Живильне середовище для вирощування штаму м-81 hirschioporus laricinus-продуцента молокозгортаючого ферменту

Винахід відноситься до біотехнології і може використовуватись у ферментативній технології для одержання ферменту молокозгортаючої дії на основі культивування нового продуцента - штама М-81 [1]. Цей фермент може використовуватись у сироварінні ! стати замінником гостродефіцитного сичужного фєрменту реніну. Відомі середовища, які містять сахарозу і мінеральні компоненти (середовище Білай, Вельтьє і Хеннеберга), глюкозу і мінеральні елементи (середовище Чапека-Докса) [2], [3], але активність молокозгортаючого ферменту гриба Hirschioporus lartcinus, який зростав на цих середовищах досить низька і на 10-ту добу культивування зникає. Найбільш близьким до заявленого об'єкту є глюкозо-пептонне середовище такого складу, r/л: глюкоза - 10, пептон - 3, KH2PO4 - 0,6, K2HPO4 - 0,4, MgSO 4×7H2O - 0,5, ZnSO4×7H2O - 0,001, СаСІ2 - 0,05, вода до 1 л [4], яке використовувалось для вирощування мікоризного гриба Russula decolorans - продуцента молокозгортаючого ферменту. Це середовище забезпечує утворення ферменту штамом М-81 Hirschioporus laricinus протягом всього періоду його культивування, але в малій кількості, що свідчить про недостатнє забезпечення продуцента необхідними живильними компонентами для його біосинтетичної діяльності. Склад живильного середовища для культивування Н. laricinus в літературі не описано. В основу винаходу поставлена задача - удосконалення відомого середовища (глюкозо-пептонного), в якому шляхом зміни концентрації деяких компонентів та введення допоміжної хімічної сполуки досягають значного підвищення активності та виходу протеаз молокозгортаючої дії при поверхневому культивуванні Н. laricinus. Поставлена задача вирішується тим, що живильне середовище, яке включає глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий одно-заміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, цинк сірчанокислий і кальцій хлористий відповідно винаходу додатково містить натрій хлористий при такому співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-10, КН2РO4 - 0.6, К2НРО 4 - 0,4, MgSO 4×7H2O - 0,91,1, СаСІ2 - 0,11-0,13, NaCI - 0,18-0,20, ZnSO4 x 7Н2О - 0,001, дистильована вода до 1 л. Удосконалення вихідного середовища проводили за методом повного факторного експерименту (ПФЭ-2) [5] від яких в основному залежить біосинтетична активність продуцента. Це глюкоза і пептон, які є джерелами вуглецю та азоту, а сірчанокислий магній і хлористий кальцій - джерелом іонів Mg++ і Са ++, що активують діяльність ферментних систем. Поряд з цим повний факторний експеримент дає можливість виявити найбільш ефективний вплив кожного окремого фактору і їх взаємозв'язок на біосинтез протеаз молокозгортаючої дії штамом М-81 Н. laricinus. Живильне середовище готують шля хом послідовного розчинення його компонентів з послідуючим доведенням дистильованою водою до 1 л. Кислотність середовища доводять до 4,3-4,5 pH за допомогою 10%-ної НСІ. Живильне середовище розливають по 40 мл в конічні колби на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Гриб вирощують протягом 10 діб при температурі 30-31 °С. Молокозгортаючу активність культурального фільтрату визначають за методом Каваї і Мукаї [6], а розрахунок ведуть за формулою [7] де К - коефіцієнт розведення культурального фільтрату /КФ/; П - час згортання молока, хв; 40 - середній час згортання молока при виробництві сиру, хв. Приклад 1. Готують ви хідне середовище такого складу, г/л: глюкоза - 10, пептон - 3, КН2РО 4 - 0,6, К 2НРО4 0.4, MgSO4 х Н2О - 0,5, СаСІ2 - 0,05, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Живильне середовище розливають по 40 мл в конічні колби і стерилізують в автоклаві при 0,8-1 атм протягом 40 