Спосіб одержання комплексної сполуки платини (іі) з н-днк

Спосіб одержання комплексної сполуки платини (II) з н-ДНК, який включає змішування високомолекулярної н-ДНК, що виділена з селезінки тварин, з цитратно-сольовим розчином, витримування суміші н-ДНК та цитратно-сольового розчи ну протягом 20-26 годин, повільне нагрівання суміші розчину та ДНК до 88,0-90,0°С, розчинення цис-дихлородіамінплатини ДДП у попередньо нагрітому до температури 88,0-90,0°С цитратносольовому розчині, змішування попередньо підготованих розчинів шляхом поступового додавання розчину ДДП до розчину н-ДНК у таких кількостях, що відповідає мольному співвідношенню ДДП, нДНК, натрію хлориду та натрію цитрату 6 4 ЗО 3, та термостатування при тій самій температурі протягом 15-20 хвилин, який відрізняється тим, що використовують н-ДНК, що виділена з селезінки поросяти Винахід відноситься до комплексних сполук платини, що мають біологічну активність, яка виражена їх протипухлинною властивістю, та може бути застосований для одержання лікарського протипухлинного засобу Відомий спосіб одержання комплексної сполуки платини (П) з нативною ДНК (н-ДНК), що має протипухлинну активність, який включає змішування високомолекулярної н-ДНК, що характеризується молекулярною масою 7-17мДальтон (марки А) та яка виділена з селезінки великої рогатої худоби, з водним розчином суміші хлориду та цитрату натрію (цитратно-сольовим), повільне нагрівання (1°С за хвилину) до 78±0,5°С , розчинення дис-дихлородиаммшплатини (ДДП) у попередньо нагрітому до температури 78±0,5°С цитратносольовому розчині, змішування попередньо підготованих розчинів у таких кількостях, що мольне співвідношення ДДП, н-ДНК, натрію хлориду та натрію цитрату відповідає співвідношенню 6 4 ЗО 3, з наступним їх термостатуванням при Е266 2-10000±100 л моль 1см 1 Одержану речовину виділяють у вигляді твердої субстанції, або застосовують без виділення в цитратно-сольовому розчині [пат СРСР №1813089, C07F15/00, А61К 31/295] Застосовані у відомому способі параметри проведення процесу не забезпечують повного розгортання волокон н-ДНК, необхідного ступеню роз'єднання нитей дволанцюгових спіралей макромолекул н-ДНК на їх тугоплавких ділянках та необхідної ПОСЛІДОВНОСТІ взаємодії мономерних одиниць н-ДНК з молекулами ДДП, що призводить до одержання сполуки з просторовою структурою, яка характеризується температурою плавлення температурі 78 ±0,5°С протягом 15-20 хвилин Закінчення взаємодії реагентів фіксують по досягненню параметрів УФ-спектра поглинання охолодженої суміші ) = 266,2+0,1 нм та 78±0,5°С, максимальним гіперхромним ефектом (МГЕ) АЕ 25 80 =Ю±1,0% при температурі 83,0+ 0,5° С , та обумовлює зниження протипухлинної и дії і підвищення токсичності сполуки Відомий спосіб одержання комплексної сполуки платини (П) з н-ДНК, який включає змішування н-ДНК з молекулярною масою 7-17 мДальтон (марки А) та молекулярною масою 4-7 мДальтон (марки Б), що виділена з селезінки великої рогатої худоби, з цитратно-сольовим розчином, витримування суміші н-ДНК та цитратно-сольового розчину протягом 20-26 годин, повільне нагрівання су СО Ю (О 61543 температурі протягом 15-20 хвилин, в якому, ВІДМІШІ розчину та ДНК до 8 8 - 9 0 ° С , розчинення ПОВІДНО до винаходу, використовують н-ДНК, що ДДП у попередньо нагрітому до температури виділена з селезінки поросяти 88-90°С цитратно-сольовому розчині, змішуванНативну ДНК з селезінки поросяти одержуваня попередньо підготованих розчинів шляхом поли таким же самим способом, як і н-ДНК з селезінступового