Тест-система імуноферментна для якісного та напівкількісного визначення антитіл класів igg та iga до chlamydia trachomatis “dia-chlamydia-igg-iga”

Реферат: Тест-система імуноферментна для якісного та напівкількісного визначення антитіл класу IgG і IgA до С. trachomatis "DIA- Chlamydia-IgG-IgA", в якій на полістироловий планшет сорбовані синтетичні пептиди - аналоги антигенів С. trachomatis. Як кон'югат використовують антитіла проти імуноглобулінів класу ІgG людини. В тест-системі застосовуються: імуносорбент рекомбінантний поліпептид - аналог мембранного білка MOMP-HIS С. trachomatis, два позитивних контролів (1 - інактивована сироватка крові людини, що містить імуноглобуліни класу IgG людини, 2 - інактивована сироватка крові людини, яка містить імуноглобуліни класу IgA людини, специфічні до С. trachomatis), два пероксидазних кон'югатів моноклональних антитіл до імуноглобулінів класу G і А людини, які виявляють за допомогою однокомпонентного розчину проявника, а для оцінки зміни рівня антитіл в динаміці результат аналізу виражають в одиницях DIA Units (DU). UA 72438 U (12) UA 72438 U UA 72438 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології, імунохімії та медицини і може бути використана для якісного та напівкількісного аналізу сироватки або плазми крові людини на наявність антитіл класів IgG та IgA до Chlamydia trachomatis "DIA-Chlamydia-IgG-IgA". Chlamydia trachomatis - грам-негативні облігатні внутріклітинні бактерії з унікальним двофазним циклом розвитку. Внутріклітинна інфекційна форма - елементарні тільця (ЕТ); внутріклітинна форма, здатна до реплікації, - ретикулярні тільця (РТ). Лише ЕТ уражають слизову епітелію та ендотеліальні клітини, викликаючи захворювання урогенітальних шляхів, що призводить до безплідності. У новонароджених проходження через інфіковані родові шляхи може призвести до кон'юнктивіту та пневмонії. За відсутності лікування розвивається інфекційний артрит. Захворювання може перебігати безсимптомно, що ускладнює його діагностику, призводить до хронізації інфекційного процесу та сприяє розповсюдженню інфекції. Специфічні антитіла з'являються в організмі при переході бактерій в реплікативну форму. Інкубаційний період складає 7-21 день. Антитіла класів IgM і IgG до С. trachomatis виявляються через 2-4 тижня після інфікування. Після клінічного одужання кількість специфічних IgG антитіл зменшується, але може зберігатися протягом тривалого часу на низькому рівні. Специфічні IgA антитіла появляються в гострий період захворювання, їх періодична поява в організмі після перенесеного захворювання вказує на хронічну та рецидивуючу інфекцію. Відома тест-система для виявлення антитіл проти С. trachomatis у сироватках і плазмі крові людини при діагностиці хламідійної інфекції [1]. В основі тест-системи лежать синтетичні пептиди антигенів С. trachomatis, використані в складі імуносорбенту, а як кон'югат застосовують козячі анти людські антитіла, зв'язані з пероксидазою. Суть корисної моделі полягає в створенні імуноферментної тест-систем для якісного та напівкількісного аналізу сироватки або плазми крові людини на наявність антитіл класу IgG і IgA до хламідій "DIA-Chlamydia-IgG-IgA". Поставлена задача вирішується шляхом використання імуносорбенту з сорбованим рекомбінантним поліпептидом - аналогом мембранного білка MOMP-HIS С. trachomatis, двох позитивних контролів (1 - інактивована сироватка крові людини, що містить імуноглобуліни класу IgG людини, 2 - інактивована сироватка крові людини, яка містить імуноглобуліни класу IgA людини, специфічні до С trachomatis), двох пероксидазних кон'югатів моноклональних антитіл до імуноглобулінів класів G і А людини, які виявляють за допомогою однокомпонентного розчину проявника хромогену, а для оцінки зміни рівня антитіл в динаміці результат аналізу виражають в одиницях DIA Units (DU). При внесенні в лунки зразків досліджуваних сироваток, у випадку наявності в них специфічних до С trachomatis, антитіла зв'язуються з рекомбінантними антигенами С trachomatis, сорбованими на твердій фазі, утворюючи комплекси антиген-антитіло, які виявляють за допомогою пероксидазних кон'югатів моноклональних антитіл до імуноглобулінів класу IgG або IgA людини. Після відмивання незв'язаних компонентів в лунки додають розчин однокомпонентного проявника. Пероксидазну реакцію зупиняють, додаючи стоп-реагент, і вимірюють оптичну густину суміші у лунках при довжині хвилі 450/620 нм, яка пропорційна концентрації специфічних антитіл до С trachomatis у зразках сироваток або плазми крові. Для оцінки зміни рівня антитіл в динаміці результат аналізу виражають в одиницях DIA Units (DU). Приклад 1. Визначення наявності антитіл до С. trachomatis в сироватці крові хворої С., 1995 року народження. Визначення проводять за відомою методикою [2] твердофазного імуноферментного аналізу. Для цього в дві лунки імуносорбенту, з фіксованими на ньому рекомбінантним поліпептидом аналогом мембранного антигену С. trachomatis, вносять по 80 мкл розчину для розведення сироваток, а потім по 20 мкл досліджуваних сироваток та контролів. Накривають планшет кришкою та інкубують при температурі (37±2)°С протягом 60 хв. Після закінчення інкубації промивають планшет 4 рази розчином для промивання і вносять в 1 лунку з досліджуваним зразком 100 мкл кон'югату - анти-IgG, в другу - 100 мкл кон'югату - анти-IgA. Знову інкубують планшет при температурі (37±2)°С протягом 30 хв. Промивають планшет 6 разів і вносять в лунки по 100 мкл однокомпонентного розчину хромогену ТМБ. Накривають планшет кришкою та інкубують при кімнатній температурі (18-25)°С в темному місці протягом 30 хв. Вносять в лунки по 100 мкл стоп-реагенту для зупинення кольорової реакції (в тій же послідовності внесення що й ТМБ). Не більше як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі (450 нм відносно 620 нм). Для обліку результатів розраховують середнє значення ОГ негативного контролю - НКсер і граничне значення (ГЗ) по формулі: ГЗ=НКсер+0,2. Результат аналізу вважається негативним, якщо ОГ досліджуваного зразка менше ГЗ. Результат аналізу вважається позитивним, якщо ОГ досліджуваного зразка більше ГЗ. 1 UA 72438 U Для оцінки зміни рівня антитіл в динаміці результат аналізу оцінюється в одиницях DIA Units (DU) за формулою: DU=(ОГ сироватки × 10):ГЗ Результат кожного аналізу оцінюють наступним чином: >10DU