Фракції кополімеру-1, cпособи їх одержання, композиції та спосіб для лікування розсіяного склерозу

Эта заявка - частичное продолжение заявки США №08/344 248 от 23.11.94, поданной в продолжение заявки США №08/248 037 от 24.05.94. Сополимер-1 - это синтетический полипептидный аналог основного белка миелина (ОБМ) - природного компонента миелиновой оболочки. Его предлагали применять в качестве потенциального терапевтического средства против рассеянного склероза (Eur. J.Immunol. [1971] 1:242; и J.Neurol. Sci. [1977] 31:433). Все приведенные здесь ссылки полностью включены в эту заявку. Интерес к сополимеру-1 как иммунотерапевтическому средству от рассеянного склероза возник в 1950-х годах, когда обнаружили, что такие компоненты миелина, как ОБМ, предотвращают или задерживают экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАИ), ЭАИ - болезнь, сходная с рассеянным склерозом, который может быть вызван у подверженных этому заболеванию животных. Сополимер-1 был исследован в институте Вейсмана (Реховот, Израиль) докторами Села, Арноном с сотрудниками, которые выявили, что он подавляет ЭАИ (Eur. J.Immunol. [1971] 1:242; патент США 3849550). В последнее время стало известно, что сополимер-1 оказывает благоприятное действие на пациентов с обостряющейся и ослабевающей формой рассеянного склероза (N. Engl. J.Med. [1987] 317:408). У пациентов, которым ежедневно вводили сополимер-1, отмечено меньше случаев обострения и небольшое развитие нетрудоспособности в сравнении с контрольными пациентами. Сополимер-1 - это смесь полипептидов, состоящих из аланина, глутаминовой кислоты, лизина и тирозина в молярном соотношении соответственно около 6:2:5:2. Его синтезируют, полимеризуя эти четыре аминокислоты с образованием продуктов со средней молекулярной массой 23000Да (Патент США 3849550). Цель изобретения - получение усовершенствованной композиции сополимера-1. Изобретение относится к составу сополимера-1, по существу свободному от сополимера-1 с молекулярной массой более 40кДа. Кроме того, изобретение относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой примерно от 2кДа до примерно 20кДа превышает 75%. Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6кДа). Изобретение также относится к фармацевтической композиции и к способу лечения рассеянного склероза с применением описанного сополимера-1. На фиг.1 показаны распределение молекулярной массы трех доз сополимера-1 и пропорция видов с молекулярной массой выше 40кДа. На фиг.2 показаны те же данные, относящиеся к молярной доле. Настоящее изобретение относится к составу сополимера-1, по существу свободному от видов сополимера-1 с молекулярной массой более 40кДа. Этот состав предпочтительно содержит менее 5%, а более предпочтительно менее 2,5% видов сополимера-1 с молекулярной массой 40кДа или более. Изобретение также относится к сополимеру-1, в котором молярная доля с молекулярной массой примерно от 2кДа до примерно 20кДа превышает 75%. Дополнительно, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6кДа. В частности, изобретение относится к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 4 до примерно 8,6кДа и к сополимеру-1 со средней молекулярной массой примерно от 6,25 до примерно 8,4кДа. Сополимер-1 согласно изобретению может быть получен известными способами, например, способом по патенту США №3849550, согласно которому N-карбоксиангидриды тирозина, аланина, gбензилглутамата и Ε-Ν-трифторацетиллизина полимеризуют при температуре окружающей среды в безводном диоксане с диэтиламином как инициатором. Далее g-карбоксильную группу глутаминовой кислоты деблокируют бромистым водородом в ледяной уксусной кислоте с последующим удалением трифторацетильных групп из остатков лизина 1М пиперидином. В заявке термины "температура окружающей среды" и "комнатная температура" следует понимать как температуру примерно от 20 до примерно 26°С. Сополимер-1 с требуемым профилем молекулярной массы может быть получен по существу любым известным способом. Такие способы включают хроматографию сополимера-1, содержащего высокомолекулярные виды, и сбор фракций без нежелательных видов или частичный кислотный или ферментативный гидролиз для удаления высокомолекулярных видов с последующей очисткой диализом или ультрафильтрацией. Другой способ получения сополимера-1 с желаемым профилем молекулярной массы заключается в получении желаемого вида с защищенными аминокислотами и последующем получении необходимого вида непосредственно после снятия защиты. Рецептуры композиций согласно изобретению можно составить общеизвестными способами. Предпочтительно состав лиофилизируют или превращают в водный раствор, пригодный для подкожных инъекций. Сополимеру-1 можно также придать любую из известных форм, удобную для приготовления пептидных лекарств для перорального, носового, защечного или ректального