Спосіб визначення ступеня сіальованості альфа-1-кислого глікопротеїну

Спосіб визначення ступеня сіальованості альфа-1-кислого глікопротеїну плазми крові людини, який включає проведення адсорбції специфічних антитіл в імуноферментному планшеті, проми 3 тосувати його для оцінки сіальованості саме АГП, значно спростити аналіз, підвищить відтворюваність отриманих даних. За цим способом олігосахаридні ланцюги АГП, імобілізованого через шар деглікозильованих антитіл на поверхні полістиролу, взаємодіють з вуглеводзв'язуючими ділянками лектину SNA, кон'югованого з пероксидазою хрону; ступень подібної взаємодії оцінюють за кількістю окисненого пероксидазою субстрату шляхом вимірювання на мікропланшетному рідері світлопоглинання забарвлених продуктів реакції. Ознаками прототипу, які співпадають з істотними ознаками запропонованого способу є проведення адсорбції специфічних антитіл в імуноферментному планшеті, промивка лунок планшету трис-фосфатним буфером, з подальшим додаванням сіалоспецифічних лектинів і внесенням субстрату. Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі визначення сіальованості АГП, що включає проведення адсорбції специфічних антитіл в імуноферментному планшеті, промивку планшета буфером, що містить твін, внесення зразків плазми крові, додавання в лунки сіалоспецифічного лектину, внесення субстрату, в якому, згідно корисної моделі, на стадії адсорбції використовують специфічні деглікозильовані антитіла до альфа-1-кислого глікопротеїну, блокують вільні сайти зв'язування твін-фосфатним буфером (ТФБ), що містить 1мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, вносять в лунки сіалоспецифічний лектин SNA, кон'югований з пероксидазою хрону, оцінюють ступень сіальованості як відсоток від еталонного зразку, що є пулом плазми крові від здорових донорів. Між сукупністю основних ознак способу, який пропонується, і технічним результатом, який може бути досягнутий, виявляється наступний причинно-наслідковий зв'язок: використання деглікозильованих антитіл дозволяє безпосередньо вносити до лунок планшету досліджувані зразки плазми крові у підібраному робочому розведенні, що значно спрощує підготовку зразків до аналізу та є найбільш оптимальним для виявлення вірогідної різниці в ступені сіалювання альфа-1-кислого глікопротеїну; проведення адсорбції деглікозильованих антитіл у кількості 100мкл з концентрацією 3мкг/мл при температурі 4 С протягом 12 годин дозволяє отримати рівномірний шар антитіл на поверхні лунок планшету та уникнути «крайового ефекту», що сприяє відтворюваності способу; блокування вільних сайтів зв'язування додаванням 200мкл ТФБ, що містить 1мг/мл бичачого сироваткового альбуміну, протягом 1 години дозволяє досягти високого ступеня гідрофобної взаємодії реагентів з поверхнею твердої фази і забезпечує повне перекриття всіх вільних валентностей лунки; подальше внесення в лунки лектину, кон'югованого з пероксидазою хрону, в об'ємі 100мкл при концентрації 10мкг/мл дозволяє значно збільшити чутливість та відтворюваність лектин-ферментного аналізу, використання в якості еталона порівняння пула плазми крові від здорових донорів дозволяє кількісно оцінювати ступень сіальованості АГП. Спосіб полягає у наступному. 53176 4 Вносять в лунки імуноферментного планшету (Microtest Plate 96, Sarstedt) по 100мкл 3мкг/мл розчину деглікозильованих антитіл у 0,1 М натрійкарбонат-бікарбонатному буфері (0,015 М Na2CO3, 0,035 М NaHCO3, 0,2 М NaN3, рН=9,6) та проводять адсорбцію при температурі 4 С протягом 12 годин, після чого промивають лунки твінфосфатнім буфером (ТФБ, забуферений фізіологічний розчин, що містить 0,05% TWEEN 80, рН=7,2). Блокують лунки планшету додаванням 200мкл ТФБ, що містить 1 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (BSA, Sigma-Aldrich) протягом 1 години за кімнатної температури, після чого проводять чотирьохразову, по 10 хвилин за кожним разом, промивку планшета ТФБ по 200мкл на лунку. Таким чином, лунки ретельно промивають від антитіл, що не зв'язалися, і одночасно проводять блокування вільних валентностей планшету. У лунки імуноферментного планшету вносять зразки