Спосіб виготовлення алергену з атипових мікобактерій (аам)

Спосіб виготовлення алергену з атипових мікобактерій (ААМ) шляхом осадження протеїнів культуральних фільтратів виробничих штамів атипових мікобактерій (моноалергенів) розчином трихлороцтової кислоти, наступним очищенням розчином сірчанокислого амонію та діалізом солей з них, який відрізняється тим, що моноалергени готують з виробничих штамів атипових мікобактерій M.scrofulaceum-23 й M.intracelulare-35 та змішують їх у рівних частинах згідно з біологічною активністю, яка визначається в одиницях активності на основі розрахунків. (19) (21) 2002086447 (22) 02.08.2002 (24) 15.02.2006 (46) 15.02.2006, Бюл. № 2, 2006 р. (72) Кассіч Володимир Юрійович, Кассіч Юрій Якович, Завгородній Андрій Іванович, Шаров Олександр Миколайович, Горжеєв Володимир Михайлович (73) Кассіч Володимир Юрійович, Кассіч Юрій Якович, Шаров Олександр Миколайович, Завгородній Андрій Іванович, Горжеєв Володимир Михайлович (56) US 4489158 18.12.84. RU C1 2031656 27.03.95. UA C2 36006 17.02.03. 3 60447 4 3 ставлено завдання розробити спосіб виготовлення 0,005; 0,0005 мг протеїну в 1см розчину. алергену з атипових мікобактерій (ААМ), що Облік реакцій проводили через 24 години. включає виготовлення моноалергенів шляхом Діаметр алергічних реакцій визначали за допомоосадження протеїну з культуральних фільтратів гою металевої лінійки. Результати досліджень завиробничих штамів, наступним очищенням розчиносили до таблиці 2. ном сірчанокислого амонію та діалізом солей з На підставі одержаних результатів алергічних них. Моноалергени готують з виробничих штамів досліджень розраховували середньоарифметичне атипових мікобактерій M.scrofulaceum-23 та значення діаметру шкіряної реакції для кожного M.intracelulare-35, а для виготовлення готового розведення кожного моноалергену з атипових препарату, алергену з атипових мікобактерій мікобактерій і ППД-туберкуліну у морських свинок (ААМ), моноалергени змішують у рівних частинах сенсибілізованих гомологічними штамами згідно біологічної активності, визначеній в одинимікобактерій та складали графіки активності цях активності на підставі розрахунків. досліджених препаратів (Фіг). Згідно настанови про проведення На осі "абсцис" графіку визначали симультанної алергічної проби з ППДінтенсивність алергічних реакцій в мм на монотуберкуліном для ссавців та комплексним алергеалергени у тварин сенсибілізованих гомологічними ном з атипових мікобактерій доза останнього сташтамами. Вісь "ординат" відображала числове 3 значення розведення моноалергену в логарифмах новить 675,0135,0 ОА в 0,1см . Таким чином годози. товий препарат повинен містити 6750,01350,0 ОА 3 Щоб порівняти активність моноалергенів з в 1,0см стандартного розчину. активністю туберкуліну, визначити їх біологічну При розробці технології виробництва алергену активність в одиницях активності (ОА) та приготуз атипових мікобактерій (ААМ) для досягнення 3 вати з моноалергенів комплексний препарат ААМ концентрації 675,0135,0 ОА в 0,1см в основному шляхом змішування їх в рівних частинах згідно розчині готували стандартні розчини біологічної активності, визначали такі дози моноалергенів виробничих культур атипових моноалергенів, при введенні яких спостерігався мікобактерій, кожен з яких містив 1,0 (0,80,3)мг 3 еквівалентний ефект (розвиток алергічних реакцій протеїну в 1см . Масову частку білку в моноалеррівної інтенсивності). На фігурі видно, що для цьогенах визначали по білковому азоту методом го треба визначити величину різниці логарифмів К'єльдаля. Утримання білку в моноалергенах 3 доз, що дають однаковий ефект - розвиток у доводили до 1,0 (0,80,3) мг/см методом гомологічне сенсибілізованих тварин алергічних концентрації полієтиленггликолем (ПЕГ) або розреакцій рівної інтенсивності (пряма AD, яка веденням дистильованою водою. перетинає графічні зображення активності обох Стандартні розчини моноалергенів для досягмоноалергенів та туберкуліну на рівні алергічної нення вихідної концентрації протеїнів в основному реакції з еквівалентним для всіх моноалергенів розчині напівфабрикату ААМ змішували у рівних середнім діаметром). Далі, на підставі розрахунків, частинах згідно біологічної активності, визначеній визначали активність кожного моноалергену в в одиницях активності на підставі розрахунків. одиницях активності (ОА). Для цього з показнику Для визначення активності моноалергенів з за логарифму дози або відносної активності моно3-4 тижні перед проведенням дослідження алергену (log R) обчислювали антилогарифм дози роздільно проводили щеплення (сенсибілізацію) (anti log R) за допомогою таблиці логарифмів або морських свинок (по 15 голів на кожен штам) log R за формулою anti log R = 10 , а далі визначали бактеріальною масою виробничих культур скоточислове значення ОА, збільшуючи значення (anti