Спосіб одержання ліпосомального антибактеріального засобу хлорофіліпту

Спосіб одержання ліпосомального антибактеріального засобу шляхом створення розчину суміші, яка містить фосфатидилхолін, висушування суміші у вакуумі, її емульгування у водному середовищі, диспергування емульсії з додаванням лактози, поетапної фільтрації, стерилізуючої фільтрації, розливу і ліофільного висушування, який відрізняється тим, що спиртовий розчин фосфатидилхоліну змішують зі спиртовим розчином хлорофіліпту із співвідношенням інгредієнтів (мас. ч.) (10-30):1, висушування суміші у вакуумі виконують при температурі 35-45°С, а співвідношення фосфатидилхолін:водне середовище емульгування становить (мас. ч.) 1:(40-120). UA (21) 20031212367 (22) 25.12.2003 (24) 15.02.2006 (46) 15.02.2006, Бюл. № 2, 2006 р. (72) Теміров Юрій Павлович, Швец Віталій Іванович, RU, Краснопольський Юрій Михайлович, Сеннікова Ірина Георгіївна (73) ЗАКРИТЕ АКЦІОНЕРНЕ ТОВАРИСТВО "ХАРКІВСЬКЕ ПІДПРИЄМСТВО ПО ВИРОБНИЦТВУ ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ТА ЛІКАРСЬКИХ ПРЕПАРАТІВ "БІОЛІК" (56) UA А 46528 15.05.2002 Применение хлорофиллипта для лечения и профилактики гнойно-воспалительных заболеваний стафилококковой этиологии. Методические рекомендации / Харьковский НИИ микробиологии, вакцин и сывороток им. Мечникова - Харьков, 1988. 29 с. UA A 28659 16.10.2000 C2 2 (19) 1 3 69303 4 жливість його адсорбції на стінках трубки. - хлорофіліпту з пролонгованою дією на організм. Критеріям ефективності у створенні оптимальРеалізація цієї задачі досягається заявляємим них засобів терапії бактеріальних інфекцій адекваспособом отримання ліпосомального антибактерітні способи отримання ліпосомальних продуктів, ального засобу на основі ліпосомальної композиції які містять фосфоліпіди - основні компоненти ліпіпевних співвідношень двох речовин, а саме: придного матрикса клітинних мембран. родного фосфоліпіду - фосфатидилхоліну та приВідомий спосіб отримання ліпосомальної комродного антибактеріального засобу з листя евкапозиції на основі природного фосфатидилхоліну ліпту - хлорофіліпту. (яєчного лецитину) (Патент України №46528 А, Поставлена задача вирішується тим, що в МПК6 А 61 К 9/127, А 61 К 33/06, 2002), обраний способі отримання ліпосомального засобу, що прототипом заявляємого об'єкту, як найбільш бливключає створення розчину суміші, яка містить зький його аналог за сумою ознак, а саме: суттю і фосфатидилхолін, висушування суміші у вакуумі, її послідовністю здійснення основних операцій і заемульгування у водному середовищі, диспергуходів та ліпосомальною організацією цільового вання емульсії з додаванням лактози, поетапну продукту. Спосіб за прототипом передбачає ствофільтрацію, стерилізуючу фільтрацію, розлив та рення розчину суміші, яка містить фосфатидилхоліофільне висушування, згідно з винаходом, спирлін, висушування суміші у вакуумі при температурі товий розчин фосфатидилхоліну змішують зі спир30-40°С, її емульгування у водному середовищі товим розчином хлорофіліпту із співвідношенням при співвідношенні фосфатидилхолін: водне сереінгредієнтів (мас. ч.) (10-30) : 1, висушування судовище емульгування (мас. ч.) 1 : (60-80), дисперміші у вакуумі виконують при температурі 35-45°С, гування емульсії з додаванням лактози у вигляді а співвідношення фосфатидилхолін : водне сереводного розчину, поетапну фільтрацію, послідовно довище емульгування становить (мас. ч.) 1 : (40зменшуючи розмір пор на фільтрах, стерилізуючу 120). фільтрацію, розлив та ліофільне висушування. Залежність характеристик якості ліпосомальОднак використований склад ліпосомальної комного засобу від співвідношення фосфатидилхолін: позиції не дозволяє отримати препарат з антибакхлорофіліпт, температури