досліджуваної плазми, розведені у ТФБ до концентрації 1мкг/мл по 100мкл в лунку, в дві лунки вносять еталонний зразок, що є пулом плазми крові від здорових донорів, у контрольні лунки вносять по 100мкл того ж буферного розчину і інкубують планшет 1 годину при при температурі 37 С. Після закінчення інкубації проводять чотирьохразову, по 10 хвилин за кожним разом, промивку лунок планшету ТФБ. На наступному етапі вносять по 100мкл лектину SNA, кон'югованого з пероксидазою хрону (SNA-HRP, BioRad), розведеному до концентрації 10 \мкг/мл у ТФБ, що містить по 1 ммоль/л СаСl2 і MgCl2, витримують планшет 1 годину за кімнатної температури, після чого проводять стандартну промивку планшету і вносять в лунки по 100мкл субстратної суміші (0,004 М o-Phenylenediamine, Serva в 0,1 М фосфатно-цитратному буфері (рН=5,0), що містить 0,01% перекису водню). Через 10 хвилин зупиняють реакцію внесенням до лунок по 50мкл 2 М сірчаної кислоти (H2SO4) та вимірюють оптичну густину кінцевого розчину (довжина хвилі 492нм) на мікропланшетному рідері. Оцінюють ступень сіальованості АГП, порівнюючи значення екстинції досліджуваних зразків з екстинкцією еталонного зразку (пул плазми крові здорових донорів), в якому ступень сіальованості АГП прийнятий за 100%. Сукупність ознак корисної моделі є суттєвою, оскільки відповідає очікуваному технічному результату. Наведені твердження інформують про те, що запропонований спосіб відповідає критерію корисної моделі «новизна». Відсутність еквівалентних способів визначення ступеню сіальованості альфа-1-кислого глікопротеїну плазми крові людини для досягнення очікуваного технічного результату дозволяє зробити висновок про відповідність запропонованого способу умові «винахідницький рівень». Відомості, що підтверджують можливість використання заявленого способу з досягненням вищевказаного технічного результату наведені нижче. Приклад Визначення ступеню сіальованості АГП проводять за наступною схемою: 5 1 - Вносять в лунки імуноферментного планшету (Microtest Plate 96, Sarstedt) по 100мкл 3мкг/мл розчину деглікозильованих антитіл у 0,1 М натрій-карбонат-бікарбонатному буфері (рН=9,6) та проводять адсорбцію при температурі 4 С протягом 12 годин, промивають планшет 4 рази твінфосфатним буфером (ТФБ), та блокують вільні сайти лунок планшету додаванням 200мкл ТФБ, що містить 1мг/мл бичачого сироваткового альбуміну (BSA, Sigma-Aldrich) протягом 1 години за кімнатної температури, після чого проводять чотирьохразову, по 10 хвилин за кожним разом, промивку лунок планшета 200мкл ТФБ. 2 - У лунки імуноферментного планшету вносять по 100мкл еталонних і досліджуваних зразків плазми крові, що розведені у ТФБ до кінцевої концентрації за альфа-1-кислим глікопротеїном 1мкг/мл, у контрольні лунки вносять по 100мкл ТФБ і інкубують впродовж 1 години за температури 37 С. Потім проводять чотирьохразову, по 10 хвилин за кожним разом, промивку лунок планшету 200мкл ТФБ. 3 - вносять по 100мкл сіалоспецифічного лектину SNA, кон'югованого з пероксидазою хрону (SNA-HRP, BioRad), розведеному до концентрації 10мкг/мл у ТФБ, що містить по 1ммоль/л СаСl2 і MgCl2, витримують планшет 1 годину за кімнатної температури, після чого проводять стандартну промивку планшету і вносять в лунки по 100мкл субстратної суміші (0,004 М o-Phenylenediamine, Serva в ОД М фосфатно-цитратному буфері (рН=5,0), що містить 0,01% перекису водню). Через 10 хвилин зупиняють реакцію внесенням до лунок по 50мкл 2 М сірчаної кислоти (H2SO4) та вимірюють оптичну густину кінцевого розчину (довжина хвилі 492нм) на мікропланшетному рідері. Оцінюють ступень сіальованості АГП, порівнюючи значення екстинції досліджуваних зразків з екстинцією контрольного зразку (пул плазми крові здорових донорів), в якому ступень сіальованості АГП прийнятий за 100%. Для перевірки наявності вищевказаного технічного результату, за допомогою запропонованого способу, визначався ступень сіальованості альфа1-кислого глікопротеїну плазми крові людини при запальних процесах вірусного та бактеріального походження, а також при проліферативних захворюваннях системи крові за спорідненістю до