Тест-система імуноферментна кількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу igg до toxoplasma gondii (dia-toxo-igg-av)

Реферат: Тест-система імуноферментна для кількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу IgG до Toxoplasma gondii (DIA-TOXO-IgG-av), в якій на полістироловий планшет сорбовані антигени Т. gondii, а як кон'югат використовуються антитіла проти імуноглобулінів класу IgG людини. Для визначення індексу авідності специфічних IgG антитіл досліджувану сироватку і два позитивних контролів (один - високотитражний, другий - низькотитражний, відкалібровані по Міжнародному стандарту ВООЗ - Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, (NIBSC) для кількісного визначення наявності антитіл класу IgG в досліджуваних зразках, інкубують в паралельних лунках імуносорбенту і потім один зразок промивають в звичайному режимі, а інший обробляють дисоціюючим розчином, який руйнує комплекси антигенів з низькоавідними IgG антитілами, після внесення кон'югату моноклональних антитіл проти IgG людини, мічених ферментом, а потім однокомпонентного розчину хромогену розраховують індекс авідності як відношення оптичної густини, отриманої при виявленні специфічних IgG антитіл в присутності дисоціюючого розчину, до оптичної густини, отриманої при аналізі даного зразка, необробленого їм. UA 72428 U (12) UA 72428 U UA 72428 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для кількісного аналізу і визначення авідності антитіл класу IgG до збудника токсоплазмозу в сироватці або плазмі крові людини. Токсоплазмоз - протозойне захворювання, збудником якого є облігатний внутріклітинний паразит Toxoplasma gondii. Зараження токсоплазмозом відбувається при вживанні в їжу термічно недостатньо оброблених м'ясопродуктів, уражених цистами токсоплазм. Можлива також трансплантаційна передача токсоплазм - при трансплантації органів інфікованих донорів, і конгенітальна - при внутрішньоутробному зараженні плоду від матері через плаценту. Інфікування в першому триместрі вагітності призводить до завмирання та абортуванню плоду. В переважній більшості випадків набутий токсоплазмоз протікає в латентній або хронічній формі. Латентна форма токсоплазмозу характеризується безсимптомним перебігом, що ускладнює клінічну діагностику захворювання. При первинному інфікуванні IgG антитіла до T.gondii з'являються в крові через 1-2 місяці та зберігаються протягом всього життя, при рецидивах захворювання їх рівень різко підвищується. Показник індексу авідності специфічних IgG антитіл (міцність зв'язку специфічних антитіл з антигенними детермінантами Т. gondii) є додатковим параметром для визначення терміну первинного інфікування. Він дозволяє підтвердити діагноз гострого токсоплазмозу та диференціювати первинну інфекцію від хронічної та перенесеної в минулому. Тест на визначення індексу авідності специфічних IgG антитіл входить до обов'язкового алгоритму обстеження вагітних жінок при підозрі токсоплазмозу. Індекс авідності специфічних IgG антитіл в перші 2-3 місяці захворювання підвищується і потім лишається стабільним. Відома тест-система для виявлення імуноглобулінів класу G проти Т. gondii у сироватках і плазмі крові людини [1]. В основі тест-системи лежать антигени збудника або рекомбінантні поліпептиди аналоги антигенів Т. gondii, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовані антилюдські-антитіла проти IgG, зв'язані з пероксидазою. Суть корисної моделі в створенні імуноферментної тест-системи для кількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу IgG до Т. gondii в сироватці або плазмі крові людини. Поставлена задача вирішується шляхом використання імуносорбенту з сорбованими антигенами Т. gondii, двох позитивних контролів (одного - високотитражного, другого низькотитражного), відкаліброваних по Міжнародному стандарту ВООЗ - Anti-Toxoplasma serum, Human TOXM, (NIBSC) для кількісного визначення наявності антитіл класу IgG в досліджуваних зразках, кон'югату моноклональних антитіл проти IgG людини, мічених ферментом, дисоціюючого розчину для визначення звідності AT і однокомпонентного розчину хромогену. Для визначення індексу авідності специфічних IgG антитіл досліджувану сироватку інкубують в паралельних лунках імуносорбенту. Потім один зразок промивають в звичайному режимі, а інший обробляють дисоціюючим розчином (ДР), який руйнує комплекси антигенів з низькоавідними IgG антитілами. Антитіла, що залишились зв'язаними з антигеном, виявляють пероксидазним конъюгатом. Індекс авідності розраховують як відношення оптичної густини, отриманої при виявленні специфічних IgG антитіл в присутності ДР, до оптичної густини, отриманої при аналізі даного зразка, необробленого ДР. Приклад 1. Визначення авідності антитіл класу IgG до Т. gondii в сироватці крові хворої С, 1992 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього в лунки імуносорбенту з фіксованими на антигенами Т. gondii вносять в лунки по 100 мкл попередньо розведених 1:50 сироваток та контролів. Для визначення індексу авідності специфічних IgG антитіл досліджувану сироватку інкубують в паралельних лунках імуносорбенту. Потім один зразок промивають в звичайному режимі, а інший обробляють дисоціюючим розчином (ДР), який руйнує комплекси антигенів з низькоавідними IgG антитілами. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі (37±2)°С протягом 60 хв. Після закінчення інкубації промивають планшет 4 рази розчином для промивання. Антитіла, що залишились зв'язаними з антигеном, виявляють пероксидазним кон'югатом, який вносять в лунки по 100 мкл. Знову інкубують планшет, але вже при кімнатній температурі (18-25)°С протягом 30 хвилин. Промивають лунки 6 разів розчином для промивання, вносять в них по 100 мкл однокомпонентного розчину хромогену ТМБ і інкубують при температурі (18-25)°С в темному місці протягом 30 хв. Для зупинення кольорової реакції (в тій же послідовності внесення що й ТМБ) вносять в лунки по 100 мкл стоп-реагенту. Не більше як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (450 нм відносно 620 нм). Для обліку результатів розраховують середнє значення ОГ 1 UA 72428 U 5 негативного контролю -НКсер і граничне значення (ГЗ) по формулі: ГЗ = НКсер + 0,2. Результат аналізу вважається негативним, якщо ОГ досліджуваного зразка менше ГЗ. Результат аналізу вважається позитивним, якщо ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ. Для оцінки зміни рівня антитіл в динаміці результат аналізу оцінюється в одиницях DIA Units (DU) за формулою: DU = (ОГсироватки  10): ГЗ Результат кожного аналізу оцінюють наступним чином: >10 DU