Спосіб отримання протимікробного, кровоспинного та цитотоксичного засобу

Спосіб одержання протимікробного, кровоспинного та цитотоксичного засобу шляхом екстракції подрібненої рослинної сировини з надземної частини рослин роду вільха 70 %-ним етанолом з наступною фільтрацією та упарюванням, який відрізняється тим, що як рослинну сировину використовують кору рослин роду вільха, сировину знежирюють хлороформом, одержаний шрот піддають екстракції етанолом методом дрібної мацерації при загальному співвідношенні сировина-екстрагент 1 10-1 15 Винахід відноситься до фармації, а саме до способів одержання біологічно активних засобів з рослинної сировини, зокрема протимікробного та кровоспинного засобу з кори рослин роду вільха, що може бути використаний у якості лікарського засобу зазначеної фармакологічної активності, виконаного у формі рідкого, густого або сухого екстракту, таблеток, мазей, супозиторіїв, гелей, аерозолів тощо Відомий спосіб одержання ранозагоюючого та антимікробного способу (Пат 2152797, РФ 7 А61Р17/02, Заявл 02 06 99р , Опубл 20 07 2000 р Бюл, №20) В якості сировини при здійсненні способу використовують листя горіху волоського, яке попередньо замочують у 35 - 45%-вому спирті етиловому (1 1) протягом 2 годин, потім тричі проводять екстракцію 35 - 45%-вим спиртом етиловим методом настоювання при загальному співвідношенні сировина-екстрагент 1 5 Одержані екстракти об'єднують, настоюють протягом трьох діб при 6 - 10°С, фільтрують і при необхідності концентрують до одержання густого або сухого екстракту №4), який передбачає дробну екстракцію подрібненої смировини 70%-вим етанолом протягом 12 годин при співвідношенні сировина-екстрагент 1 6 - 1 8 Упарений екстракт фільтрують, обробляють етилацетатом у співвідношенні 1 1-1 1,5 та упарюють ефірний витяг до сухого залишку Вихід готового продукту становить 3,5 - 7% Сума поліфенолів з суплідь вільхи клейкої, яку містить одержаний за зазначеним способом екстракт, складається головним чином з похідних елагової кислоти - елаготанінів Екстракт має крововспинну, протизапальну та антимікробну дію Проте одержаний за даним способом сухий екстракт містить залишкову КІЛЬКІСТЬ токсичної речовини - етилацетату, який шоклюдується частками сухого екстракту Вихід цільового продукту складає лише 7% Задачею винаходу є створення способу одержання протимікробного, кровоспинного та цитотоксичного засобу шляхом здійснення визначеної ПОСЛІДОВНОСТІ технологічних операцій при дотриманні заданих режимів, які забезпечують здійснення способу у промислових умовах, одержання високого виходу цільового продукту при скороченні часу проведення процесу, при цьому одержують засіб з вираженим спектром фармакологічної дії, зокрема протимікробної, кровоспинної та цитотоксичної, який може бути використаний у практичній медицині у формі рідкого, густого або сухого екстрактів, таблеток, мазей, супозиторіїв, гелей, аерозолів тощо Проте зазначений спосіб відзначається тривалістю здійснення, одержаний екстракт має вузько спрямовану фармакологічну дію, причому вихід по сухому залишку становить лише 6 - 10% від ваги сировини Відомий також спосіб одержання суми поліфенолів з суплідь вільхи клейкої (Пат 16618, Україна, А61К35/78, Заявл 22 07 85, Опубл 29 07 97, Бюл 1 (О ю 56771 Задача вирішується таким чином, що у способі одержання протимікробного, кровоспинного та цитотоксичного засобу шляхом екстракції подрібненої рослинної сировини з надземної частини рослин роду вільха 70%-вим етанолом з наступною фільтрацією та упарюванням, згідно з винаходом передбачено, що у якості рослинної сировини використовують кору рослин роду вільха, сировину знежирюють хлороформом, одержаний шрот піддають екстракції етанолом методом дробної мацерації при загальному співвідношенні сировина-екстрагент 1 1 0 - 1 15 Вихід цільового продукту складає 17 - 24% від ваги сировини Технологічні операції та режими здійснення заявленого способу визначені експериментальним шляхом Знежирення рослинної сировини проводили для видалення ліпофільного комплексу Експериментально доведено, що спектр біологічної активності засобу