лектину SNA. За нашими даними, при гострому запальному процесі вірусного походження має місце достовірне підвищення взаємодії АГП з SNA у порівнянні з нормою: афінність АГП до цього лектину при гострому вірусному гепатиті А підвищується на 68%, а при гострому вірусному гепатиті В (без дельтаагенту) - на 6%. Найбільш суттєві зміни спостерігались при гострому вірусному гепатиті В за фульмінантного перебігу: зв'язування АГП з SNA підвищувалось у середньому у 8,57 раз. Напроти, при хронічному вірусному гепатиті С спостерігалось зниження SNA-зв'язувальної здатності АГП на 38 % у порівнянні із нормою (фіг. 1). Враховуючи специфічність SNA, можна зробити висновок про підвищення вмісту сіалових кислот, що приєднані у положенні 2 6 при гострому запальному процесі 53176 6 вірусного походження та зниження цього показника при хронічному запальному процесі. Дослідження сіальованості АГП при сепсисі показало, що вміст сіалових кислот сягав 130% у порівнянні з нормою, тоді як при пневмонії цей показник був лише на рівні 62% (Фіг.2). Зниження сіальованості АГП пояснюється тим, що для запальних процесів бактеріального ґенезу характерною є експресія глікоформ АГП, що переважно містять біантенні глікани і менше поліантенних гліканових структур. Отримані нами дані вказують на менш суттєве порушення сіалювання АГП при гострому запаленні бактеріального походження у порівнянні з гострим запаленням вірусного походження. Як видно з рисунку (Фіг.3), при проліферативних захворюваннях системи крові має місце досить широке варіювання вмісту сіалових кислот у складі АГП при різних видах лейкемій. При мієлопроліферативних захворюваннях було виявлено наступне: зниження вмісту сіалових кислот до 53,12% при поліцитемії та підвищення сіальованості АГП при хронічному мієлоїдному лейкозі до 145,06% відносно норми. Навпаки, всі лімфопроліферативні стани характерізуються підвищенням сіальованості АГП у 1,18-1,97 рази у порівнянні із контрольною групою. Особливо вражаючим є підвищення вмісту сіалових кислот при хронічному лімфолейкозі, що становить 563,27% у порівнянні із контрольною групою. За даними літератури відомо, що лейкоцити при хронічному В-клітинному лейкозі гіперсіальовані внаслідок зростання активності сіалілтрансфераз, тому можна припустити, що підвищений вміст сіалових кислот може спостерігатись не лише у складі мембранних глікопротеїнів, а й таких плазмових білків, як АГП. Таким чином, спосіб дозволяє за рахунок ефективної сорбції деглікозильованих антитіл на полістиролі лунок планшету і використанні лектину, кон'югованого з пероксидазою хрону, підвищити точність визначення вуглеводних детермінант АГП, а також спростити процедуру приготування зразків і кількісно оцінити ступень сіальованості. Запропонований спосіб визначення ступеню сіальованості альфа-1-кислого глікопротеїну характеризується високою чутливістю, специфічністю, простотою і доступністю відносно реагентів і може бути використаний як в клінічних, так і в науководослідних лабораторіях. Технічний результат, що досягається при використанні корисної моделі, визначається комбінацією деглікозильованих антитіл та лектину, кон'югованого з пероксидазою хрону, що дозволяє значно підвищити специфічність та відтворюваність лектин-ферментного аналізу у порівнянні із запропонованими раніше способами. Розроблений спосіб відповідає умові «промислова придатність», що дозволяє кваліфікувати його як «корисну модель», яка може бути використана у лабораторній діагностиці різноманітних патологічних станів. Перелік фігур креслення. 7 53176 Додаток 1. Фіг.1. Ступень сіальованості АГП за спорідненістю до пектину Sambucus nigra agglutinin при процесах вірусного походження (по групах). Додаток 2. Фіг.2. Ступень сіальованості АГП за спорідненістю до лектину Sambucus nigra agglutinin при Комп’ютерна верстка А. Крижанівський 8 запальних процесах бактеріального походження (по групах). Додаток 3. Фіг.3. Ступень сіальованості АГП за спорідненістю до лектину Sambucus nigra agglutinin при проліферативних захворюваннях системи крові (по групах). Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601