Спосіб одержання комплексної сполуки платини (іі) з н-днк

1 Спосіб одержання комплексної сполуки платини (II) з н-ДНК, який включає змішування високомолекулярної н-ДНК, що виділена з селезінки великої рогатої худоби, з водним розчином суміші хлориду та цитрату натрію, повільне нагрівання суміші розчину та н-ДНК, розчинення цисдихлородіамінплатини (ДДП) у попередньо нагрітому розчині суміші хлориду та цитрату натрію, змішування попередньо приготованих розчинів у таких кількостях, що мольне співвідношення ДДП, н-ДНК, хлориду та цитрату натрію відповідає співвідношенню 6 4 ЗО 3, та термостатування при тій самій температурі протягом 15-20 хвилин, який відрізняється тим, що додатково включає витримування суміші н-ДНК з розчином хлориду та цитрату натрію протягом 2026 годин перед повільним нагріванням суміші, повільне нагрівання суміші розчину солей та нДНК до 88,0-90,0°С, розчинення ДДП у попередньо нагрітому до температури 88,0-90,0°С цитратносольовому розчині, а змішування попередньо приготованих розчинів проводять шляхом поступового додавання розчину ДДП до розчину н-ДНК 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що після термостатування при температурі 88,0-90,0°С розчин піддають ліофільному висушуванню 3 Спосіб за пп 1, 2, який відрізняється тим, що до ліофільно висушеної речовини додають дистильовану воду, перемішують, центрифугують, осад ВІДДІЛЯЮТЬ від розчину, промивають водою, спиртом, ефіром та висушують Винахід відноситься до комплексних сполук платини, що мають біологічну активність, яка виражена їх протипухлинною властивістю, та може бути застосований для одержання лікарського протипухлинного засобу Відомий спосіб одержання комплексної сполуки платини (П) з нативною ДНК (н-ДНК), що має протипухлинну активність, який включає зміщування високомолекулярної н-ДНК, що характеризується молекулярною масою 7-17 МДальтон (марки А) та яка виділена з селезінки великої рогатої худоби , з водним розчином суміші хлориду та цитрату натрію (цитратно-сольовим), повільне нагрівання (1°С за хвилину) до 78±0,5°С, розчинення цис-дихлородиаммшплатини (ДДП) у попередньо нагрітому до температури 78±0,5°С цитратно-сольовому розчині, змішування попередньопідготованих розчинів у таких кількостях, що мольне співвідношення ДДП, н-ДНК, натрію хлориду та натрію цитрату відповідає співвідношенню 6 4 ЗО 3, з наступним їх термостатуванням при температурі 78±0,5°С протягом 15-20 хвилин Закінчення взаємодії реагентів фіксують по досягненню параметрів УФ-спектра поглинання охолодженої суміші Я, т а х =266,2±0,1нм та 1 Е266 2-10000±100 л моль 1см 1 Одержану речовину виділяють у вигляді твердої субстанції, або застосовують без розділення з сумішшю цитратносольового розчину [пат СРСР № 1813089, C07F 15/00, А61 К 31/295] Застосовані у відомому способі параметри проведення процесу не забезпечують повного розгортання волокон н-ДНК, необхідного ступеню роз'єднання нитей дволанцюжкових спіралей макромолекул н-ДНК на їх важ- коплавких ділянках та необхідної ПОСЛІДОВНОСТІ взаємодії мономірних одиниць н-ДНК з молекулами ДДП, що призводить до одержання сполуки з просторовою структурою, яка характеризується температурою плавлення 78,5±0,5°С, максимальним гіперхромним ефектом (МГЕ) ДЕ258 0=10±1,0% при температурі 83,0±0,5°С та обумовлює зниження протипухлинної и дії та підвищення токсичності сполуки (О о> ю о 60597 