Спосіб очистки білкових розчинів від домішки компонентів фібринолітичної системи та патогенної форми пріонового білка

Спосіб очистки білкових розчинів від домішки компонентів фібринолітичної системи та патоген ної форми прюнового білка, який відрізняється тим, що відокремлення небажаних білків здійснюють афінно-хроматографічною сорбцією на нерозчинному носи з іммобілізованими синтетичними лігандами - аналогами лізинзв'язувальних ділянок плазміногену, утворених експонованими на поверхні ліганду та жорстко фіксованими на відстані 0,7±0,2нм дипольними зарядженими залишками з групи аміно-, алкіламшо-, гуанідино-, амідино-, метиламідино-, карбокси-, металкарбокси-та сульфо Винахід відноситься до біотехнологм, медицини та фармацевтичної промисловості і може бути використаний для очистки білкових препаратів від домішки компонентів фібринолітичної системи та патогенної форми прюнового білка Відомо, ЩО можлива присутність патогенної форми прюнового білка (PrPSc) та пов'язана з цим можливість інфікування повільними вірусними хворобами спричинила до заборони або істотних обмежень щодо використання цілої низки медикаментозних білкових препаратів з тваринної та донорної сировини [1, 2] Мала величина мінімальної інфекційної дози (порядку 105 молекул [3]) вкрай ускладнює виявлення прюнової інфекції як в призначеній для отримання медикаментозних препаратів тваринній та донорнм сировині, так і в кінцевому продукті, при чому здатність до поступового накопичення прюнового білка створює загризу інфікування малими дозами, що знаходяться нижче мінімального порогу чутливості існуючих імму використовуються для виділення окремих білків цієї Системи методами афінної хроматографії [8] Структура ЛЗД являє собою жорстко фіксовану у просторі дипольну пару позитивно та негативно заряджених амінокислотних залишків, що забезпечують ефективну взаємодію з дипольною парою зв'язуваних білків [9] Як лізин-зв'язуючі ділянки, так і комплементарні ЛЗД структури є досить рідкими і розміщені головним чином в білках - компонентах фібринолітичної системи - плазміногені, плазміні, тканинному активаторі плазміногену, фібриногені, фібрині, а2-антиплазміні, окремих фрагментах цих білків, тощо Внаслідок ефективного комплексоутворення між PrP Sc та лізин-зв'язуючими ділянками ефективна очистка білкових препаратів від компонентів фібринолітичної системи гарантовано забезпечує кінцевий продукт від можливої домішки прюнового білка НОХІМІНИХ методів В той же час відомо, що PrP Sc здатна до ефективного комплексоутворення з так званими лізинзв'язуючими ділянками (ЛЗД) - структурними групами, що ефективно зв'язують дипольні лігандні пари типу лізил-карбоксил чи арпніл-карбоксил за умови розміщення позитивної та негативної складової частин дипольної пари на відстані 0,68нм [4 6] ЛЗД відіграють ключову роль у міжмолекулярних взаємодіях системи фібринолізу [7], а також Тому задача гарантованого позбавлення призначених до медицинських цілей білкових препаратів від можливої домішки компонентів фібринолітичної системи та асоційованої з ними патогенної форми прюнів (PrPSc) відноситься до найактуальніших в сучасній біотехнологм Рішення цієї задачі ускладнюється високою конформаційною стабільністю інфіційного агенту, що значно перевершує стабільність більшості відомих білків та виключає можливість селективної денатурації PrP Sc в суміші з отримуваним білковим продуктом (О о> ю о ю 50596 В якості прототипу