за заявленим способом обумовлений фенольними сполуками, які не екстрагуються хлороформом Крім того, при цьому покращуються умови проведення подальших технологічних стадій - упарювання до густої або сухої консистенції Екстракція ліпофільних сполук проводиться малими дозами хлороформу, що суттєво не впливає на вартість цільового продукту Ліпофільна фракція кори рослин роду вільхи містить значні КІЛЬКОСТІ високомолекулярних сполук - стеринів, жирних кислот тощо Ці сполуки заважають процесу концентрації витягу до густого або сухого стану, провокуючи утворення піни та подовжують термін упарювання до сухого стану, додаючи ще технологічні труднощі у виборі умов сушіння Хлороформ використовували як знежирюючий агент тому, що він традиційно використовується в промислових умовах як знежирювач, належить до найбільш ефективних розчинників, що спроможні екстрагувати ліпофільні сполуки Крім того, він належить до пожежебезпечних реагентів, бо є негорючим, та має досить невелику вартість, що важливо для рентабельності виробництва Спирт етиловий був вибраний тому, що він здатний вичерпно екстрагувати комплекс фенольних сполук з кори вільхи, крім того, він належить до найширше використовуваних в фітохімічних виробництвах екстрагентів, 70%-ва концентрація вибрана експериментальним шляхом Дані експерименту приведені в табл 1 Кора рослин роду вільха, наприклад, вільхи клейкої або вільхи сірої містить значні КІЛЬКОСТІ фенольних сполук, а саме пдролізуємих танінів та катехінів Виходячи з цього контроль ефективності розчинника різних концентрацій оцінювали за критеріями вміст екстрактивних речовин та вміст фенольних сполук (перманганатометричний метод ДФ XI видання - метод Левенталя-Нейбауера) За даними табл 1 використання в якості екстрагента спирту етилового 70%вой концентрації найоптимальніше з точки зору вмісту як екстрактивних так і фенольних сполук Таблиця 1 Вміст екстрактивних та фенольних сполук в екстрактах з кори вільхи клейкої, отриманих за допомогою різних екстрагентів № п/п 1 2 3 4 5 Екстрагент Вода 30%-вий етанол 50%-вий етанол 70%-вий етанол 96%-вий етанол Вміст сполук в перерахунку на повітряно-суху сировину, % екстрактивних фенольних 16,93 14,84 15,63 12,47 18,25 14,15 22,75 17,56 12,38 9,34 Примітка результати є середніми 5-х визначень Співвідношення сировина - екстрагент було теж вибрано експериментальним шляхом Вміст екстрактивних та фенольних сполук в екстрактах при різному співвідношенні сировина-екстрагент приведені в табл 2 Таблиця 2 Вміст екстрактивних та фенольних сполук в екстрактах з кори вільхи клейкої, що отримані за допомогою 70%-вого етанолу при різному співвідношенні сировина-екстрагент № п/п 1 2 3 4 Вміст сполук в перерахунку Співвідношення на повітряно-суху сировину, сировина% екстрагент екстрактивних фенольних 1 5 12,45 8,25 1 10 17,6 12,35 1 15 24,04 19,62 1 20 24,97 19,78 Дані таблиці свідчать, що оптимальним є співвідношення сировина - екстрагент 1 1 0 - 1 15 Зменшення співвідношення призводить до різкого зниження вмісту як екстрактивних так і фенольних сполук в екстракті, а збільшення співвідношення економічно недоцільне з-за незначного збільшення вмісту вищезгаданих груп речовин Фільтрування необхідне для запобігання можливої присутності в кінцевому продукті часток подрібненої сировини Заявлений спосіб може включати при необхідності стадію упарювання для отримання крім рідкої інших консистенцій кінцевого продукту - густого або сухого екстракту Це дає більший простір маневрування в технологічному аспекті - при створенні ряду лікарських форм, таких, як супозиторії, гелі, таблетки тощо Використання густого та сухого екстракту дозволить запобігти таких незручностей як неточність дозування, наявність етанолу та ш Спосіб здійснюється таким чином Подрібнену 56771 до розміру часток 0,5 - Змм кору рослин роду вільха заливають хлороформом, отриманий хлороформний екстракт зливають, для більш повного видалення ліпофільної фракції сировину обробляють ще ДВІЧІ порціями хлороформу Шрот видаляють з екстрактора, висушують на повітрі до видалення парів хлороформу Знежирений шрот завантажують в