ненням температури плавлення 85,5±0,5°С, (МГЕ)А Е258 0=17,5±1,2% при температурі 92,0±0,5°С цільового продукту Дослідження показали, що н-ДНК з молекулярною масою 7-17 МДальтон та з молекулярною масою 4,5-7,0 МДальтон не відрізняється за ХІМІЧНИМИ та біологічними властивостями, що дозволяє використовувати для приготування комплексної сполуки як н-ДНК марки А, так і н-ДНК марки Б Для виділення комплексної сполуки з розчину, розчин піддають ліофільному висушуванню Одержана суміш сполук являє собою дрібнокристалічний порошок жовтого кольору та відповідає формулі {[РЮІ(МНз)(Н2О)]б}п- М flHK+30nNaCI+3nNa3Cyt 5,5H2O, що відповідає Спосіб одержання комплексної сполуки платирозрахованій КІЛЬКОСТІ елементів, % ни (П) з н-ДНК, який включає змішування високомолекулярної н-ДНК, що виділена з селезінки веPt 20,23, СІ 22,10, С 11,83, N 5,08, Р 2,14, Н ликої рогатої худоби, з цитратно-сольовим розчи2,19, Na 15,51 та співпадає з показниками аналізу ном, повільне нагрівання суміші розчину та ДНК, сполуки одержаної способом за прототипом До розчинення ДДП у попередньо нагрітому цитратпорошку додають дистильовану воду та ретельно но-сольовому розчині, змішування попередньо перемішують для видалення водорозчинних хлопідготованих розчинів у таких кількостях, що мольриду та цитрату натріюОдержану завісь центрине співвідношення ДДП, н-ДНК, натрію хлориду та фугують, осад ВІДДІЛЯЮТЬ від розчину, промивають натрію цитрату відповідає співвідношенню послідовно водою, спиртом, ефіром та висушують 6 4 ЗО 3, та термостатування при тій самій темпеВиділена індивідуальна сполука являє собою ратурі протягом 15-20 хвилин, який, ВІДПОВІДНО ДО дрібнокристалічний порошок коричневого кольору винаходу, додатково включає витримування та відповідає сполуці полі{гексакис [хлороаммінасуміші н-ДНК та цитратно-сольового розчину прокваплатина (П)]} дезоксірібонуклеат формули тягом 20-26 годин перед повільним нагріванням {[PtCI(NH2)(H2O)]6}n-^-flHK, що відповідає розрасуміші, повільне нагрівання суміші розчину солей хованій КІЛЬКОСТІ елементів, % Pt 39,58, СІ 7,21, С та ДНК до 88,0-90,0°С, розчинення ДДП у попе15,83, N9,95, Р4.19, Н 2,67 редньо нагрітому до температури 88,0-90,0°С цитПриклад 1 0,500 г високомолекулярної н-ДНК ратно-сольовому розчині, а змішування попередмарки А (молекулярної маси 13,6 МДальтон), яка ньо приготованих розчинів проводять шляхом повиділена з селезінки великої рогатої худоби, зміступового додавання розчину ДДП до розчину ншували при кімнатній температурі 22°С з 0,375л ДНК водного розчину, що включав 15 ммоль/л NaCI+1,5 Одержання комплексної сполуки платини (П) з ммоль/л ІЧазСуі: та витримували суміш при такій н-ДНК способом, що заявляється, забезпечує розтемпературі до повного розгортання волокон нгортання волокон н-ДНК в цитратно-сольовому ДНК протягом 22 годин Після цього суміш постурозчині, новий температурний режим - роз'єднання пово нагрівали зі швидкістю 1 °С за хвилину в тернитей дволанцюжкових спіралей макромолекул нмостаті до 88±0,5°С 0,675г ДДП розчиняли в поДНК на їх важкоплавких ділянках, а ПОСЛІДОВНІСТЬ передньо підігрітому до 88±0,5°С цитрат-нозмішування розчинів вихідних компонентів забезсольовому розчині такої самої концентрації До печує необхідну ПОСЛІДОВНІСТЬ взаємодії мономіррозчину н-ДНК поступово додавали розчин ДДП та них одиниць н-ДНК з молекулами ДДП, що в ретермостатували суміш