вибрано спосіб афіннохроматографічної сорбції аг-антиплазміну, здатного до ефективного комплексоутворення з ЛЗДвміщуючими білками (плазміногеном, плазміном, важким ланцюгом плазміну та фрагментом плазміну К1-3) [10] Спосіб-прототип полягає в отриманні фрагменту плазміну К1-3, іммобілізації його на нерозчинній агарозній матриці та афіннохроматографічному виділенні аг-антиплазміну на отриманому сорбенті, що містить фрагмент плазміну К1-3 в якості афінного ліганду Спосіб-аналог полягає у афінно-хроматографічній очистці плазми крові від ЛЗД-вміщуючих білків з подальшою сорбцією сі2-антиллазміну афінним сорбентом, що містить іммобілізований ЛЗД-вміщуючий білок - плазміноген людини [11] Як в способі-прототипі, так і в способі-аналозі утилізовано здатність ЛЗД-вмістних білків до ефективного комплексоутворення з адекватними за специфічністю структурними угрупуваннями на поверхні молекул сі2-антиплазміну Принциповий недолік способу-прототипу та способу-аналогу полягає в залежності ЛЗДвміщуючого афінного сорбенту від конформаційної СТІЙКОСТІ іммобілізованих білків - фрагменту К1-3 чи плазміногену 3 практики відомо, що отримання зазначених сорбентів та їх підтримка у дієспроможному стані є вельми складною задачею, чим, зокрема, пояснюється придатність прототипа та аналога до застосування тільки в лабораторних цілях Тими ж причинами обумовлено практичну непридатність іммобілізованих ЛЗД-вміщуючих білків для технологічного очищения білкових розчинів від можливої домішки прюнового білку Ні спосіб-прототип, ні спосіб-аналог не забезпечують в умовах промислового бютехнолопчного виробництва гарантованого відокремлення компонентів фібринолітичної системи та патогенної форми пріонового білка від білків, позбавлених лізинзв'язуючих ділянок та комплементарних ЛЗД структур Відмічені недоліки способу-прототипу та способу-аналогу подолані у способі, що заявляється, завдяки застосуванню афінних сорбентів, що містять синтетичні сполуки з властивостями лізинзв'язуючих ділянок плазміногену Відомо, ЩО просторова фіксація окремих просторових, та заряджених груп і дозволяє створити молекулярні структури - функціонально активні аналоги природних макромолекул, зокрема - так звані синтетичні ферменти (синзими) [12] Дипольні гари лізинзіз'язуючих ділянок та комплементарних ЛЗД структур можуть бути змодельовані за допомогою жорстко фіксованого структурою гідрофобного ядра ліганду розміщення позитивно та негативно заряджених груп на відстані, наближеній до 0,68нм Подібні структури (С-ЛЗД) здатні до ефективного комплексоутворення як з комплементарними ЛЗД структурами, так і з самими лізин-зв'язуючими ділянками Гарантований характер вилучення супутних основному білку компонентів фібринолітичної системи забезпечується МІЦНІСТЮ утворюваного зв'язку, стабільністю синтетичного ліганду - аналогу ЛЗД та величезним по відношенню до мінорних домішок компонентів фібринолітичної системи та PrP нті c надлишком ЛЗД-подібного ліганду на сорбе Істотною перевагою запропонованого способу є можливість контролю за його ефективністю за допомогою маркерних кількостей радіоактивне мічених білків, здатних до комплексоутворення з ЛЗД, зокрема - фрагментів фібрину Спосіб виконується згідно наведених прикладів Приклад 1 Отримання С-ЛЗД-вміщуючого сорбенту Синтез С-ЛЗД-вміщуючого сорбенту проводять за стандартною процедурою іммобілізації водорозчинних лігандів з вільною аміногрупою на BrCN-активованій