Спосіб моделювання антифосфоліпідного синдрому

Спосіб моделювання антифосфоліпідного синдрому під час вагітності з використанням пасивної імунізації тварин імуноглобулінами класу G, які отримані в результаті активної імунізації мишей антигенами клітинної стінки бактерій, що включає CO со О) 6131 того, деяким дослідникам не вдалося викликати АФС таким шляхом, що говорить про низьку відтворюваність вказаної методики. Відомий спосіб моделювання антифосфоліпідного синдрому під час вагітності, що заснований на можливості активної імунізації вагітних мишей бактеріальними екстрактами Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Shigella dysenteriae, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella pneiimoniae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, tetanus toxoid, Candida albicans. Мишей імунізували інтрадермально (10мг антигену) і повторювали імунізацію внутрівенне через три тижні з метою створення вторинної імунної відповіді [4]. До причин, що стримує досягнення очікуваного технічного результату є погана відтворюваність експерименту - в деяких випадках не вдалося зафіксувати з'явлення антифосфоліпідних антитіл в сироватці. Наявність аФА у сироватці не завжди супроводжувалась клінічними проявами АФС під час вагітності. Найбільш близьким до корисної моделі, що заявляється, є спосіб моделювання антифосфоліпідного синдрому під час вагітності, що містить застосування пасивної імунізації вагітних мишей імуноглобулінами G очищеними за допомогою афінної хроматографії від пацієнтів з проявами антифосфоліпідного синдрому. Імунізація проводилась у кількості Юмкг IgG у хвостову вену за добу до спарювання, та на 1 і 4 добу вагітності. У імунізованих тварин дослідники виявили збільшення кількості плодів, що підверглися резорбції, зменшення їх ваги та ваги плацент, збільшення тривалості активованого часткового тромбопластинового часу [3, 8]. До причин, що стримує досягнення очікуваного технічного результату є відсутність постійного джерела антитіл, адже в експерименті були використані антитіла певних пацієнтів, залежність успіху експерименту від титру антифосфоліпідних антитіл у пацієнтів, який, в свою чергу, залежить від активності і фази аутоімунного процесу. В основу корисної моделі поставлено задачу створити такий спосіб моделювання антифосфоліпідного синдрому під час вагітності з застосуванням антигенів інфекційного походження, який дає стабільні високі титри аФА з клінічними акушерськими проявами АФС, який можна легко відтворити, який виключає можливу дію інфекційних антигенів безпосередньо на систему гемостазу та фетоплацентарний комплекс, який відображає етіопатогенетичну сутність антифосфоліпідного синдрому, та який потребує мінімум фінансових витрат, що забезпечує підвищення якості експерименту та надає передумови для його широкого впровадження. Вищезазначений результат досягається тим, що у запропонованому способі моделювання антифосфоліпідного синдрому з використанням інфекційних антигенів використовується антиген клітинних стінок клінічного штаму Staphylococcus aureus, відібраного від пацієнток з підтвердженим клінічно та лабораторно АФС, яким проводиться активна імунізація тварин з подальшим отриманням IgG з асцитичної рідини за допомогою афінної хроматографії та пасивною імунізацією іншої групи мишей під час вагітності у другій фазі експерименту. Застосування поверхневих антигенів золотистого стафілокока обумовлено наявності у більшості клінічних штамів білка Sbi, який зв'язує імуноглобуліни G та бета-2-глікопротеїн-1, змінюючи конформацію останнього, що спричиняє індукцію антифосфоліпідного синдрому [10]. Запропонована авторами оригінальна схема пасивної імунізації дозволяє спостерігати розвиток антифосфоліпідного синдрому і його акушерських ускладнень (плацентарна недостатність) та виключити безпосередню дію антигенів клітинної стінки на систему мати-плацента-плід. Приклад. Антиген клітинних стінок St. aureus, який готували методом ультразвукової дезінтеграції, очищали за допомогою центрифугування та перевіряли на стерильність шляхом пересівання на м'ясо-пептонному агарі вводили з метою отримання антитіл мишам лінії BALB/c інтраперитонеально по 200мкг стафілококового антигену у розчині хлориду натрію 0,9% (0,25мл) та 0,25мл неповного ад'юванту Фрейнда семикратно з тижневим інтервалом. Через 7 днів після закінчення імунізації відбирали асцитичну рідину у кількості 35мл. За допомогою афінної хроматографії на протеїн-А-сефарозному гелі виділяли фракцію IgG в обох групах з послідуючим виявленням концентрації імуноглобулінів за методом Лоурі. У другій фазі експерименту використовували 90 самок мишей лінії BALB/c, які були розділені на слідуючи підгрупи: 1 - експериментальна: ЗО тварин