введения. Обычно пациентам, страдающим рассеянным склерозом, сополимер-1 вводят ежедневно в дозах 20мг. Изобретение описано в примерах, не ограничивающих его объем. Пример 1 Хроматографический способ получения низкотоксичного сополимера-1 Две дозы сополимера-1 получили известным способом, например по патенту США №3849550. Затем одну дозу подвергли хроматографическому разделению, как описано ниже. Колонку для гельфильтрации FRACTOGEL TSK HWSS (600х26мм) собрали в патроне Superformance 26 Merck согласно инструкции изготовителя. Колонку эквилибрировали водой и впрыснули раствор ацетона для определения общего объема. Колонку эквилибрировали 0,2Μ буфером ацетата аммония с рН 5,0, загрузили в нее 30мл проб сополимера-1 (20мг/мл в 0,2Μ буфере ацетата аммония с рН 5,0) и каждые 10мин. отбирали фракции. Фракцию со средней молекулярной массой 7-8кДа, выделяли между 120-130 минутами (Доза А). Анализ молекулярной массы Поглощение ультрафиолетового света (ПУС) при 275нм определяли спектрофотометром UVIKON 810. Пробы разбавляли для достижения уровня ПУС ниже 1 единицы поглощения. Молекулярное распределение двух доз определяли на калиброванной гельфильтрационной колонке (Superose 12). Было обнаружено, что доза А сополимера-1 имела среднюю молекулярную массу 7-8кДа. В этой дозе из всех видов сополимера-1 2,5% имели молекулярную массу вы ше 42кДа, а 5% - более 40кДа. Средняя молекулярная масса другой, не подвергнутой хроматографическому разделению, дозы сополимера-1 составила 12кДа. В этой дозе из всех видов сополимера-1 2,5% также имели молекулярную массу выше 42кДа, а 5% - более 40кДа. Пример 2 Анализ на токсичность A: In Vi vo Три дозы сополимера-1 со средней молекулярной массой 7,3кДа, 8,4кДа (менее 2,5% сополимера-1 имеет молекулярную массу более 40кДа) и ,22кДа (более 5% сополимера-1 имеет молекулярную массу более 40кДа) испытали на токсичность, как описано ниже. В каждом случае в каждой экспериментальной группе использовали по 5 мышей. Методика Сополимер-1 растворили в дистиллированной воде для получения раствора с концентрацией активного ингредиента 2мг/мл. Каждой мыши ввели 0,5мл испытуемого раствора в вену хвоста. Для определения смертности и соответствующи х клинических признаков мышей наблюдали более 48 часов. Результаты наблюдений записывали через 10 мин, 24 часа и 48 часов после инъекции. Если к исходу 48 часов все животные были живы и никакие неблагоприятные признаки не были обнаружены, то такая доза считалась "нетоксичной". Если же одна или более мышей погибли или проявляли неблагоприятные признаки, то такая доза считалась "токсичной". Дозы со средней молекулярной массой 7,3 и 8,4кДа были отнесены к "нетоксичным", а в опытах с дозой со средней молекулярной массой 22кДа 3 из 5 мышей погибли к исходу 48 часов и поэтому ее признали "токсичной". В: In Vitro Тест на БЛК-дегрануляцию I. Введение. Выделенный из базофильных клеток гистамин (или серотонин) служит in vitro моделью аллергической реакции немедленного типа. Была получена линия базофильных лейкозных клеток крыс (БЛК-2Н3), которая представляла собой воспроизводимую однородную легко сохраняемую систему с высокой чувствительностью (E.L. Basumian, C. lsersky, M.G. Petrino and R.P. Siraganian. Eur. J. Immunol. 11, 317, 1981). Физиологический стимул для выделения гистамина предполагает связывание антигена с мембранно-связанными молекулами IgE, в результате чего происходит сшивка молекул и - последующий запуск сложного биохимического каскада. Кроме этих физиологических иммуноглобулин-опосредованных механизмов запуска, дегрануляция может быть вызвана различными He-lgE-опосредованными стимулами. Среди них - различные пептиды и синтетические полимеры, например, полилизин (R.P. Siraganian. Trends in Pharmacological Sciences, October 432, 1983). Поэтому испытание на БЛК-дегрануляцию используют для отбора тех доз сополимера1, которые вызывают существенную дегрануляцию и таким образом могут выявить нежелательные локальные и/или системные побочные эффекты. ll. Основы методики испытаний. К базофильным лейкозным клеткам крыс (БЛК-2Н3) добавляли [3Н]серотонин и смесь инкубировали со 100мкг сополимера-1. Дозы сополимера-1, вызывающие неспецифическую дегрануляцию, высвобождали [3Н]-серотонин в среду. Ее радиоактивность определяли сцинтилляционным счетчиком, а общее количество проникшего в клетки серотонина определяли в центрифугированных клетках. Степень деградации вычисляли в процентах выделенного из клеток серотонина от его общего количества. lll. Результаты. Четыре дозы сополимера-1 со средней молекулярной массой в интервале 6250-14500 исследовали для определения в процентах доли видов с молекулярной массой более 40кДа и на БЛКдегрануляцию. Результаты обобщены в следующей таблице. Таблица Средняя молекулярная масса, Да 6250 7300 13000 14500 Доля видов с молекулярной массой более 40кДа, %