хромогенних (штам M.scrofulaceum-23), нефотоlog R) на 10000 за формулою: хромогенних (штам M.intracellulare-35) мікобактерій та культурою M.bovis (штам BCG) в 3 дозі 1мг бактерійної маси в 1см стерильного фізиологічного розчину на голову внутрішньом'язево. З розчинів кожного моноалергену, що містив 3 по 1мг протеїну в 1см готували розведення: 0,5; 3 0,05; 0,005; 0,0005мг/см та визначали (за допомогою таблиць логарифмів) десятинні логарифми для кожного розведення (дози), результати заносили до таблиці 1. Кожній морській свинці, роздільно щепленій виробничими штамами атипових мікобактерій внутрішньошкірно вводили розведення 3 гомологічних моноалергенів в об'ємі 0,1см в чотирьох ділянках тіла на боках згідно схеми, наведеної в таблиці 2. Ділянки шкіри заздалегідь звільняли від волосся. Морським свинкам, щепленим мікобактеріями бичачого виду (штам БЦЖ) згідно тієї ж схеми (табл.2) внутрішньошкірно вводили ППДтуберкулін для ссавців, який попередньо розчиняли в тих же дозах, що й моноалергени: 0,5; 0,05; OA  10logR 10000 Таким чином визначали умовну одиницю активності (ОА) кожного алергену, яка складається з двох показників: сенсибілізуючих властивостей культури й активності виготовленого з неї алергену. Одиниця активності (ОА) - це кількість алерге3 ну (в мг/см протеїну), при введенні якої у гомологічне сенсибілізованих тварин розвиваються алергічні реакції рівної інтенсивності (еквівалентні реакції). ААМ готували шляхом змішування моноалергенів у рівних частинах згідно визначеної активності. Приклади. При проведенні алергічних досліджень встановили, що середні арифметичні значення діаметрів папул в ділянках введення моноалергенів з атипових мікобактерій і ППДтуберкуліну для ссавців дорівнюють величинам, що наведені в таблиці 3. Графічне зображення матеріалів таблиці 3 відібражені на фігурі. В прикладі 1 (Фіг.) пряма AD перетинає криві 5 60447 6 активності всіх трьох моноалергенів на рівні ли його кількість, яка при внутрішньошкірному інтенсивності Шкіряної алергічнох реакції введенні призводила до розвитку у гомологічне 1 діаметром 5,5 мм. Вертікальні лінії з крапок А , В і сенсибілізованих тварин шкіряних алергічних С до осі "ординат" визначають логарифми дози реакцій рівної інтенсивності. моноалергенів з M.scrofulaceum (приклад 1) та В прикладі 1 одиниця активності (OA) моноM.intracellulare (приклад 2) та M.bovis (штам BCG). алергену M.scrofulaceum дорівнювала 3 Логарифми доз моноалергенів з 0,0005х10=0,005мг/см . В прикладі 2 одиниця M.scrofulaceum (приклад 1) та з M.intracellulare активності моноалергену з M.intracellulare 3 складають 0,69 та 1,69 відповідно. При визначенні дорівнювала 0,005х10=0,05мг/см . На підставі логарифма дози (відносної активності) туберкуліну проведених розрахунків готували розчини моно враховували, що на осі "ординат" 3 log дорівнює алергенів виробничих культур атипових 80 мм ("клітинам"). Таким чином 1 мм ("клітина") мікобактерій, а з них, шляхом змішування у рівних дорівнює 0,038 log. Логарифм дози моноалергену частинах згідно визначеної активності готували з M.bovis складає 2,69+(13х0,038) = 3,184 log. стандартний розчин алергену з атипових Одержані результати переводили в антилогарифмікобактерій. ми. В прикладах 1 та 2 антилогарифми доз для Виготовлений таким чином препарат містить 3 моноалергенів з виробничих культур 6750,0  1350,0 одиниць дії (ОД) в 1,0см станM.scrofulaceum та M.intracellulare складаюли дартного розчину, що відповідає вимогам наставідповідно 0,0005 та 0,005. В прикладі 3 антилоганови про проведення симультанної алергічної рифм дози туберкуліну дорівнював: anti log R = 10 проби з ППД-туберкуліном для ссавців та алергеlog R = 1527,6%; OA = 1527,6 : 10000 = 0,1528). ном з атипових мікобактерій. За одиницю активності моноалергену приймаТаблиця 1 Розведення 1 2 3 4 3 3 Утримання протеїну в 1 cм моноалергену (мг/см ) 0,5 0,05 0,005 0,0005 Логарифм дози x1000 3,69 2,69 1,69 0,69 Таблиця 2 №№ Морських свинок 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Сума: Інтенсивність алергичних реакції (в мм) на введення розведень моноалергенів в 4 ділянки шкіри морських свинок лівий бік правий бік IIIIIIIVIIIIIIVIIIIIVIIIIVIIIIIIIІІIIIIVIIIIIIVIIIIIVIIIIVIII IIIIIIIIIIVIIIIIIVIIIIIVIIIIVIIIIIIIIIIIIIVIIIIIIVIIIIIVIIIТаблиця 3 Найменування виробничої культури мікобактерій M.scrofulaceum M.intracellulare M.bovis (BCG) Діаметр шкіряних алергічних реакцій (в мм) на введення гомологічних моноалергенів з розведень: 3 3 3 3 0,5мг/см 0,05мг/см 0,005мг/см 0,0005мг/см 8,0  0,1 7,5  0,15 6,5  0,8 5,5  0,9 7,0  0,15 6,5  0,9 5,5  0,25 4,5  0,2 6,0  0,4 5,0  0,3 4,0  0,4 3,0  0,2 Графічне зображення визначення активності моноалергенів з атипових мікобактерій та туберкуліну. 7 Комп’ютерна верстка М. Клюкін 60447 8 Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601