Спосіб культивування калусної тканини ломиносу виноградолистого (clematis vitalba l.)

Реферат: UA 74277 U UA 74277 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до галузі біотехнології, а саме до способу культивування калусних тканин ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.), який може бути використаний як сировина для одержання біологічно активних речовин (тритерпенових сапонінів) з перспективою використання їх в фармацевтичній і медичній промисловостях. У біотехнології відомі способи одержання біомаси калусних тканин деяких лікарських рослин - продуцентів БАР терпенової природи: ломиносу, женьшеню, діоскореї, юки, княжика сибірського, гінкго дволопатевого, плюща. Ломиніс є одним з перспективних лікарських рослин для використання його в медичній практиці. У деяких країнах ця рослина є традиційним джерелом лікарських препаратів і широко використовується в народній медицині. В основі високої біологічної активності ломиносу лежить наявність в біомасі сапонінових глікозидів, серед яких зустрічаються аналогічні до багатьох рослин, що широко використовуються в сучасній медицині і фармакології. Використання замість інтактних рослин їх клітинних культур, отриманих біотехнологічними методами, має ряд переваг: зменшення антропогенного впливу на дику природу, можливість одержання біомаси, що не містить полютантів (гербіцидів, пестицидів, важких металів тощо), можливість керування процесом біосинтезу цільових продуктів і т. д. Відомі способи культивування калусних тканин ломиносу шляхом вирощування біомаси на поживному середовищі Мурасіге і Скуга із додаванням 2,4-діхлорфеноксіуксусної кислоти, 6 індоліл-3-оцтової кислоти та 6-бензіламінопуріну [Патент України № 18328, МПК С12N5/04. Спосіб культивування калусної культури ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.) / Чмельова С.І., Бугара О.М., Сідякін А.Л., Юркова І.М. Заявл. - 29.03.2006. - Опубл. - 15.11.2006. - Бюл. № 11], на поживному середовищі Гамборга та Евелега, що містить 2,46 дихлорфеноксіуксусну кислоту та 6-бензиламінопурин [Патент України №24538, МПК С12N 5/04. Спосіб одержання калусної культури ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.) / Чмельова С.І., Бугара О.М., Сідякін А.І., Юркова І.М. Заявл. - 11.12.2006. Опубл. - 10.07.2007. Бюл. № 10], приклади культивування женьшеню японського з аналізом вмісту сапонінів в калусних і суспензійних культурах (Чайко А.Л., Решетняк О.В., Куліченко И.Е. Культура клітин женьшеню японського Panax japoninicus (var. repens): отримання калусних і суспензійний культур, оптимізація росту та аналіз панаксозидів // Біотехнологія, 1999. - № 6. - С. 51-55). Найбільш близьким за технічною суттю є спосіб одержання та культивування калусної тканини ломиносу виноградолистого, що включає виділення експлантів, стерилізацію і культивування їх на поживному середовищі Гамборга та Евелега, модифікованому для ініціації калусоутворення фітогормонами в концентрації 2,4-дихлорфеноксіуксусної кислоти 2,0-2,5 та 6бензіламінопурину 0,3-0,4 мг/л протягом 45-50 діб у темряві, зняття біомаси, збереження 6 частини її для подальшого культивування [Патент України № 24538, МПК С12N5/04. Спосіб одержання калусної культури ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.) / Чмельова С.І., Бугара О.М., Сідякін А.Л., Юркова І.М. Заявл. - 11.12.2006. Опубл. - 10.07.2007. - Бюл. № 10], який вибрано за найближчий аналог. Недоліком вказаної моделі є невеликий ростовий індекс калусу (0,5-1,4 ум. од. маси). В основу корисної моделі поставлено задачу розробки способу культивування калусної тканини ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.), в якому шляхом оптимізації складу живильного середовища було б забезпечено отримання більш високого індексу приросту біомаси. Поставлена задача вирішується таким чином, що в запропонованому способі культивування калусної тканини ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.) одержаний відомими методами калус культивують протягом 70-90 діб у темряві на модифікованому