додавання розчину ДДП до розчину нки телят та характеризували тими самим параметДНК у таких кількостях, що мольне співвідношення рами, якими характеризували ДНК телят (таблиця ДДП, н-ДНК, натрію хлориду та натрію цитрату 1) відповідає співвідношенню 6 4 ЗО 3, та термостатування при тій самій температурі протягом 15-20 Таблиця 1 хвилин Одержання комплексної сполуки платини (П) з ХІМІЧНІ та фізико-хімічні пан-ДНК н-ДНК н-ДНК таким способом забезпечує розгортання раметри теляти поросяти волокон н-ДНК в цитратно-сольовому розчині, ноВміст основної речовини, % 83,2 82,8 вий температурний режим - роз'єднання нитей Вміст ВОДИ, % 15,7 16,8 дволанцюгових спіралей макромолекул н-ДНК на Вміст фосфору, в розрахуїх тугооплавких ділянках, а ПОСЛІДОВНІСТЬ змішунку на суху речовину 8,1 8,0 вання розчинів вихідних компонентів забезпечує Молекулярна маса, необхідну ПОСЛІДОВНІСТЬ взаємодії мономерних мДальтон, одиниць н-ДНК з молекулами ДДП, що в результамарка А >7 >7 ті дозволяє одержати комплексну сполуку з іншою марка В >4 >4 просторовою структурою, яка характеризується Максимум УФ-спектра потемпературою плавлення 85,5 ±0,5° С, (МГЕ) глинання, A,m3V , нм 258 258 АЕ Шал 258,0 =17,5 + 1,2% при температурі 92,0±0,5°С (Заявка на пат України №20030110214 від Дослідження сполук платини(П) з н-ДНК, що виділена з селезінки поросяти проводили ХІМІЧНИ08 01 2003) МИ, фізико-хімічними та біологічними методами у Обидва способи одержання протипухлинних порівнянні зі сполукою платини з н-ДНК, що видіпрепаратів мають суттєвий недолік, а саме - виколена з селезінки теляти ристання в якості одного з компонентів речовини, що виділена з органів великої рогатої худоби На Дослідження показали, що сполуки платини з сьогодні почастішали випадки зараження та зан-ДНК, які виділені з селезінки теляти та поросяти хворювання великої рогатої худоби прюновими з молекулярною масою 4-17 мДальтон не відрізхворобами та виникла проблема можливості пеняються за ХІМІЧНИМИ, фізико-хімічними та біологіредачі їх людині через компоненти лікарських пречними властивостями, що дозволяє використовупаратів Тому ВООЗ та КОМІСІЯ ЄС видали рекомевати для приготування комплексної сполуки пландації щодо уникнення використання матеріалів тини, як н-ДНК марок А і Б теляти, так і н-ДНК мавиділених з органів великої рогатої худоби для рок А і Б поросяти створення лікарських препаратів Для виділення комплексної сполуки з розчину В основу винаходу поставлена задача розробйого піддають ліофільному висушуванню Одерки способу одержання комплексної сполуки платижана суміш сполук являє собою дрібнокристалічни (П) з н-ДНК, який шляхом застосування н-ДНК, ний порошок жовтого кольору та відповідає форщо виділена з органів тварин, що не хворіють на мулі {[PtCI(NH3)(H2O)]6}n- ц -ДНК+ ЗОп NaCI +прюнові хвороби, які можуть передаватися людині, Зп ІЧазСуі: 5.5Н2О, що відповідає розрахованому дозволяє одержати сполуку платини (II) з н-ДНК, кількісному вмісту елементів, % Pt 20,23, СІ 22,10, що має лікарські властивості подібні властивостям С 11,83, N5,08, Р 2,14, Н2.19, Na 15,51 та співпасполуки платини з н-ДНК, що виділена з органів дає з показниками аналізу речовини одержаної великої рогатої худоби, але не може бути причиспособом за прототипом До порошку додають ною передачі хвороби великої рогатої худоби людистильовану воду та ретельно перемішують для дині видалення водорозчинних хлориду та цитрату Задача вирішується способом одержання комнатрію Одержану завись центрифугують, осад плексної сполуки платини (П) з н-ДНК, який