пасивно імунізували IgG мишей імунізованих стафілококовим антигеном; 2 - контрольна: ЗО тваринам вводили IgG інтактних мишей. Імунізація проводилась за схемою, що наведена в таблиці 1. Таблиця 1 Схема імунізації тварин експериментальної групи Доба експеДоза і шлях введення IgG рименту 0 50мкг інтраперитонеально 1 спарювання 5 20мкг внутрівенне (хвостова вена) 10 20мкг внутрівенне (хвостова вена) 14 20мкг внутрівенне (хвостова вена) На наступну добу після інтраперитонеальної імунізації тварини спарювались з самцями 1:1 на протязі 2-х діб. Вагітність виявляли шляхом підрахування вагінальних пробок, після чого робилось відсаджування самок в окремі клітки. На 15-у добу вагітності тварин усипляли летальною дозою хлороформу. В отриманій шляхом пункції серця крови підраховували кількість тромбоцитів і визначали наявність вовчкового антикоагулянту за допомогою набору реактивів «Люпус-тест» («Технологіястандарт», м.Барнаул, Росія). У досліджуваних тварин видаляли матки, підраховували кількість і маси плодів і послідів, обчислювали індекс резорбції плодів за формулою: Ro/o = R/(R + A), де R плоди, що підверглися резорбції, А - живі плоди. Плоди та їх посліди вибірково підвергалися гістологічному дослідженню. 6131 У імунізованих тварин в порівнянні з контрольною групою значно знижувалась ПЛІДНІСТЬ, підвищувалась КІЛЬКІСТЬ плодів, що підверглись резорбції, значно знижувалась вага плодів та ПОСЛІДІВ У 97% тварин імунізованої групи був виявлений вовчковий антикоагулянт та була виражена тромбоцитопенія За результатами ГІСТОЛОГІЧНОГО дослідження ПОСЛІДІВ у основній експериментальній групі виявлялося значно більше тромбозів, інфарктів плаценти та інших ознак плацентарної недостатності в порівнянні з контрольною групою Тож заходи заявника, що запропоновані у корисній моделі значно перевершують досягнення об'єктів-аналопв завдяки використанню антигенів з доказаною на молекулярному і експериментальному рівні здатністю індукувати виробітку антифосфоліпідних антитіл Крім того, використання запропонованої двохетапної схеми імунізації дозволяє уникнути безпосередньої дії антигенів золотистого стафілококу на фетоплацентарний комплекс з послідуючою помилковою інтерпретацією результатів Використання запропонованого способу індукції АФС під час вагітності в експериментальній патофізіології, імунологи та фармакологи дозволить вивчати перебіг вагітності в умовах антифосфоліпідного синдрому та оцінювати ефекти різних лікарських речовин та їх комбінацій на перебіг АФС та таких його акушерських ускладнень як хронічна плацентарна недостатність, що виникли в результаті патогенної дії антифосфоліпідних антитіл Отже, заявлена корисна модель відповідає умові «промислова придатність» Джерела інформації 1 Aron A L , Cuellar М L , Brey R L Early onset of autoimmunity in MRL/++ mice following immunization with beta2 glycoprotein // Clin Exp Immunol 1995 -№101 -P 78-81 Комп'ютерна верстка М Мацело 2 Bakimer R , Blank M , Koshashvilli D Antiphosphohpid syndrome and the idiotypic network // Lupus - 1995 - №4 - P 204-208 3 Blank M , Choen J , Toder V Induction of antiphosphohpid syndrome in naive mice with mouse lupus monoclonal and human polyclonal anticardiohpin antibodies // Proc Nati Acad Sci USA 1991 -№88 -P 3069-3073 4 Blank M , Krause I , Fndkm M Bacterial induction of autoantibodies to beta2-glycoprotein-l accounts for the infectious etiology of antiphosphohpid syndrome // Journal of Clinical Investigation - 2002 - Vol 109, №6 - P 797-804 5 Blank M , Krause I, Lanir N Transfer of experimental antiphosphohpid syndrome by bone marrow cell transplantation // Arthritis Rheum - 1995 -№38 -P 115-122 6 Gharavi A E , Mellors R С , Elkon К В IgG anti-cardiohpin antibodies in murme lupus // Clin Exp Immunol -1989 -№78 - P 233-238 7 Gharavi A E, Sammantano L R-, Wen J Induction of antiphosphohpid autoantibodies by immunization with beta-2glycoprotein I (apohpoprotein H) // J Clin Invest - 1992 - №90 - P 1105-1109 8 Katano К , Aoki К , Ogasawara M Specific antiphosphohpid antibodies (aPL) eluted from placentae of pregnant women with aPL-positive sera // Lupus 1995 -№4 -P 304-308 9 McNeil H P , Simpson R J , Chesterman С N Antiphosphohpid antibodies are directed against a complex antigen that includes a lipid binding inhibitor of coagulation beta2-glycoprotem I (apohpoprotein H) // Proc Nati Acad Sci USA - 1990 - №87 - P 41204124 10 Zhang L, Jacobsson K, Vasi J A second IgG-binding protein in Staphylo-coccus aureus // Microbiology - 1998 - №144 - P 985-991 Підписне Тираж 28 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул Урицького, 45, м Київ, МСП, 03680, Україна ДП 'Український інститут промислової власності", вул Глазунова, 1, м Київ - 4 2 , 01601