Спосіб діагностики ідіопатичного легеневого фіброзу

Спосіб діагностики ідіопатичного легеневого фіброзу шляхом визначення активності глутатіонпероксидази в біологічному матеріалі, який відрізняється тим, що визначають активність глутатіон-пероксидази в гемолізаті еритроцитів і при значенні показника активності 385,09×5,15 мкмоль GSH/хв × г Hb та нижче діагностують ідіопатичний легеневий фіброз. (19) (21) u201104508 (22) 13.04.2011 (24) 25.11.2011 (46) 25.11.2011, Бюл.№ 22, 2011 р. (72) ЖАДАН ВІКТОРІЯ МИКОЛАЇВНА, КОРЖОВ МАКСИМ ВІТАЛІЙОВИЧ, КОРЖОВ ВІТАЛІЙ ІВАНОВИЧ (73) ДЕРЖАВНА УСТАНОВА "НАЦІОНАЛЬНИЙ ІНСТИТУТ ФТИЗІАТРІЇ І ПУЛЬМОНОЛОГІЇ ІМЕНІ 3 1) ГП знешкоджує Н2О2 у цитозолі й мітохондріях, а каталаза зосереджена в основному в пероксисомах; 2) спорідненість ГП до Н2О2 вище, тому саме ГП захищає від частіше виникаючих низьких концентрацій Н2О2; 3) недостатність або інгібування ГП (але не каталази) призводять до збільшення пероксидації й порушення функцій біохімічних систем; 4) ГП відіграє головну роль у валовому метаболізмі Н2О2; 5) ГП не тільки попереджає накопичення гідропероксидів, але й ефективно їх відновлює (див. Мещишен І.Ф. Глутатіонова система організму за умов норми та патології: Актова промова [Текст] / І.Ф. Мещишен. - Чернівці: Медакадемія, 1999. - 26 с.). Ідіопатичний легеневий фіброз - це захворювання легенів невстановленої етіології з явищем неінфекційного запалення й фіброзу переважно в інтерстиції легені. Захворювання супроводжується рестриктивними порушеннями легеневої вентиляції, зменшенням загальної ємності легенів за рахунок її складових, гіпоксемією і гіпокапнією з дихальним алкалозом. Прогноз захворювання звичайно вважається поганим. Смерть при ідіопатичному легеневому фіброзі може настати або через повільне прогресування захворювання й розвиток хронічної дихальної недостатності, або гостро, внаслідок швидконаростаючої дихальної недостатності, прогресуючої гіпоксемії, дифузних інфільтратів, в результаті гострого ушкодження альвеол з/або без утворення гіалінових мембран. Діагноз захворювання ставиться на підставі клінічних, інструментальних і інших методів діагностики (рентгенографія органів грудної клітки, комп'ютерна томографія високої роздільної здатності, дослідження функції зовнішнього дихання, дослідження газового складу й кислотно-основного стану крові) (див. Фещенко Ю.И. Идиопатические интерстициальные пневмонии: классификация, дифференциальная диагностика [Текст] / Ю.И. Фещенко, В.К. Гаврисюк, Н.Е. Моногарова // Укр. пульмонол. журн. - 2007. - № 2. - С. 5-11). Недоліком цих методів є тривалість дослідження, неможливість визначення захворювання на ранніх стадіях процесу. Метод ферментної діагностики, а конкретно, визначення активності ГП має позитивний аспект у тому, що клінічні прояви ідіопатичного легеневого фіброзу не строго специфічні, оскільки багато симптомів (задишка, кашель, нездужання) зустрічаються й при іншій бронхолегеневій патології й, внаслідок чого, не можуть бути діагностичними критеріями даного захворювання. За даними ряду дослідників, при порівнянні різних видів патології легень специфічним є зростання активності глутатіон-пероксидази в крові. Так, при захворюванні на рак легень активність глутатіон-пероксидази зростає в 2,3 рази, при хронічному бронхіті - в 2,2 рази, при пневмосклерозі - в 3,0 рази порівняно з конт7 ролем (див. Пат. 72688 А Україна, МПК G01N33/50, А61В10/00. Спосіб діагностики та прогнозування перебігу захворювання на рак легень 64930 4 за допомогою глутатіонтрансферази [Текст] / Скляров О.Я.; заявник і патентовласник Львівський Національний медичний університет імені Данила Галицького. - № u200711905; заявл. 29.10.07; опубл. 25.02.08, Бюл. № 4. - 1 с.; Состояние глутатион-зависимой ферментной системы при экспериментальной бронхолегочной патологии разного генеза [Текст] / В.М. Жадан [и др.] // Буковинський медичний вісник.-2005. - Т. 9, № 2. - С. 92-94; Жадан В.М. Стан глутатіон-залежної ферментної системи крові за умов інфекційної пневмонії з супутнім захворюванням [Текст] / В.М. Жадан, В.