вклюВІДДІЛЯЮТЬ від розчину, промивають послідовно чає змішування високомолекулярної н-ДНК, що водою, етиловим спиртом, ефіром для наркозу та виділена з селезінки тварин, з цитратно-сольовим висушують Виділена індивідуальна сполука являє розчином, витримування суміші н-ДНК та цитратсобою дрібнокристалічний порошок коричневого но-сольового розчину протягом 20-26 годин, повікольору та відповідає сполуці полі{гексакис [хлольне нагрівання суміші розчину та ДНК до роаммшакваплатина(П)]}дезоксирібонуклеат формули {[PtCI(NH3)(H2O)]6}-)i-flHK, що відповідає 8 8 - 9 0 ° С , розчинення ДДП у попередньо нагрірозрахованому кількісному вмісту елементів, % тому до температури 88 - 90°С цитратноPt 39,58, СІ 7,21, С 15,83, N9,95, Р4.19, Н 2,67 та сольовому розчині, змішування попередньо підгоспівпадає з елементним аналізом індивідуальної тованих розчинів шляхом поступового додавання сполуки, що одержана способом за прототипом розчину ДДП до розчину н-ДНК у таких кількостях, Приклад 1 0,500 г високомолекулярної н-ДНК що мольне співвідношення ДДП, н-ДНК, натрію марки А (молекулярної маси 14,00 мДальтон), яка хлориду та натрію цитрату відповідає співвідновиділена з селезінки поросяти, змішували при кімшенню 6 4 ЗО 3, та термостатування при тій самій 61543 натній температурі 22°С з 0,375 л водного розчину, що включав 15 ммоль/л NaCI + 1,5 ммоль/л NasCyt та витримували суміш при такій температурі до повного розгортання волокон н-ДНК протягом 22 годин Після ЦЬОГО суміш поступово нагрівали зі швидкістю 1°С за хвилину в термостаті до 88±0,5°С 0,675 г ДДП розчиняли в попередньо нагрітому до 88 ±0,5° С цитратно-сольовому розчині такої самої концентрації До розчину н-ДНК поступово додавали розчин ДДП та термостатували суміш протягом Встановлювали 15 хвилин температуру при 88 ± 0,5°С плавлення сполуки за прикладом та МГЕ при температурі 92,5°С Одержану суміш люфілізували та аналізували одержану кристалічну речовину Приклад 2 0,500 г високомолекулярної н-ДНК марки Б (молекулярної маси 4,2 мДальтон), яка виділена з селезінки поросяти, змішували при кімнатній температурі 25°С з 0,375 л водного розчину, що включав 15 ммоль/л NaCI + 1,5 ммоль/л NasCyt турі до гом 20 вали зі та витримували суміш при такій темпераповного розгортання волокон н-ДНК протягодин Після ЦЬОГО суміш поступово нагрішвидкістю 1°С за хвилину в термостаті до 88±0,5°С 0,675г ДДП розчиняли в попередньо нагрітому до 8 8 ± 0 , 5 ° С цитратно-сольовому розчині такої самої концентрації До розчину н-ДНК поступово додавали розчин ДДП та термостатували суміш протягом 20 хвилин при 8 8 ± 0 , 5 ° С Одержану суміш люфілізували, до порошку додавали дистильовану воду, ретельно перемішували та центрифугували Одержаний осад промивали послідовно водою, етиловим спиртом, ефіром для наркозу та висушували Одержану кристалічну сполуку аналізували, встановлювали температуру плавлення сполуки та МГЕ при температурі 92,5° С Приклади синтезів комплексної сполуки платини (II), де вказані умови синтезу та результати аналізу синтезованої комплексної сполуки надані в таблиці 2 Таблиця 2 Характеристика умов синтезу Час виТермотриму- Молекулярна Темпера- статуТпл> Приклад вання маса н-днк, тура син- вання, °С ±0,5 суміші, мДальтон тезу, с хвилигодини ни 1 22 14,0 88,0±0,5 15 85,5 2 24 4,2 88,0±0,5 20 85,5 3 25 8,0 90,0±0,5 15 85,5 4 26 10,7 90,0±0,5 15 85,5 ВІДПОВІДНІСТЬ синтезованої сполуки, наведеної в ХІМІЧНІЙ формулі, підтверджує УФ-спектр поглинання розчину з Я, т а х = 266,2 ±0,1 нм, а також елементний аналіз одержаної