агарозі [13] Вміст іммобілізованого ліганду визначають за даними аналізу гідролізату сорбенту, отримуваного 12-годинним гідролізом наважки сорбенту 6н соляною кислотою при 105°С, на автоматичному аналізаторі амінокислот ААА-881 (Чехословаччина) проти стандарту - ВІДПОВІДНИХ кількостей вільного С-ЛЗД-віміщуючого ліганда В залежності від партії і сорбенту, вміст іммобілізованого ліганду становить від 3,7 до 8,4 мікромолей на мл гелю Приклад 2 Визначення і афіннохроматографічного зв'язування С-ЛЗД-вміщуючим сорбентом білків з і ЛЗД-комплементарними структурами Здатність С-ЛЗД-вміщуючого сорбенту до афінної сорбції білків з ЛЗД-комплементарними структурами проводять колонковою хроматографією за допомогою розчину Є-фрагменту фібриногену у 0.05М натрій-фосфатному буфері рН 7,4 аналогічно [14] На відміну від афінного сорбенту з Іммобілізованим ЛЗД-вміщуючим білком - плазміногеном - зв'язування Є-фрагменту з С-ЛЗДвміщуючим сорбентом не руйнується 0,2М розчином 6-амшогексановоі кислоти Збільшення йонної сили за допомогою 1М NaCI також не призводило до десорбції Елюція білка досягалася лише за допомогою "деформуючого буфера" [15] - 0,5М NaCI у 0,1 М натрій-боратному буфері, рН 9,0, що свідчить про виключно високу силу зв'язування ЛЗД-комплементарних білків С-ЛЗД-вміщуючим сорбентом Приклад 3 Визначення афіннохроматографічного зв'язування С-ЛЗД-вміщуючим сорбентом білків з лізин-зв'язуючими ділянками Здатність С-ЛЗД-вміщуючого сорбенту до афінної сорбції ЛЗД-вміщуючих білків структурами проводять колонковою хроматографією за допомогою розчину плазміногену людини у 0.05М натрій-фосфатному буфері рН 7,4 аналогічно [8] На відміну від лізин-агарози, зв'язування плазміногену з С-ЛЗД-вміщуючим сорбентом не руйнується 0,2М розчином 6-амшогексановоі кислоти Збільшення іонної сили за допомогою 1М NaCI також не призводило до десорбції Елюція білка досягалася лише за допомогою "деформуючого буфера" [15] 0,5М NaCI у 0,1 М натрій-боратному буфері, рН 9,0, що свідчить про виключно високу силу зв'язування ЛЗД-вміщуючих білків С-ЛЗД-вміщуючим сорбентом Приклад 4 Визначення утримання домішки мічених білків, що містять ЛЗД та ЛЗД 50596 комплементарні структури Дослідження ефективності утримання білків, що містять ЛЗД та ЛЗД-комплементарні структури проводять на прикладі вилучення мінорної (менше 125 0,1 відсотка по білку) домішки и -мічених препаратів плазміногену та Є-фрагменту фібриногену з розчину препарату овальбуміну колонковою хроматографією на С-ЛЗД-вміщуючому сорбенті аналогічно [16] Йодовані до 4 - 5МБк на мг білку препарати плазміногену та Є-фрагменту фібриногену додають до розчину овальбуміну у розрахованих кількостях та наносять на колонку у КІЛЬКОСТІ, ЩО не перевершує 5 ВІДСОТКІВ від, попередньо встановленої специфічної ємності сорбенту (приблизно 12 - 17мг білка на мл гелю) Утриманням мітки на афінній колонці визначають за допомогою радіометру Beckmann Gamma 5500 (США) С-ЛЗДвміщуючий сорбент однаково ефективно утримує плазміноген та Є-фрагмент фібриногену, практично не затримуючи основний білок - овальбумін Специфічна сорбція є нечутливою до десорбційної дії 0,5М розчину NaCI у 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4 та 0,2М розчину 6-амшогексановоі кислоти, тоді як за допомогою 0,5М NaCI у 0,1 М натрій-боратному буфері, рН 9,0 досягається повна десорбція мітки Приклад 5 Очистка розчину овальбуміну від домішки патогенної форми прюнового