висушування суміші у теріальними властивостями. вакуумі та співвідношення фосфатидилхолін: водВ основу винаходу, що заявляється, поставне середовище емульгування та технічний резульлено задачу створити спосіб отримання ліпосоматат, що отриманий за їх допомогою, наведені в льного антибактеріального засобу, який дозволяє табл.1 - 3. одержати водорозчинну форму цільового продукту Таблиця 1 Залежність характеристик якості ліпосомального засобу від співвідношення фосфатидилхолін : хлорофіліпт Співвідношення фосфатидилхолін : хлорофіліпт, мас. ч. Показники 5:1 Включення хлорофіліпту до 70 ліпосоми, % Антибактеріальна активнеможливо виконість відносно St aureus ристовувати Розмір ліпосом, нм 240 Можливість стерилізуючої неможливо фільтрації Як видно з даних, наведених у табл.1, оптимальним є співвідношення фосфатидилхолін : хлорофіліпт (мас. ч.) (10-30) : 1. Використання співвідношень менш зазначених призводить до зниження включення хлорофіліпту до ліпосоми, що призводить до появи вільного хлорофіліпту, 10:1 20:1 30:1 35:1 92 100 100 100 активний активний активний 160 150 150 низька активність 130 можливо можливо можливо можливо заважаючого провадженню стерилізуючої фільтрації, а також збільшує розмір ліпосом у продукті, що небажано при внутрішньовенному уведенні засобу. Збільшення співвідношення призводить до зниження антибактеріальної активності засобу. Таблиця 2 Залежність характеристик якості ліпосомального засобу від температури висушування суміші у вакуумі Показники Включення хлорофіліпту до ліпосоми, % Індекс окислювання 30 Температура висушування суміші у вакуумі, °С 35 40 45 50 89 100 100 100 100 0,18 0,18 0,2 0,23 0,31 5 69303 Як видно з даних, наведених у табл. 2, оптимальною температурою висушування суміші у вакуумі є температура 35-450С, яка забезпечує повне включення хлорофіліпту до фосфатидилхолінової ліпосоми. Зменшення тем 6 ператури призводить до нерівномірного розчину хлорофіліпту у фосфатидилхоліні, що призводить до неповного включення його до ліпосоми. Збільшення температури збільшує індекс окислювання. Таблиця 3 Залежність характеристик якості ліпосомального засобу від співвідношення фосфатидилхолін : водне середовище емульгування Показники Включення хлорофіліпту до ліпосоми, % Розмір ліпосом, нм Співвідношення фосфатидилхолін : водне середовище емульгування, мас. ч. 1:30 1:40 1:80 1:120 1:140 100 100 100 100 92 300 240 220 200 200 Як видно з наведених у табл.3 даних, оптимальним є співвідношення фосфатидилхолін : водне середовище емульгування (мас. ч.) 1 : (40-120). Зменшення співвідношення призводить до збільшення розміру ліпосом, що заважає провадженню стерилізуючої фільтрації. Збільшення співвідношення призводить до зниження включення хлорофіліпту до ліпосоми, що також заважає провадженню стерилізуючої фільтрації. Можливість здійснення винаходу ілюструється наступними прикладами: Приклад 1 Точну наважку 250 г фосфатидилхоліну („лецитинове масло" - „лецитин-стандарт", випарений до постійної ваги) розчиняють віл спирту етилового. До отриманого розчину додають 200 мл спирту етилового, що містить 25 г хлорофіліпту (субстанція хлорофіліпту у вигляді масла). Суміш розчинів ретельно перемішують і переносять у круглодонну скляну колбу, яку вміщують на ротаційний випаровувач, і видаляють спирт етиловий у вакуумі при температурі 35-45°С. По закінченні процесу випаровування у колбу протягом 5°хв пропускають інертний газ. Отриману ліпідну плівку із стінок колби кількісно знімають порціями по 1 л води для ін'єкцій. Кожну порцію переносять в одну скляну ємність. Після повного зняття плівки у скляну ємність додають воду для ін'єкцій до об'єму рідини 20 л і перемішують протягом 1 год. Емульсію переносять у реактор гомогенізатора