сполуки, наведений в таблиці 2, у суміші з солями (приклад 1) та в індивідуальному стані (приклади 2-4) Просторова структура одержаної сполуки немає ВІДМІННОСТІ від просторової структури сполуки за прототипом, що підтверджується співпадаючими характеристикою максимального гіперхромного ефекту, температурою його досягнення та температурою плавлення одержаної сполуки Токсичність сполук, одержаних в прикладах, досліджували на групах тварин, створених з статевозрілих нелінійних мишей вагою 26,0 ± 2 г, які витримали карантин на протязі 14 днів (в кожній групі по 10 тварин) Розчин сполуки вводили внутрішньоочеревинно тричі на день по 0,5 мл з інтервалом дві години Для ІН'ЄКЦІЙ використовували водний розчин сполуки, в якому вона утворилася (15 ммол/л NaCI + 1,5 ммоль/л NasCyt) або суспензію з ( виділеною індивідуальною сполукою в цитратно-сольовому розчині Сумарні дози препаратів складали 40,0, 70,0, 90,0, 120,0 та 160,0 мг/кг Токсичність характеризували дозами, які викликають загибель 50% інтактних тварин та 100% інтактних тварин, а також за Характеристика одержаної сполуки КІЛЬКІСНИЙ ВМІСТ, % МГЕ при 92,5° С _ % 18,6 18,2 17,9 18,3 Pt СІ 20,38 39,68 39,53 39,78 22,20 7,31 7,40 7,29 С N 11,63 5,12 15,73 10,05 15,81 9,90 15,65 9,98 Р Н Na 2,06 4,33 4,21 4,40 2,30 2,80 2,75 2,57 15,6 виживанням тварин на ЗО добу після введення препаратів, яке виражене у відсотках КІЛЬКІСТЬ загиблих інтактних тварин в кожній групі відмічали кожні 24-48 годин Розрахунок токсичної дози ЛД50 проводили за методикою Літчфілда-Уїлкоксона, летальну дозу - ЛДюо - визначали експериментально Протипухлинну активність препаратів оцінювали на основі експериментів, що були проведені на сімох групах тварин (в кожній групі по 10 тварин) Білим безпородним пацюкам вагою 150-200 г під шкіру стегна трансплантували 2 10 6 клітин перевивного штаму карциноми Герена Тваринам 1 групи (контроль) вводили цитратно-сольовий розчин, 2-ої групи - розчин сполуки одержаної за прототипом, 3-6 - ін'єкції ВОДНИХ розчинів сполук, одержаних ВІДПОВІДНО до прикладів 1-4, в яких вона утворилася за заявкою (15 ммол/л NaCI + 1,5 ммоль/л NasCyt), а сьомій групі - суспензію індивідуальної сполуки за прикладом 2 Препарати вводили внутрішноочеревинно, через три доби після трансплантації пухлин, тричі, рівними дозами з інтервалом 1-3 дні Протипухлинну активність оцінювали за гальмуванням росту пухлини (%) та тривалістю життя (доби) Результати проведених досліджень зведені в таблиці З 61543 Таблиця З Групи тварин 1 2 3 4 5 6 7 Ін'єкція сполуки Цитратносольовий розчин NaCI, Na3Cyt Розчин сполуки за прототипом Розчин сполуки за прикладом 1 Розчин сполуки за прикладом 2 Розчин сполуки за прикладом 3 Розчин сполуки за прикладом 4 Суспензія сполуки за прикладом 2 Доза сполуки, Токсична доза Летальна доза мг/кг LD50, мг/кг LDioo, мг/кг Виживання Ступінь гальтварин на ЗО мування росту добу, % пухлини, % ПродовжеНІСТЬ ЖИТТЯ, Діб 26,3 16,1 0 0 18±6 45 132 160 100 95 36±4 45 128 160 100 95 36±4 45 128 160 100 93 35±3 45 130 160 100 93 36±5 45 128 160 100 96 36±4 45 130 160 100 95 36±3 Аналіз даних дозволяє зробити висновок, що використання н-ДНК, що виділена з селезінки поросяти, в способі одержання комплексної сполуки платини (II) з н-ДНК не знижує його протипухлин Комп'ютерна верстка Л Ціхановська ної активності та не підсилює його токсичності, а відсутність у поросят прюнових захворювань дозволяє уникнути ризику передачі цих захворювань людині разом з ліками Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119