І. Коржов // Медична хімія. - 2009. - № 2. - С. 71-75.). Відомі способи діагностики ідіопатичного легеневого фіброзу, що полягають у хірургічній відкритій або відеоторакоскопічній біопсії легень, та використовуються для встановлення вірогідного клініко-патоморфологічного діагнозу ідіопатичного легеневого фіброзу (див. Johnston I.D. British thoracic society study of cryptogenic fibrosing alveolitis: current presentation and initial management [Text] / I.D. Johnston [et al.] // Thorax - 1997. - V. 52. - P. 38-44; Bensard D.D. Comparison of video thoracoscopic lung biopsy to open lung biopsy in the diagnosis of interstitial lung disease [Text] / D.D. Bensard [et al.] // Chest - 1993. - V. 103. - P. 765770). Однак зазначеним способам властиві наступні недоліки: -необхідність використання біоптату легень, що є травматичним процесом; - гіподіагностування фіброзу легенів, оскільки легені утягуються в нього не повністю й нерівномірно; - дороге обладнання для проведення операцій; - потрібна значна витрата часу. Найбільш близьким по технологічній суті до способу, що заявляється, є спосіб діагностики ідіопатичного легеневого фіброзу, що полягає у визначенні активності глутатіон-пероксидази в тканині легень щурів із блеомінін-індукованим фіброзом легенів (див. Preventive effect of melatonin on bleomycin-induced lung fibrosis in rats [Text] / Z. Yildirim [et al.] // J. Pincal. Res.-2006. - V. 40, № 1. - P. 27-33.). При експериментальному блеоміцин-індукованому фіброзі легенів у щурів суттєво знижується активність глутатіонпероксидази, каталази і супероксиддисмутази в легеневій тканині. Однак даному способу властиві наступні недоліки: - спосіб складний для виконання; - складність отримання тканині легень; - спосіб вимагає значних затрат часу, через те, що для отримання блеоміцин-індукованого фіброзу легень потрібно 14 діб; - дороге моделювання фіброзу легень; - неможливість проведення повторних досліджень з необхідною частотою в динаміці на фоні лікування. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб діагностики ідіопатичного легеневого фіброзу, в якому шляхом визначення в крові хворого активності одного з ключових антио 5 ксидантних ферментів глутатіон-залежної системи - глутатіон-пероксидази - досягається скорочення терміну діагностики та спрощення способу. Поставлена задача досягається тим, що в способі діагностики ідіопатичного легеневого фіброзу шляхом визначення активності глутатіонпероксидази в біологічному матеріалі, згідно з корисною моделлю, визначають активність глутатіон-пероксидази в гемолізаті еритроцитів і при значенні показника активності 385,09±5,15 мкмоль GSH/хв.  г Hb та нижче діагностують ідіопатичний легеневий фіброз. Спосіб здійснюють наступним чином. З ліктьової вени забирають 5 мл венозної крові (натще), після чого її гепаринізують (5 МО/мл), далі відмивають еритроцити за стандартною схемою. Для дослідження використовують гемолізат еритроцитів, приготовлений таким способом: цільну кров, гепаринізовану за стандартною методикою, центрифугують та видаляють плазму крові. Осад еритроцитів двічі промивають холодним 0,9 % розчином хлориду натрію в співвідношенні 1:10, перемішуючи скляною паличкою та центрифугуючи 15 хв. при 3000 об/хв. Відмиті еритроцити гемолізують рівним об'ємом холодної дистильованої води. Концентрацію гемоглобіну доводять до 10 г/л розведенням гемолізату дистильованою водою. Концентрацію гемоглобіну (Нb) в цьому гемолізаті визначають ціанметгемоглобіновим методом (див. Унификация клинических лабораторных методов исследования: Сб. науч. тр. / под ред. В.П. Меньшикова. - М.: Медицина, 1988.-124 с.). Мірою активності ферменту глутатіонпероксидази (КФ. 1.11.1.9) є швидкість окиснення глутатіону в присутності гідропероксиду третинного бутилу. Концентрацію відновленого глутатіону (GSH) до і після інкубації визначають колориметрично. В основі розвитку кольорової реакції лежить взаємодія SH-груп 5,5-дитіобіс(2нітробензойної) кислоти (ДТНБК) з утворенням пофарбованого продукту - тіонітрофенільного аніона (ТНФА). Вміст останнього прямо пропорційний вмісту SН-груп, що прореагували з ДТНБК. Хід дослідження: 100 мкл гемолізату преінкубують в термостаті з 830 мкл 4,8 мМ розчином відновленого глутатіону на трис-НСl-буфері 0,1 М, рН 8,5, що містить 6 мМ динатрієвої солі етилендіамінтетраоцтової кислоти (ЕДТА) і 12 мМ азиду натрію, протягом 10 хв. при 37 °C, потім додають 70 мкл гідропероксиду третинного бутилу 20 мМ та інкубують точно 5 хв. Реакцію зупиняють додаванням 200 мкл холодної трихлороцтової кислоти, центрифугуванням протягом 10 хв. при 3000 об/хв. видаляють осаджені білки. 