живильному середовищі, що містить (мг/л) KNO3 - 2500, (NH4)2SO4 - 134, СаСl2×2Н2О - 150, MgSO4×7H2O 250, Na2EDTA - 37,3, FeSO4×7H2O - 27,8, MnSO4×4H2O - 13,2, ZnSO4×7H2O - 2,0, H3BO3 - 3,0, CuSO4×5H2O - 0,025, Na2MoO4×2H2O - 0,25, CoCl2×2H2O - 0,025, Kl - 0,75, NaH2PO4 - 225-300, NH4NO3 - 500-750, сахарози - 40000-50000, нікотинової кислоти - 0,5-1,0, тіаміну-НСl - 0,5-1,0, піридоксину-НСl- 0,25-0,5, аскорбінової кислоти - 5,0-10,0, гліцину - 1,0-2,0, 2,4дихлорфеноксіуксусної кислоти - 0,1-0,2 та 6-бензиламінопурину - 0,01-0,02. Приклади конкретного використання: Приклад 1 Готують поживне середовище, що містить (мг/л) KNO 3 - 2500, (NH4)2SO4 - 134, СаСl2×2Н2О 150, MgSO4×7H2O - 250, Na2EDTA - 37,3, FeSO4×7H2O - 27,8, MnSO4×4H2O - 13,2, ZnSO4×7H2O 2,0, H3BO3 - 3,0, CuSO4×5H2O - 0,025, Na2MoO4×2H2O - 0,25, CoCl2×2H2O - 0,025, Kl - 0,75, NaH2PO4 - 225, NH4NO3 - 750, сахарози - 40000, нікотинової кислоти - 1,0, тіаміну-НСl - 1,0, піридоксину-НСl - 0,5, аскорбінової кислоти - 10,0, гліцину - 2,0, 2,4-дихлорфеноксіуксусної кислоти - 0,2 та 6-бензіламінопуріну - 0,02, агару - 7000, розливають в культуральні судини 1 UA 74277 U 5 10 15 20 (склянки В-2-100 ТС ГОСТ 25336-82, В-2-150 ТС ГОСТ 25336-82), по 30-50 мл поживного середовища, закривають металевими ковпачками з алюмінієвої фольги, стерилізують в автоклаві при 121 °C протягом 20-30 хвилин, рН середовища перед автоклавуванням 6,0-6,2. На поверхню застиглого середовища в стерильних умовах висаджують транспланти калусу (калус Clematis vitalba, отриманий відповідно патенту України № 18328). Транспланти культивують на середовищі при 26 ± 1 °C в темряві протягом 70 діб, після чого калус виймають з судин і зважують. Ростовий індекс при цьому дорівнює 4,4-5,2 ум. од. маси. Приклад 2 Готують поживне середовище, що містить (мг/л) КNO 3 - 2500, (NH4)2SO4 - 134, СаСl2×2Н2О 150, MgSO4×7H2O - 250, Na2EDTA - 37,3, FeSO4×7H2O - 27,8, MnSO4×4H2O - 13,2, ZnSO4×7H2O 2,0, H3BO3 - 3,0, CuSO4×5H2O - 0,025, Na2MoO4×2H2O - 0,25, CoCl2×2H2O - 0,025, Kl - 0,75, NaH2PO4 - 300, NH4NO3 - 500, сахарози - 50000, нікотинової кислоти - 0,5, тіаміну-НСl - 0,5, піридоксину-НСl - 0,25, аскорбінової кислоти - 5,0, гліцину - 1,0, 2,4-дихлорфеноксіуксусної кислоти - 0,1 та 6-бензиламінопурину - 0,01, агару - 7000, розливають в культуральні судини (склянки В-2-100 ТС ГОСТ 25336-82, В-2-150 ТС ГОСТ 25336-82), по 30-50 мл поживного середовища, закривають металевими ковпачками з алюмінієвої фольги, стерилізують в автоклаві при 121 °C протягом 20-30 хвилин, рН середовища перед автоклавуванням 6,0-6,2. На поверхню застиглого середовища в стерильних умовах висаджують транспланти калусу (калус Clematis vitalba отриманий відповідно патенту України № 18328). Транспланти культивують на середовищі при 26 ± 1 °C в темряві протягом 90 діб, після чого калус виймають з судин і зважують. Ростовий індекс при цьому дорівнює 5,1-5,9 ум. од. маси. Таким чином, наведені приклади демонструють переваги пропонованого способу, що виражається у збільшенні ростового індексу в 8-10 разів порівняно з вже відомими способами культивування. 25 ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 30 35 Спосіб культивування калусних тканин ломиносу виноградолистого (Clematis vitalba L.), що включає вирощування калусів на модифікованих живильних середовищах, який відрізняється тим, що культивування здійснюють на модифікованому середовищі, яке містить (мг/л): KNO 3 2500, (NH4)2SO4 - 134, СаСl2×2Н2О - 150, MgSO4×7H2O - 250, Na2EDTA - 37,3, FeSO4×7H2O 27,8, MnSO4×4H2O - 13,2, ZnSO4×7H2O - 2,0, H3BO3 - 3,0, CuSO4×5H2O - 0,025, Na2MoO4×2H2O 0,25, CoCl2×2H2O - 0,025, Kl - 0,75, NaH2PO4 - 225-300, NH4NO3 - 500-750, сахарози - 4000050000, нікотинової кислоти - 0,5-1,0, тіаміну-НСl - 0,5-1,0, піридоксину-НСl - 0,25-0,5, аскорбінової кислоти - 5,0-10,0, гліцину - 1,0-2,0, 2,4-дихлорфеноксіуксусної кислоти - 0,1-0,2 та 6-бензидамінопурину - 0,01-0,02, протягом 70-90 діб в темряві. Комп’ютерна верстка В. Мацело Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2