотерапії цисплатином. Для проведення 1-го циклу суспензію пухлинних клітин, одержаних шляхом рутинної дезагрегації тканини первинної пухлини розчином трипсину, інокулюють інтактним мишам 6 внутрішньом'язево в кількості 1·10 в 0,1мл розчину Хенкса. Після появи первинного пухлинного вузла (1113-а доба після перещеплення) мишам внутрішньочеревно вводять розчин цисплатину (5 ін'єкцій) у дозі 1,2мг/кг ваги тіла тварини у 0,2мл фізіологічного розчину. Через 3 доби після останньої ін'єкції пухлини вилучають та суспензію пухлинних клітин, отриману з пухлинної тканини методом трипсинізації, інокулюють інтактним мишам внутрішньом'я6 зево в кількості 1·10 в 0,1мл розчину Хенкса для другого циклу експериментальної професії. Другий цикл експериментальної прогресії та всі наступні ідентичні першому. Після 9 циклів клітини, отримані з пухлин на 20 добу після перещеплення, адаптують для росту in vitro. Для цього на першому пасажі клітини висаджують в чашки Петрі діаметром 60мм з початко5 вою щільністю 5·10 клітин/чашку та інкубують за стандартних умов в середовищі RPMI (Sigma, США) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки (ETC), 2мМ L-глутаміну та 40мкг/мл гентаміцину при 37°С у вологих умовах, 5% вуглекислого газу (СО2). Кожну третю добу культуральне середовище замінюють на свіже до утворення напівконфлюентного моношару. Після цього клітини знімають розчином трипсина та висаджують в чашки Петрі для другого пасажу, який проводять аналогічно першому. Модифікований варіант карциноми легень Льюїс (LLC/R9) отримують після 5-ти послідовних пасажів. На кожному етапі отримання LLC/R9 in vitro та in vivo проводять оцінку ангіогенез-залежного росту пухлини в порівнянні з прототипом. Для цього клітини LLC/R9 та LLC нарощують in vitro за стандартних умов у поживному середовищі RPMI 1640 з додаванням 10% ETC (Sigma, США) 2мМ L-глутаміну та 40мкг/мл гентаміцину при 37°С у вологих умовах, 5% СО2. Для дослідів in vitro клітини розсаджують у чашки для культивування діаметром 60мм з щіль 48525 4 5 ністю 2·10 клітин в 7мл повного поживного середовища RPMI з додаванням 15% телячої ембріональної сироватки та інкубують за стандартних умов протягом 3 діб. Кількість клітин через 1, 2 та 3 доби культивування та їх життєздатність оцінюють рутинним методом за допомогою їхнього підрахунку у камері Горяєва з використанням 0,4% розчину трипанового синього або за допомогою калориметричного методу. Для визначення ангіогенез-асоційованих властивостей LLC/R9 на кожному етапі отримання модифікованого варіанту in vivo пухлинні клітини інокулюють мишам внутрішньом'язево у кількості 6 1,0·10 клітин в 0,1мл розчину Хенкса. Вимірювання об'єму пухлини проводять кожну другу добу починаючи з 10-ої після перещеплення пухлини за допомогою штангенциркуля. Швидкість росту пухлинних клітин in vitro та перещеплених пухлин in vivo проводять методом лінійної регресії з використання статистичного пакету Origin v.7.5. Основним маркером ангіогенез-залежного росту злоякісних пухлин є рівень продукції основного проангіогенного фактору - ендотеліального фактору росту судин (VEGF), який визначають в середовищі інкубації клітин LLC/R9 та LLC та плазмі крові мишей з відповідними пухлинами за допомогою методу імуноферментного аналізу, використовуючи набір реагентів виробництва R&D Systems "mouse VEGF Duoset, cat.No. DY493". Запропонований спосіб отримання модифікованого варіанту карциноми легень Льюїс обумовлює зміну біологічних властивостей прототипу та появу експериментального штаму пухлини, яка характеризується вираженим ангіогенез-залежним ростом, що проявляється як в більшій на 45% швидкості росту in vivo (незважаючи на майже однакову швидкість ділення клітин LLC/R9 та LLC in vitro), так і на 50% вищий рівень продукції проангіогенного цитокіну VEGF. Прикладами практичного застосування корисної моделі можуть бути протоколи 3-х експериментальних досліджень І. Після 9-ти послідовних циклів експериментальної прогресії протипухлинним препаратом цисплатин чутливість модифікованого варіанту карциноми легень Льюїс до ПАТ визначали використовуючи антиангіогенний препарат бевацизумаб - перший у світі протипухлинний антиангіогенний препарат, впроваджений в клінічну практику [10]. Досліджували вплив поліклональних антитіл проти мишачого VEGF (PABVEGF - мишачий аналог препарату бевацизумаб) на ріст та метастазування LLC/R9 в порівнянні з прототипом LLC. Суспензію пухлинних клітин кожного варіанту перещеплювали внутрішньом'язево мишам лінії С57/ВІ6 у 6 кількості 1·10 клітин/мишу в 0,1мл розчину Хенкса. Мишам з перещепленою пухлиною на 13-у та 14-у добу внутрішньочеревно вводили PABVEGF. У Дозі 0,5мг/кг в 0,2мл фізіологічного розчину. Контрольним тваринам за тією ж схемою і в такому ж об'ємі вводили фізіологічний розчин (Табл.1). 5 48525 6 Таблиця 1 Протипухлинна дія поліклональних антитіл проти мишачого VEGF по відношенню до LLC/R9 та LLC -1 Швидкість росту пухлини (доба ) Контроль (фіз. розДослід (терапія PABVEGF) чин) 0,32±0,02 0,34±0,01 0,37±0,01 0,29±0,006* Варіант пухлини LLC LLC/R9 Гальмування швидкості росту пухлини (%) 21,6 Примітка. В цій та подальших таблицях знак * вказує на значущу (р