Спосіб тест-визначення суми фенольних сполук в рослинній сировині

Спосіб тест-визначення суми фенольних сполук в рослинній сировині, що включає відбір проби, розчинення її в органічному розчиннику з відо 3 10 мл 20 % розчину натрію карбонату, ретельно збовтують протягом 3-5 хв до припинення виділення пухирців газу, доводять об'єм розчину водою до мітки й перемішують. Колбу закривають і витримують на водяній бані при температурі 80 °C протягом 30 хв. Потім колбу з вмістом охолоджують до кімнатної температури й вимірюють оптичну густину отриманого розчину на спектрофотометрі в максимумі поглинання при довжині хвилі 765 нм у кюветі з товщиною шару 10 мм. Як розчин порівняння використовують розчин, що містить 20 мл реактиву Фоліна-Деніса й 10 мл 20 % розчину натрію карбонату, доведеного водою до мітки в мірній колбі місткістю 50 мл. Паралельно вимірюють оптичну густину розчину стандартного зразка галової кислоти, приготовленого аналогічно випробуваному розчину. Вміст суми фенольних сполук у відсотках обчислюють у перерахуванні на галову кислоту. Це рішення вибране прототипом. Прототип і корисна модель, що заявляється, мають такі спільні операції: - відбір проби; - розчинення проби в органічному розчиннику з відокремлюванням фенольних сполук; - взаємодія фенольних сполук з хімічним реагентом; - реєстрація аналітичного сигналу. Однак, спосіб за прототипом має суттєві недоліки. 1. Реакція протікає у вузькому інтервалі значень рН від 7,0 до 8,0. При рН  7,0 оптична густина не досягає максимального значення, внаслідок неповноти протікання реакції. При рН  8,0 у реакційній суміші випадає осад. 2. Реактив Фоліна-Деніса готується шляхом кип'ятіння вихідних реагентів протягом 4-5 годин і зберігається у темному місті не більше 5 діб. 3. Для проведення реакції необхідне нагрівання реакційної суміші у термостаті при температурі 80 °C протягом 30 хвилин. 4. Визначенню можуть заважати й інші компоненти суміші, які вступають у реакцію з реактивом ФД й мають окислювально-відновні властивості, такі як антоціани, антиоксидантні ферменти й інші. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб, в якому за рахунок застосування реакції взаємодії фенольних сполук з іонами тербію (ІІІ), використання твердофазної люмінесценції тербію на поверхні сорбенту Sephadex G-75, забезпечити спрощення аналізу, скорочення часу проведення аналізу й зниження межі визначення фенольних сполук. Поставлена задача вирішена в способі тествизначення суми фенольних сполук в рослинній сировині, що включає відбір проби, розчинення її в органічному розчиннику з відокремлюванням фенольних сполук, взаємодію фенольних сполук з хімічними реагентами і реєстрацію аналітичного сигналу, згідно з корисною моделлю, фенольні сполуки відокремлюють сорбцією на сорбенті Sephadex G-75 і піддають взаємодії з іонами тербію (III), модифікованими на поверхні сорбенту, в присутності триоктилфосфіноксиду (ТОФО) та ацетатного буферного розчину при рН=4,2-4,4 і 63016 4 вимірюють аналітичний сигнал сенсибілізованої люмінесценції іонів Тb(ІІІ). Новим в корисній моделі, що заявляється, є використання реакції взаємодії фенольних сполук з iонами Тb(ІІІ), яка проходить у фазі сорбенту Sephadex G-75, з метою відділення фенольних сполук із розчину і підсилення сенсибілізованої твердофазної люмінесценції іона Тb(ІІІ) у присутності донорно-активної речовини - триоктилфосфіноксиду та ацетатного буферного розчину при рН=4,2-4,4. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, і досягненням технічного результату полягає в наступному. Підвищення селективності визначення, спрощення виконання аналізу, зниження часу проведення аналізу, зниження межі виявлення стало можливим завдяки наступним прийомам: 1. Застосування реакції взаємодії фенольних сполук з іонами тербію (III). Застосування такого прийому дозволяє підвищити селективність визначення фенольних сполук через те, що реакція є для даного класу сполук вибірною у групі інших антиоксидантів (токофероли, антоціани, антиоксидантні ферменти), які не виявляють реакції з іонами тербію (ІІІ). 2. Застосування сорбції фенольних сполук на сорбенті Sephadex G-75. Застосування такого прийому дозволяє поєднувати стадію попереднього відокремлення фенолів з отриманням сорбатів комплексів, які мають люмінесцентні ознаки у твердій фазі сорбенту, що дозволяє проводити тест-визначення фенольних сполук, що спрощує апаратурне оформлення. 3. Застосування тест-визначення фенольних сполук у фазі сорбенту. Застосування такого прийому дозволяє виключити приготування розчинів для побудови градуювального графіку для кожного визначення, що скорочує час проведення аналізу. 4. Застосування сорбції фенольних сполук на сорбенті сприяє збільшенню інтенсивності люмінесценції сорбатів комплексів внаслідок зменшення без випромінюваних втрат енергії збудження, що веде до зниження межі визначення фенольних сполук. Сенсибілізована люмінесценція іонів Тb(ІІІ) на сорбенті посилюється у присутності донорноактивної речовини - триоктилфосфіноксиду, який сприяє дегідратації утвореного комплексу і тим самим зменшенням безвипромінюваних втрат енергії збудження. Вплив різних чинників на інтенсивність люмінесценції комплексів фенольних сполук з іонами тербію (III) наведено на кресленнях, де: фіг.1 - залежність інтенсивності люмінесценції комплексів фенольних сполук з тербієм (III) від типу сорбенту; фіг.2 - залежність інтенсивності люмінесценції комплексів фенольних сполук з тербієм (III) від температури висушування сорбенту; фіг.3 - залежність інтенсивності люмінесценції комплексів фенольних сполук з тербієм (III) від часу висушування сорбенту. 5 63016 Експериментально були вибрані сорбенти, на яких І люм. фенольних сполук найбільша. Досліджена сорбція комплексів на різних сорбентах (фіг.1): на силікагелях 100/160 (1), 100/400 (2), фосфаті алюмінію (3) й на Sephadex G-50 (4), G75(5), G-150 (6), а також на пінополіуретані, цеолітах (СаА, NaA). Як видно з фіг.1 максимальна інтенсивність люмінесценції комплексів спостерігається на Sephadex G-75, іммобілізованому іонами тербію (III). Для подальшого аналізу був вибраний сорбент Sephadex G-75. Час сорбції фенольних сполук становить 10-15 хвилин. Інтенсивність люмінесценції комплексів залежить від рН розчину, з якого проводиться сорбція. Ця величина становить рН=4,2-4,4. Для створення оптимального значення рН розчину використовували ацетатний буферний розчин з рН=4,3 Інтенсивність люмінесценції сорбату залежить від температури (фіг.2) і часу висушування сорбенту (фіг.3). Як видно з рисунка максимальна інтенсивність люмінесценції спостерігається при висушуванні сорбату при 80 °C протягом 60 хвилин. Вивчення залежності інтенсивності люмінесценції сорбату комплексу від кількості іонів тербію (III) на Sephadex G-75 показало, що інтенсивність люмінесценції збільшується зі збільшенням концентрації іонів тербію (III). Вибрана концентрація -2 тербію (III) - 110 моль/л. І люм. сорбату комплексів фенольних сполук з тербієм (III) значно збільшується в присутності ТОФО. Експериментально визначено, що максимальна інтенсивність люмінесценції комплексу спостерігається