білка афінною хроматографією на С-ЛЗД-вміщуючому сорбенті Штучну контамінацію патогенною формою прюнового білка розчину ЮОмг овальбуміну ("Sigma", США) у 50мл 0.05М натрій-фосфатному буфері, рН 7,4 проводили додаванням 15 - 20мг гомогенату головного мозку бика з вираженою формою спонпформної енцефалопатм (BioRad Life Science Labs, США) Отриманий розчин пропускали через афінну колонку і 24мл С-ЛЗД-вміщуючим сорбентом Визначення прюнового титру білкового розчину до та після проходження через афінну колонку провадили іммуноферментним методом з застосуванням набору BioRad, США [17] Згідно отриманих даних, зазначена процедура призводила до зменшення прюнового титру з величин порядку ЗО - 50LD50 до рівня, що знаходився нижче нижньої межі чутливості методу, тобто щонайменше в 4000 разів Наведені приклади свідчать, що запропонований спосіб забезпечує ефективне зв'язування ЛЗДвміщуючих та ЛЗД-комплементарних білків та гарантує ефективну очистку білкових розчинів від домішки патогенної форми прюнового білка СПИСОК ПОСИЛАНЬ 1 Prusmer S Priori disease and BSE crisis // Science -1997 - 278 - P 245 - 251 2 Lederman L Transmissible spongiform encephalopaties // Genetic Engineering News - 1999 Apnl15 - P 9 - 5 5 3 Chesebro В BSE and pnons Uncertainties about the agent//Science - 2 January 1998 -279 P 42 - 43 | 4 Fischer M , Roecki С , Panzek P Et al Binding of disease-associated priori protein to plasmmogen // Nature -23 November 2000 -408 - P 479 - 483 5 Okamoto S , Oshiba S , Mihara H , Okamoto W Synthetic inhibitors of fibrmolysis in vitro and in vivo mode of action // Ann NY Acad Sci -1968 -146, N3 -P 414-429 6 Wmn E , Hu S , Hochschwender S , Laursen R Studies on the lysme-binding sites of human plasmmogen the effect of hgand structure on the binding of lysme analogs to plasmmogen // Eur J Biochem 1980 -104, N 4 -P 579-586 7 Wiman В , Wallen P The specific interaction of plasmmogen and fibrin A physiological role of the lysme-binding sites in human plasmmogen // ThrombRes -1977 -10, N 2 -P 213-222 8 Deutsch D , Meitz E Plasmmogen purification from human plasma by affinity chromatography // Science -1970 - N 3962 - P 1095 -1096 9 Мацука Ю В , Новохатний В В , Кудинов С А Структурная характеристика лизинсвязывающих участков плазминогена//ДАН УССР, сер Б -1987 - № 9 - С 63 - 66 10 Wiman В Affinity chromatographic purification of human a2-antiplasmm // Biochem Journ 1980 -191, N 1 -P 229-232 11 Wiman В , Colten D Purification and characteristics of human antiplasmm, the fast-acting plasmm inhibitor // Eur J Biochem - 1977 - 78, N 1 - P 19 26 12 Моделирование ферментных систем В кн Дюга Г, Пенни К Биоорганическая химия - Москва, "Мир" -1983 - С 263-341 13 Porath J , Axen R, Emback S Chemical coupling of the piotems to agarose//Nature -1967 215, N5109 -P 1491 -1492 14 Гриненко Т Е , Третьяченко Е Г , Кудинов С А , Медведь Л В Плазминоген-связывающие участки фибриногена, фибрина и продуктов их протеолиза Биохимия -1987 -52, N10 - С 17321739 15 О'Сагга Р , Barry S , Griffin T Interfering and complicating adsorption effects in bioaffmity chromatography//Meth Enzymol -1974 -34 -P 108-126 16 Me Conahey P , Dixon F Radioiodivation of protein by the use chloramme T method // Meth Emymol -1980 -70 -P 210-213 17 Moynagh J , Schimmel H Tests for BSE evaluated // Nature - 8 July 1999 - 400 - P 105 111 50596 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71