протягом 15 хвилин при зультаті дозволяє одержати комплексну сполуку з 88±0,5°С Встановлювали температуру плавлення іншою просторовою структурою, яка характеризусполуки за прикладом та МГЕ при температурі ється температурою плавлення 85,5±0,5°С, (МГЕ) 92,5°С Одержану суміш люфілізували та ДЕ258 0 =17,5±1,2% при температурі 92,0±0,5°С аналізували одержану кристалічну речовину Задача винаходу полягає в удосконаленні способу одержання комплексної сполуки платини (П) з н-ДНК, шляхом введення додаткової операції витримування н-ДНК у суміші розчинів перед нагріванням, зміни режиму нагрівання та використанням іншої ПОСЛІДОВНОСТІ змішування розчинів нДНКта ДДП, що забезпечує одержання комплексної сполуки з просторовою структурою, яка утворюється при повному розгортанні волокон н-ДНК, необхідному ступеню роз'єднання нитей дволанцюжкових спіралей макромолекул н-ДНК на їх важкоплавких ділянках та необхідної ПОСЛІДОВНОСТІ взаємодії мономірних одиниць н-ДНК з молекулами ДДП, що обумовлює підвищення протипухлинної дії сполуки та зниження и токсичності Розгортання волокон н-ДНК у розчині проходить протягом 20-26 годин в залежності від температури навколишнього середовища, що коливається звичайно від 20°С до 25°С Ступінь розгортання волокон н-ДНК контролювали за ступенем мутності у порівнянні з мутністю еталонного "розчину III" ("Государственная фармакопея СССР" XI вид , Москва, Медицина, 1987г, стор 198) Ступінь роз'єднання нитей двохланцюжкової спіралі макромолекул н-ДНК фіксували по досягненню розчином при 88,0-90°С параметрів УФ-спектру поглинання Я, тах =258,0±0,1нм та Е258 о-9600-9800л моль1см 1 Необхідну ПОСЛІДОВНІСТЬ взаємодії мономерних одиниць нДНК з молекулами ДДП контролювали за досяг Приклад 2 0,500 г високомолекулярної н-ДНК марки Б (молекулярної маси 4,5 МДальтон), яка виділена з селезінки великої рогатої худоби, змішували при кімнатній температурі 25°С з 0,375л водного розчину, що включав 15 ммоль/л NaCI+1,5 ммоль/л ІЧазСуі: та витримували суміш при такій температурі до повного розгортання волокон нДНК протягом 20 годин Після цього суміш поступово нагрівали зі швидкістю 1 °С за хвилину в термостаті до 88±0,5°С 0,675г ДДП розчиняли в попередньо підігрітому до 88±0,5°С цитратносольовому розчині такої самої концентрації До розчину н-ДНК поступово додавали розчин ДДП та термостатували суміш протягом 20 хвилин при 88±0,5°С Одержану суміш люфілізували, до порошку додавали дистильовану воду, ретельно 6 5 60597 перемішували та центрифугували Одержаний МГЕ при температурі плавленнясполуки та осад промивали послідовно водою, спиртом, 92,5°С ефіром та висушували Одержану кристалічну Умови прикладів синтезів комплексної сполуки сполуку аналізували, встановлювали температуру та результати аналізу синтезованої комплексної сполуки надані в таблиці 1 Таблиця 1 Характеристика умов синтезу МолекуПри Витри- лярна Темпера- ТермостаМГЕ при кла муван- маса нтпл,°с±о, 92,5°С тура син- тування, ня, гоДНК, Д 5 тезу, °С хвилин % дин М Дальтон 1 22 13,6 88,0±0,5 15 18,0 85,5 2 25 4,5 88,0±0,5 20 17,9 85,5 3 26 6,0 90,0±0,5 15 17,6 85,5 4 22 7,0 90,0±0,5 15 18,3 85,5 ВІДПОВІДНІСТЬ синтезованої сполуки наведеній у формулі підтверджує УФ-спектр поглинання розчину з Я,=266,2±0,1нм, а також проведений елементний аналіз одержаної сполуки у суміші з солями (приклад 1) та в індивідуальному стані (приклади 2-4), що наведений