високого тиску Laval ", додають 7 л води для ін'єкцій і підда„ ють диспергуванню при тиску 60 МПа і температурі 40-45°С з контролем оптичної густини рідини, що гомогенізується. При досягненні показника оптичної густини - не більше 0,2 (довжина хвилі 540 нм; товщина шару поглинання = 0,5см) до отриманої емульсії додають стерильний розчин 250 г лактози (молочний цукор фармакопейний) у 3 л води для ін'єкцій. Продовжують диспергування в реакторі гомогенізатора високого тиску до досягнення показника оптичної густини емульсії не більше 0,15 (довжина хвилі 540 нм; товщина шару поглинання = 0,5 см). Отриману емульсію послідовно фільтрують на установці „Millipore" через мембрани 0,65 мкм, 0,45 мкм, потім - 0,22 мкм, далі піддають стерилізуючій фільтрації та дозовано розливають в асептичних умовах в скляні флакони на 50 мл. Флакони з емульсією піддають інтенсивному заморожуванню до -70°С та проводять ліофільне (сублімаційне) висушування в установці ТГ-50. Після висушування флакони продувають інертним газом, закривають і герметизують флакони із ліпосомальним продуктом в асептичних умовах. Цільовий продукт є аморфна маса зеленого кольору з характерним запахом. Приклад 2 Точну наважку 500 г фосфатидилхоліну („лецитинове масло" - „лецитин-стандарт", випарений до постійної ваги) розчиняють віл спирту етилового. До отриманого розчину додають 200 мл спирту етилового, що містить 25 г хлорофіліпту (субстанція хлорофіліпту у вигляді масла). Суміш розчинів ретельно перемішують і переносять у круглодонну скляну колбу, яку вміщують на ротаційний випаровувач, і видаляють спирт етиловий у вакуумі при температурі 35-45°С. По закінченні процесу випаровування у колбу протягом 5 хв пропускають інертний газ. Отриману ліпідну плівку із стінок колби кількісно знімають порціями по 1 л води для ін'єкцій. Кожну порцію переносять в одну скляну ємність. Після повного зняття плівки у скляну ємність додають воду для ін'єкцій до об'єму рідини 20 л і перемішують протягом 1 год. Емульсію переносять у реактор гомогенізатора високого тиску Laval ", додають 7 л води для ін'єкцій і підда„ ють диспергуванню при тиску 60 МПа і температурі 40-45°С з контролем оптичної густини рідини, що гомогенізується. При досягненні показника оптичної густини не більше 0,2 (довжина хвилі 540 нм; товщина шару поглинання = 0,5 см) до отриманої емульсії додають стерильний розчин 500 г лактози (молочний цукор фармакопейний) у 3 л води для ін'єкцій. Продовжують диспергування в реакторі гомогенізатора високого тиску до досягнення показника оптичної густини емульсії не більше 0,15 (довжина хвилі 540 нм; товщина шару поглинання = 0,5 см). Отриману емульсію послідовно фільтрують на установці „Мilliроrе" через мембрани 0,65 мкм, 0,45 мкм, потім - 0,22 мкм, далі піддають стерилізуючій фільтрації та дозовано розливають в асептичних умовах в скляні флакони на 50 мл. Флакони з емульсією піддають інтенсивному заморожуванню до -70°С та проводять ліофільне (сублімаційне) висушування в установці 7 69303 8 ТГ-50. Після висушування флакони продувають 540 нм; товщина шару поглинання = 0,5 см) до інертним газом, закривають і герметизують флаотриманої емульсії додають стерильний розчин кони із ліпосомальним продуктом в асептичних 750 г лактози (молочний цукор фармакопейний) у умовах. Цільовий продукт є аморфна маса зелено3 л води для ін'єкцій. Продовжують диспергування го кольору з характерним запахом. в реакторі гомогенізатора високого тиску до досягПриклад 3 нення показника оптичної густини емульсії не біТочну наважку 750 г фосфатидилхоліну („лельше 0,15 (довжина хвилі 540 нм; товщина шару цитинове масло" - „лецитин-стандарт", випарений поглинання = 0,5 см). Отриману емульсію послідодо постійної