при концентра-3 ції ТОФО 110 моль/л. Як поліфенольний стандарт використовували розчин галової кислоти. Лінійна область залежності Інтенсивності люмінесценції комплексу від концентрації галової кислоти спостерігається у діапазоні концентрацій галової кислоти 0,045-1,7 мкг/мл. Приклад 1. Визначення суми фенольних сполук у квітках ромашки аптечної. Наважку 1 г сухого подрібненого листя ромашки аптечної переносять у колбу, додають 50 мл 70 % етанолу й перемішують на магнітній мішалці протягом 60 хвилин при 70 °C. Колбу з вмістом охолоджують до кімнатної температури. Отриманий екстракт відфільтровують на фільтрі "синя стрічка" у мірну колбу. Доводять об'єм екстракту до 50 мл 70 % етанолом. Приготування стандартного розчину галової кислоти: 0,05 г (точна наважка) стандартного зразка галової кислоти, висушеної при температурі 6 115 °C до постійної маси, розчиняють у мірній колбі місткістю 250 мл у невеликій кількості спирту етилового 70 %, доводять об'єм розчину спиртом етиловим 70 % до мітки й перемішують. Наважку 100 мг Sephadex G-75, обробленої -2 1мл водного розчину хлориду тербію (III) (110 моль/л), поміщають у пробірку, перемішують протягом 5 хвилин до гелеподібного стану. Потім в пробірки додають по 0,5 мл екстракту квітів ромашки аптечної, у дві з них додають по 0,5 мл стандартного розчину галової кислоти з вмістом 110 5 моль/л. Далі додають у кожну пробірку по 0,2 мл ацетатного буферного розчину з рН = 4,3, по . 0,2 мл розчину триоктилфосфіноксиду (1 10 3 моль/л), й перемішують протягом 15 хвилин. Якщо інтенсивність люмінесценції отриманого екстракту велика, то розчин розбавляють 70 % етанолом так, щоб не спостерігалося гасіння люмінесценції. Осад відфільтровують й висушують протягом 60 хвилин при 80 °C. Потім розтирають в ступці до порошкоподібного стану й реєструють інтенсивність люмінесценції комплексу, іммобілізованого на сорбенті, при  изл.=545нм, при збудженні люмінесценції світлом ртутної лампи зі світлофільтром УФС-2 (  ВОЗб.=365нм). Аналогічно готують проби з другою добавкою по вмісту, у два рази перевищуючою першу. Розраховують вміст фенольних сполук за методом добавок. Результати визначення наведені у таблиці 1. У 1 г листів ромашки знайдено 33,5 мг фенольних сполук в перерахунку на галову кислоту (табл.1). Правильність методики підтверджена методом "введено-знайдено" (табл.1), та задовільним збігом результатів, отриманих люмінесцентним методом, який пропонується і спектрофотометричним методом Фоліна-Деніса [Бенетис Р., Радушене И., Якштас В. Количественное определение фенольних соединений в лекарственном сырье тысячелистника обыкновенного методом ВЭЖХ. Химико-фармацевтический ж.-2008. - Т. 42. - Вып.3. - С. 51-54] (табл.2.). Приклади 2,3 ілюструють здійснення способу з використанням різної рослинної сировини. Дані наведені в таблиці №2. Спосіб тест-визначення суми фенольних сполук у рослинній сировині Таблиця 1 Результати визначення фенольних сполук у квітках ромашки аптечної методом "введено-знайдено" Введено, мг/мл 0,0 0,10 0,20 Знайдено, мг/мл 0,67 0,76 0,85 Sr 0,042 0,038 7 63016 8 Таблиця 2 Результати визначення фенольних сполук у рослинній сировині (мг/мл), n=5,0; Р=0,95 № прикладу 1. 2. 3. Рослинна сировина Ромашка Шишки хмелю Чистотіл Люмінесцентний метод, який пропонується Вміст фенольних Sr сполук 0,56 0,035 0,30 0,028 0,54 0,040 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Підписне Спектрофотометричний метод Вміст фенольних сполук 0,67 0,34 0,468 Sr 0,037 0,036 0,029 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601