екстрактор, заливають 70%-вим етанолом до дзеркала, екстрагують протягом 12 годин, екстракт зливають в прийомник Екстракцію проводять ще ДВІЧІ Отримані екстракти (загальне співвідношення сировина - екстрагент 1 1 0 - 1 15) об'єднують При необхідності фільтрують При необхідності упарюють до густого або сухого екстрактів Вихід ЦІЛЬОВОГО продукту складає 17 - 24% від повітряно-сухої ваги сировини Спосіб ілюструється конкретними прикладами Приклад 1 5кг подрібненої до розміру часток 0,5мм кори вільхи клейкої заливають 5л хлороформу, через 6 годин отриманий хлороформний екстракт зливають, сировину обробляють ще ДВІЧІ порціями хлороформу по 5л Шрот видаляють з екстрактора висушують на повітрі до видалення парів хлороформу Знежирений шрот завантажують в екстрактор, заливають 20л 70%-вого спирту етилового, екстрагують протягом 12 годин, екстракт зливають в прийомник Екстракцію проводять ще ДВІЧІ порціями по 15л 70%-вого спирту етилового Отримані екстракти (загальне співвідношення сировина - екстрагент 1 10) в обсязі 47л об'єднують При необхідності фільтрують Вихід ЦІЛЬОВОГО продукту складає 17,6% від повітряно-сухої ваги сировини Приклад 2 5кг подрібненої до розміру часток 1мм кори вільхи сірої заливають 5л хлороформу, через 6 годин отриманий хлороформний екстракт зливають, сировину обробляють ще ДВІЧІ порціями хлороформу по 5л Шрот видаляють з екстрактора висушують на повітрі до видалення парів хлороформу Знежирений шрот загружають в екстрактор, заливають 23л 70%-вого спирту етилового, екстрагують протягом 12 годин, екстракт зливають в прийомник Екстракцію проводять аналогічно ДВІЧІ порціями по 20л 70%-вого спирту етилового Отримані екстракти (загальне співвідношення сировина - екстрагент 1 12) в обсязі 60л об'єднують При необхідності фільтрують і концентрують до густої консистенції (вологість 15%) Вихід ЦІЛЬОВОГО продукту складає 21,8% від ваги повітряно-сухої сировини Приклад 3 5кг подрібненої до розміру часток Змм кори вільхи клейкої заливають 5л хлороформу, через 6 годин отриманий хлороформний екстракт зливають, сировину обробляють ще ДВІЧІ порціями хлороформу по 5л Шрот видаляють з екстрактора висушують на повітрі до видалення парів хлороформу Знежирений шрот завантажують в екстрактор, заливають 25л 70%-вого спирту етилового, екстрагують протягом 12 годин, екстракт зливають в прийомник Екстракцію проводять ще ДВІЧІ порціями по 25л 70%-вого спирту етилового Отримані екстракти (загальне співвідношення сировина - екстрагент 1 15) в обсязі 72л об'єднують При необхідності фільтрують, концентрують в вакуумі до густої консистенції Після цього сушать в вакуум-сушильній шафі або сушарці до сухого залишку Вихід ЦІЛЬОВОГО продукту складає 24,0% від ваги сировини Приклад 4 Біологічну активність засобу, одержаного заявленим способом, визначали наступним чином Кровоспинну активність розглядали як гемостатичну при визначенні швидкості згортання крові за Альгаузеном Нормальні показники швидкості згортання крові при застосуванні даного методу складають 5 - бхв при кімнатній температурі Час згортання крові визначають за допомогою секундоміру, результати приведені втабл З Таблиця З Порівняльне вивчення швидкості згортання крові під дією густого та сухого екстрактів кори вільхи клейкої № п/п Назва вивчаємої сполуки 1 Контроль Амінокапронова кислота 2 (гемостатик) Густий екстракт кори ві3 льхи клейкої (0,25мг/кг) Сухий екстракт кори ві4 льхи клейкої (0,25мг/кг) Час, секунди 180 118 103 114 Аналіз результатів експериментів свідчить, що густий та сухий екстракт кори вільхи клейкої проявляє гемостатичний ефект, який можна співпіставити з гемостатичним ефектом амінокапронової кислоти Для оцінки цитотоксичної дії був використаний модифікований метод Шрека Суть цього методу полягає в тому, що при суправітальному фарбуванні 1% водним розчином метиленового синього живі клітини кісткового мозку не пропускають барвник, в тої час як мембрана пошкоджених клітин фіксує забарвлення Для визначення цитотоксичної дії екстрактів у пробірки вносили по 0,125мл клітинної зависі (з концентрацією 24 х 104 кліток в мл3) і 0,125мл 2% розчину