Спосіб проведення реакції нейтралізації для діагностики грипу коней

Реферат: UA 79858 U UA 79858 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі ветеринарної вірусології, зокрема до способів постановки реакції нейтралізації, і може бути використана в роботі діагностичних та наукововиробничих лабораторій ветеринарної медицини. Реакція нейтралізації (РН) ґрунтується на властивості імунної сироватки, що додається до відповідного вірусу, блокувати його здатність до репродукції в чутливій біологічній системі. Здатність імунної сироватки інактивувати інфекційну активність вірусу є наслідком взаємодії нейтралізуючих антитіл з певними антигенними детермінантами поверхневих вірусних білків, що відповідають за адсорбцію вірусу на клітині-хазяїні. Її застосовують, як для ідентифікації виділених вірусів, так і для серологічної діагностики вірусних інфекцій. У загальноприйнятий технологічний процес постановки РН у культурі клітин для серологічної діагностики вірусних інфекцій входить приготування розведень парних сироваток крові з 2- або 4- разовим інтервалом (як правило від 1:10 до 1:640-1:1280). Об'єм кожного розведення сироватки має бути не меншим за 0,4 мл (з розрахунку створення в подальшому нейтралізаційних сумішей 0,4 мл антигену та 0,4 мл сироватки і внесення по 0,2 мл суміші в 4 пробірки) та додавання до різних розведень сироваток крові суспензії вірусу в дозі 100 ТЦД50 у 3 0,1 см , інкубацією отриманих сумішей при температурі 37 °C протягом 1-2 години, внесенням кожної суміші в 4 пробірки з 24-48-годинною моношаровою культурою клітин з попереднім видаленням з них сироватки росту. Культуру клітин інкубують при температурі 37 °C протягом 7 днів. Облік результатів РН проводять щодня протягом 7 діб шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Реакцію вважають позитивною при відсутності цитопатичної дії (ЦПД) вірусу в пробірках з досліджуваною сироваткою, зважаючи на наявність ЦПД у контролях вірусу, відсутність ЦПД в культурі, що інокульована сумішшю вірусу зі специфічною імунною сироваткою і відсутності слідів дегенерації в контролях культури клітин [Руководство по лабораторной диагностике вирусных и реккетсиозных болезней /под. ред. П.Ф. Здроводского и проф. М.И. Соколова. - М.: Медицина, 1965. - 591 с. Посібник з медичної вірусології / За ред. В.М. Гиріна. - К.: Здоров'я, 1995. - 367 с. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник // В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: Агропромиздат, 1991. - 527 с.]. Недоліком цього способу є те, що для свого застосування він потребує значної кількості компонентів реакції, посуду, що перешкоджає цим масовим діагностичним дослідженням. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб, який в десять раз зменшує витрати реагентів, часу, праці та полегшує постановку реакції. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб проведення реакції нейтралізації для діагностики грипу коней, що включає зв'язування вірусу зі специфічними антитілами та ідентифікацією виділеного вірусу з використанням явно позитивної до вірусу грипу коней сироватки, яка зв'язує вірус, що проявляється відсутністю цитопатичної дії в культурі клітин, згідно з корисною моделлю, використовують 96-лункові планшети і автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці, а також робить реакцію більш чутливою та специфічною. Спосіб постановки проведення реакції нейтралізації, здійснюється наступним чином. 3 Для проведення реакції беруть робоче розведення вірусу грипу коней 100 ТЦД 50/0,1 см . Сироватки від хворих та перехворілих коней досліджують парні або одноразово відібрані. Паралельно для контролю, нормальну сироватку крові коня або кроля. Сироватки в розведенні 1:10 перед дослідженням прогрівають у водяній бані протягом 30 хвилин при температурі +56 °C для інактивації неспецифічних термолабільних інгібіторів. Для приготування дослідних проб у лунки планшета вносять по 0,1 см живильного 3 середовища з антибіотиками. В перший ряд лунок додають по 0,1 см сироватки в розведенні 3 1:10. Після перемішування піпетуванням 0,1 см суміші переносять у наступний ряд лунок. Таким чином отримували розведення сироваток від титру 1:20 до 1:2560. 3 У кожну лунку вносять по 0,1 см вірусу грипу коней та інкубують суміші при температурі +37 °C протягом 2-ох годин. Одночасно ставлять контролі: 1. Контроль культури клітин: у 4 лунки вносять тільки живильне середовище, для виявлення неспецифічної дегенерації клітин. 2. Контроль токсичності сироватки: у 4 лунки вносять сироватку в найменшому розведенні, яке використовували в реакції. 3. Контроль специфічності вірусу: - робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями специфічної сироватки інактивованої при +56 °C в розведенні 1:10, 1 UA 79858 U 5 10 15 20 25 30 - робоче розведення вірусу змішують з дворазовими розведеннями нормальної сироватки; інактивованої при +56 °C в розведенні 1:10. 4. Контроль робочого розведення вірусу: з робочого розведення вірусу готують 4 ряди 3 десятиразових розведень, так щоб у лунках було по 100, 10, 1,0 бляшок вірусу в об'ємі 0,2 см . Потім суміші переносять в планшет із сформованим моношаром клітин, з якого попередньо видалили ростове середовище, та поміщають в термостат в пристрої для культивації клітин [Патент України № 67895, МПК G01N33/00, 28.07.2011; Опубл. 12.03.2012; Бюл. № 5.]. Облік результатів реакції нейтралізації з контролями проводять щодня протягом 7 діб шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Реакцію вважають позитивною при відсутності ЦПД в лунках з досліджуваною сироваткою, зважаючи на наявність ЦПД у контролях вірусу, відсутність ЦПД в культурі, що інокульована сумішшю вірусу зі специфічною імунною сироваткою і відсутності слідів дегенерації в контролях культури клітин. Титр сироваток розраховують за Рідом і Менчем. Діагностичним титром проти 100 ТЦД 50/0,1 3 см вірусу вважають розведення сироватки 1:80 і більше. Якщо сироватка нейтралізує вірус не менш як у 50 % заражених культур клітин у лунках, то можна ставити позитивний діагноз на грип коней. Експериментальні дослідження проведені, в лабораторії Інституту сільського господарства Західного Полісся НААН, показали, що розроблений спосіб для діагностики грипу коней є високочутливим та специфічним, а сам спосіб постановки не трудомісткий. Користуючись цим способом, можна проводити масові діагностичні обстеження із значною економією антигену та контрольних сироваток. Запропонований спосіб знайде застосування у вірусологічних лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб проведення реакції нейтралізації для діагностики грипу коней, що включає зв'язування вірусу зі специфічними антитілами та ідентифікацією виділеного вірусу з використанням явно позитивної до вірусу грипу коней сироватки, яка зв'язує вірус, що проявляється відсутністю цитопатичної дії в культурі клітин, який відрізняється тим, що використовують 96-лункові планшети і автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці, а також робить реакцію більш чутливою і специфічною. Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2