100 мкл супернатанту вносять до 10 мл трисНСl-буфера і додають 100 мкл реактиву Елмана. Через 5 хв. проби фотометрують при 412 нм у кюветі з довжиною оптичного шляху 1 см. Контрольна проба відрізняється тим, що гемолізат вносять безпосередньо перед осадженням білків. З урахуванням розведення біологічного матеріалу і коефіцієнта молярної екстинції ТНФА при 412 нм - 11400 - розраховують активність глутатіон-пероксидази в мікромолях, витраченого в реак 64930 6 ції субстрату по формулі (див. Мовин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатион-пероксидазы в эритроцитах [Текст] / В.М. Мовин // Лаб. дело.-1986. - № 8. - С. 724-722): (Е контр. -Е досліду) 2147=мкмоль GSH/хвг Нb, де Е контр. - оптична густина контрольної проби; Е досліду - оптична густина дослідної проби; 2147 - коефіцієнт перерахунку, що розраховується математичним шляхом з урахуванням розведення гемолізату і коефіцієнта молярної екстинції ТНФА. Проведеними дослідженнями встановлено, що активність глутатіон-пероксидази у здорових людей становить 458,25±12,12 мкмоль GSH/хв.г Нb, у хворих на ідіопатичний легеневий фіброз 385,09±5,15 мкмоль GSН/хв.  г Нb і нижче, що вказує на зміни в антиоксидантній системі організму, які зумовлені патологічним процесом. Наводимо конкретні приклади здійснення способу. Приклад 1. Хвора Ж-к К. П., 52 роки, історія хвороби № 1754-2010, була прийнята у відділення інтерстиціальних захворювань легень ДУ "Національний інститут фтизіатрії і пульмонології імені Ф.Г. Яновського АМН України" для уточнення діагнозу - ідіопатичний легеневий фіброз та лікування. Вважає себе хворою 2 роки, при госпіталізації стан був важкий, основними скаргами були задишка при фізичному навантаженні, сухий кашель, слабкість, біль в кістках, спині, суглобах, відчуття нестачі повітря, серцебиття, при прослуховуванні легень: тріскучий субкрепітувальний хрип. При проведенні дослідження, згідно з запропонованим способом, виявлено вірогідне зниження активності глутатіонпероксидази, ключового антиоксидантного ферменту, до значень 384,31 мкмоль GSH/хв. ± г Hb порівняно з контрольними значеннями у здорових осіб - 458,25±12,12 мкмоль GSH/хв. ± г Hb. Зниження активності даного ферменту корелює з даними рентгенологічного дослідження та комп'ютерної томографії високої роздільної здатності органів грудної порожнини, які підтверджують діагноз - ідіопатичпий легеневий фіброз. Приклад 2. Хвора Ш-ка Л. І., 59 років, історія хвороби № 1762-2010, була прийнята у відділення інтерстиціальних захворювань легень ДУ "Національний інститут фтизіатрії і пульмонології імені Ф.Г. Яновського АМН України" для уточнення діагнозу - ідіопатичний легеневий фіброз та лікування. Вважає себе хворою 3 роки, при госпіталізації основними скаргами були загальна слабкість, сухий кашель, задишка при незначному фізичному навантаженні, при прослуховуванні легень: в нижніх відділах крепітувальні хрипи по типу "целофану". При проведенні дослідження, згідно з запропонованим способом, виявлено вірогідне зниження активності глутатіон-пероксидази, ключового антиоксидантного ферменту, до значень 317,76 мкмоль GSH/хв  г Hb порівняно з контрольними значеннями у здорових осіб - 458,25±12,12 мкмоль GSH/хв  г Hb. Зниження активності даного ферменту коре 7 64930 лює з даними рентгенологічного дослідження та комп'ютерної томографії високої роздільної здатності органів грудної порожнини, які підтверджують діагноз - ідіопатичний легеневий фіброз. Спосіб, що заявляється, був застосований у 11 хворих на ідіопатичний легеневий фіброз, у 7 з них активність глутатіон-пероксидази в гемолізаті еритроцитів була нижча за 385,09 і 5,15 мкмоль GSH/хв.  г Hb, що складає 63,6 % ефективності. 8 Контрольну групу становили 20 здорових осіб донорів, у яких активність глутатіон-пероксидази склала 458,25±12,12 мкмоль GSH/хв.  г Hb. В табл. наведено дані статистичної обробки показників активності глутатіон-пероксидази, згідно з запропонованим способом, у хворих на ідіопатичний легеневий фіброз. Таблиця Активність глутатіон-пероксидази в крові хворих на ідіопатичний легеневий фіброз (М±m) Показник ГП, мкмоль GSH/хв.  г Hb Здорові особи (n=20) 458,25±12,12 Ідіопатичний легеневий фіброз (n=11) 385,09±5,15* Примітка: * - різниця показників відносно здорових осіб вірогідна (Р