Контролем служили серії з додаванням 0,125мл фізіологічного розчину Час експозиції становив 15 хвилин Була використана модель, на фоні якої тестувалися наступні препарати ессенціале, сіл і бор, густий екстракт з кори вільхи клейкої Вказані препарати вносилися у пробірки в аналогічних дозах і об'ємах (табл 4) Отримані дані наведені втабл 4 56771 Таблиця 4 Вплив вивчаємих екстрактів на клітини кісткового мозку (п = 5) Речовини (2% розчини КІЛЬКІСТЬ ЖИ- Токсичність, з розведенням 1/8) ВИХ КЛІТИН, % % контроль 98 2 ессенціале 50 50 силібор 26 74 густий екстракт 14 86 Отримані результати переконливо доводять цитотоксичний ефект на клітини кісткового мозку для густого екстракту з кори вільхи клейкої В даній комбінації найбільш активним виявився густий екстракт з кори вільхи, що дозволяє передбачити його дію при злоякісних новоутвореннях Приклад 5 Протимікробну активність отриманої субстанції вивчали за методом дифузії в агар (метод "колодязів") З використанням двошарової заливки чашок Як тест-культури використовували різні музейні та КЛІНІЧНІ штами бактерій та грибів Corynebactenum diphthenae, Staphylococcus aureus АТСС 25923, Eschenchia coll ATCC 25922, Pseudomonas aerugmosa ATCC 9027, Bacillus subtillus ATCC 6633, Candida albicans ATCC 885-653 Музейні штами одержані з Державного інституту стандартизації культур їм Л А Тарасевіча (Москва) та інституту мікробіологи їм Л Пастера (СанктПетербург) Результати приведені втабл 5 Таблиця 5 Протимікробна активність отриманої субстанції з кори вільхи клейкої в порівнянні з прототипом густим екстрактом листків волоського горіха Тест-штам и Corynebactenum diphthenae Staphylococcus aureus ATCC 25923 Eschenchia coh ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Bacillus subtillus ATCC 6633 Candida albicans ATCC 885-653 Діаметр затримки росту мікроорганізмів, мм Густий екстракт кори 70% спирт вільхи клейкої 20,2 14,3 14,0 13,3 Таблиця 6 Протимікробна активність отриманої субстанції (густого екстракту) з кори вільхи клейкої відносно коринебактерій дифтерії Діаметр зон затримки росту СогупеКонцентрація bactenum diphthenae (мм), бюваріанрозчину субту станції, % Gravis Mitis n X±m n X±m 0,25 32 6,47 ±1,85 10 12,0 ±3,28 0,5 42 11,69 ±1,74 12 15,67 ±3,38 1,0 38 17,90 ±1,42 11 21,67 ±1,44 2,0 16 24,26 ± 0,57 9 22,13 ±1,75 Даний спосіб промислово здійснюваний, не потребує спеціального обладнання, не створює додаткових труднощів у реалізації, здійснюється за досить короткий час, зумовлює високий вихід кінцевого продукту з біологічною активністю (протимікробна, кровоспинна, цитотоксична дія), що може застосуватися в фармації та медичній практиці при лікуванні інфекційних уражень шкіри та слизових оболонок, що супроводжуються виразками та кровотечіями Спосіб дозволяє одержувати ефективний лікарський засіб у формі рідких, густих та сухих екстрактів, мазей, гелей, супозиторіїв, таблеток тощо 27,7 Примітка 1) "-" - діаметр затримки росту мікроорганізмів менш ніж 10мм, 2 - дані с середніми значеннями 5-х визначень З даних табл 5 витікає, що густий екстракт кори вільхи клейкої має досить широкий спектр протимікробної активності, в відношенні грампозитивних та грам негативи их мікроорганізмів (крім спороутворюваючої культури Bacillus subtillus) Найбільш виражений ефект густий екстракт кори вільхи мав в відношенні культур Staphylococcus aureus та Corynebactenum diphthenae Крім того, протимікробна активність до корінебактерп дифтерії була визначена на 54-ох штамах дифтерійної палички Токсикогенні штами складалися з 42 культур бюваріанту gravis та 12 культур бюваріанту mitis Всі штами виділені від хворих на дифтерію та носив коринебактерії за період епідемії 1991 - 1998рр у Харківській області Результати приведені в табл 6 3 даних табл 6 видно, що густий екстракт з кори вільхи клейкої в розчинах в концентраціях 1% та 2% має виражену антимікробну дію в відношенні різних штамів коринебактерії, що може мати значення при створенні лікувальних та профілактичних антидифтерійних засобів Підписано до друку 05 06 2003 р Тираж 39 прим ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24