ваги) розчиняють віл спирту етилововно фільтрують на установці „Millipore" через мемго. До отриманого розчину додають 200 мл спирту брани 0,65 мкм, 0,45 мкм, потім - 0,22 мкм, далі етилового, що містить 25 г хлорофіліпту (субстанпіддають стерилізуючій фільтрації та дозовано ція хлорофіліпту у вигляді масла). Суміш розчинів розливають в асептичних умовах в скляні флакони ретельно перемішують і переносять у круглодонну на 50 мл. Флакони з емульсією піддають інтенсивскляну колбу, яку вміщують на ротаційний випароному заморожуванню до 70°С та проводять ліофівувач, і видаляють спирт етиловий у вакуумі при льне (сублімаційне) висушування в установці ТГтемпературі 35-45°С. По закінченні процесу випа50. Після висушування флакони продувають інерровування у колбу протягом 5 хв пропускають інетним газом, закривають і герметизують флакони із ртний газ. Отриману ліпідну плівку із стінок колби ліпосомальним продуктом в асептичних умовах. кількісно знімають порціями по 1 л води для ін'єкЦільовий продукт є аморфна маса зеленого коцій. Кожну порцію переносять в одну скляну ємльору з характерним запахом. ність. Після повного зняття плівки у скляну ємність Для провадження досліджень ліпосомального додають воду для ін'єкцій до об'єму рідини 20 л і цільового продукту використовували емульсію, перемішують протягом 1 год. Емульсію переносять одержану шляхом додавання у флакони з засобом у реактор гомогенізатора високого тиску стерильного 0,9% розчину натрію хлориду ізотонічного. Laval ", додають 7 л води для ін'єкцій і підда„ Ефективність способу, що заявляється, за поють диспергуванню при тиску 60 МПа і температуказниками якості цільового ліпосомального продурі 40-45°С з контролем оптичної густини рідини, кту у порівнянні із стандартним продуктом, навещо гомогенізується. При досягненні показника опдена у табл. 4. тичної густини не більше 0,2 (довжина хвилі Таблиця 4 Показники Ліпосомальний продукт Форма випуску Аморфна маса зеленого кольору Розчинник готового продукту Розчин 0,9% натрію хлориду ізотонічного, або вода для ін'єкцій - 100% Стандартний продукт 0,25% спиртовий розчин зеленого кольору 95,6% розчин спирту етилового 1,66 0,125 можливо неможливо 12 6 активен активен Вміст хлорофіліпту в 1 мл засобу при внутрішньовенному уведенні, мг Уведення засобу внутрішньо краплинно Час зберігання терапевтичної концентрації засобу при внутрішньовенному уведенні у кроликів, год Антибактеріальна активність відносно St aureus Як видно з наведених у табл.4 даних, цільовий ліпосомальний продукт - хлорофіліпт, отриманий способом, що заявляється, має суттєві переваги перед стандартним продуктом - хлорофіліптом: 1. Є водорозчинним продуктом (100%), що дозволяє позбавитись від спирту при внутрішньовенному уведенні засобу. 2. Дозволяє уводити разово значні терапевтичні дози через те що вміст хлорофіліпту в 1 мл засобу при внутрішньовенному уведенні в 8 разів більше, ніж у стандартного продукту, і його терапевтична концентрація зберігається в 2 раза довше (пролонгована дія на організм). 3. Дозволяє уводити засіб внутрішньокраплинКомп’ютерна верстка M. Клюкін но. При цьому отриманий ліпосомальний засіб хлорофіліпт також виявляє антибактеріальну активність відносно St aureus. З огляду на викладене вище і з урахуванням розкритого причинно-наслідкового зв'язку між сукупністю ознак винаходу, що заявляється, та технічним результатом, що отриманий за їх допомогою, можна стверджувати, що задача, поставлена в основу створеного способу отримання ліпосомального антибактеріального засобу, цілком виконана, бо такий спосіб дозволяє одержати водорозчинну форму цільового продукту - хлорофіліпту з пролонгованою дією на організм. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601