хв. Кислотність середовища після стерилізації становила 4,4 pH. Після охолодження середовища його інокулюють кусочком міцелію розміром, приблизно, 10 х 10 мм, вирощують продуцент при температурі 30-31°С протягом 10 діб і визначають молокозгортаючу активність культурального фільтрату. Активність ферменту культуральної рідини дорівнювала 5334 ум. од./100 мл молока, а вихід ферменту становив 54,5 мг/1л середовища. Приклад 2. Готують живильне середовище такого складу, г/л: глюкоза - 14-16, пептон - 5-6, КН2РО4 - 0.6, К2НРО4 - 0,4, MgSO 4×7H2O - 0,7-0,9, СаСl2 - 0,9-0,11, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню середовища такі, як у прикладі 1. Молокозгортаюча активність культуральної рідини дорівнювала 9478 ум. од./100 мл молока, а вихід ферменту становив 74,5 мг/1 л середовища. Приклад 3. Готують живильне середовище такого складу, г/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-10, КН2РО4 - 0,6, К2НРО4 - 0,4, MgSO4×7H2O - 1,1-1,3, СаСІ2 - 0,13-0,15, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню середовища і час вирощування продуцента такі, як у прикладі 1. Молокозгортаючаактивність КФ дорівнювала 28571 ум. од./100 мл молока, а вихід ферменту становив 124,3 мг/1 л середовища. Приклад 4. Готують живильне середовище, r/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-10, КН2РO4 - 0,6, К2НРО4 - 0,4, MgSO4×7H2 O - 0,9-1,1, СаСІ2 - 0,11-0,13, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню живильного середовища і період культивування гриба такий, як у прикладі 1. Активність ферменту культурального фільтрату дорівнювала 55006 ум. од./100 мл молока. Вихід ферменту становив 166 мг/1 л середовища. Таким чином, при вирощуванні штама М-81 Hirschioporus laricinus на середовищі, яке має співвідношення глюкози - 18-20, пептону - 8-10, MgSO4×7H2 O - 0,9-1,1 і СаСІ2 - 0,11-0,13 г/л є оптимальним для одержання ферменту молокозгортаючої дії. Введення допоміжної сполуки - хлористого натрію здійснювали в оптимізоване глюкозо-пептонне. середовище в концентрації 0,1, 0,2 і 0,25 г/л. Приклад 5. Готують живильне середовище такого складу, г/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-10, КН2РО4 - 0,6, К2НРО4 - 0,4, MgSO4×7H2 O - 0,9-1,1, СаСІ2 - 0,11-0,13, NaCI - 0,1-0,15, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню живильного середовища і період культивування гриба такий, яку прикладі 1. Активність ферменту дорівнювала 63490, од./100 мл молока. Вихід ферменту в кристалічному стані становив 179,1 мг/л середовища. Приклад 6. Готують живильне середовище такого складу, г/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-10, КН2РО4 - 0,6, К2НРO4 - 0,4, MgSO4×7H2O - 0,9-1,1, СаСІ2 - 0,11-0,13, NaCI - 0,18-0,20, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Всі операції по при готуванню середовища такі, як у прикладі 1. Молокозгортаюча активність КФ дорівнювала 85106 ум. од./100 мл молока. Вихід ферменту становив 234 мг на 1л живильного середовища. Приклад 7. Готують живильне середовище такого складу, г/л: глюкоза - 18-20, пептон - 8-10, КН2РO4 - 0,6, К2НРО4 - 0,4. MgSO4×7H2O - 0,9-1.1, СаСІ2 - 0,11-0,13. NaCI - 0,23-0,25, ZnSO4×7H2O - 0,001, дистильована вода до 1 л. Всі операції по приготуванню живильного середовища такі, як у прикладі 1. Молокозгортаюча активність культурального фільтрату становила 62395 ум. од./100 мл молока. Вихід ферменту у кристалічному стані дорівнював 167 мг/л середовища. Таким чином оптимізоване глюкозо-пептонне живильне середовище, яке містить у своєму складі NaCI в концентрації 0,18-0,20 г/л є оптимальним для культивування гриба Hirschioporus laricinus з метою одержання ферменту у кристалічному стані. Це середовище дає можливість одержати у кристалічному стані ферментного препарату у 4,3 рази більше, ніж вихідне.