в таблиці Характеристика одержаної сполуки КІЛЬКІСНИЙ склад, % Pt СІ С N Р Н Na 20,44 39,84 39,63 39,90 22,12 7,46 7,36 7,50 11,59 15,67 15,90 15,41 5,07 10,17 9,87 10,08 1,96 4,48 4,30 4,29 2,60 2,73 2,87 2,90 15,46 вивки пухлини, яка виражена у відсотках КІЛЬКІСТЬ загиблих інтактних тварин в кожній групі відмічали кожні 24-48 годин Розрахунок токсичної дози ЛДбо проводили за методикою Літчфілда Уїлкоксона, летальну дозу - ЛДюо - визначали експериментальне Протипухлинну активність препаратів оцінювали на основі експериментів, що були проведені на сімох групах тварин (в кожній групі по 10 тварин) Білим безпородним пацюкам вагою 150200 г під шкіру стегна трансплантували 2 10 6 клітин перевивного штаму карциноми Герена Тваринам 1 групи (контроль) вводили цитратно-сольовий розчин, 2-ої групи - розчин сполуки одержаної за прототипом, 3-6 - ін'єкції ВОДНИХ розчинів сполук, одержаних ВІДПОВІДНО до прикладів 1-4, в яких вона утворилася за заявкою(15ммол/л NaCI +1,5ммоль/л NsCyt), а сьомій групі - суспензію індивідуальної сполуки за прикладом 3 Препарати вводили внутрішньочеревино, через три доби після трансплантації пухлин, тричі, різними дозами з інтервалом 1-3 дні Протипухлинну активність оцінювали за гальмуванням росту пухлини (%) та тривалості життя (доби) Відміна просторової структури сполуки, що одержана від просторової структури сполуки за прототипом підтверджується ВІДМІННИМИ характеристикою максимального гіперхромного ефекту, температурою його досягнення та температурою плавлення одержаної сполуки Токсичність сполук, одержаних в прикладах, досліджували на групах тварин, створених з статевозрілих нелінійних мишей вагою 30,0±2 г, які пройшли карантин протягом 20 днів (в кожній групі по 10 тварин) Розчин сполуки вводили внутрішньочеревино тричі на день по 0,5 мл з інтервалом дві години Для ІН'ЄКЦІЙ використовували водний розчин сполуки, в якому вона утворилася (15ммол/л ЫаС1+1,5ммоль/л NasCyt) або суспензію з виділеною індивідуальною сполукою в цитратно-сольовому розчині Сумарні дози препаратів складали 34,0, 68,0, 100,0 та 130,0 160,0 мг/кг Токсичність характеризували дозою , яка викликає загибель 5 0 % інтактних тварин та 100% інтактних тварин, а також за виживаністю тварин на ЗО добу після пере Результати проведених досліджень зведені в таблиці 2 Таблиця 2 Групи тварин 1 2 3 4 5 6 7 Ін'єкція сполуки Цитратносольовий розчин NaCfl, Na3Cyt Розчин сполуки за прототипом Розчин сполуки за прикладом 1 Розчин сполуки за прикладом 2 Розчин сполуки за прикладом 3 Розчин сполуки за прикладом 4 Суспензія сполуки за прикладом 3 Доза сполуки, мг/кг Токсична доза LD50 мг/кг Летальна доза LD,00 мг/кг Виживаність Ступінь гальтварин, % на ЗО мування росту добу пухлини, % 26,3 16,1 0 0 18±6 45 102 136 90 83 33±4 45 126 160 100 95 36±4 45 132 160 100 93 35±3 45 128 160 100 96 36±5 45 130 160 100 95 36±4 45 128 160 100 92 36±3 Подовженість життя, діб 7 60597 Аналіз даних таблиці дозволяє зробити висновок, що введення ДНК марки Б, операції витримування ДНК, підвищення температури нагрівання і термостатування та зміна ПОСЛІДОВНОСТІ змішуван ня компонентів забезпечує Комп'ютерна верстка М Клюкш одержання 8 лі{гексакіс[хлороамшакваплатина (П)]}дезксірібонуклеату іншої просторової структури, яка характеризується більшою активністю та меншою токсичністю [по Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119