Спосіб одержання церулоплазміну

1. Спосіб одержання церулоплазміну, що включає розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з ДЕАЕ функціональною групою, елюцію та наступне очищення, який відрізняється тим, що як іонообмінник з ДЕАЕ функціональною групою використовують сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з прищепленою групою ДЕАЕ, що має зерна фракції 200-250мкм з розміром пор 30нм і сорбцію проводять за допомогою колонкової хроматографії у "киплячому шарі", а при очищенні фермент у вигляді розчину спочатку обробляють сольвент-детергентною сумішшю у вигляді 0,1М ацетатного буферного розчину при pH 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80, з наступним розбавленням 0,1М ацетатним буферним розчином при pH 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л, потім оброблений фермент іммобілізують на сульфопропілкатіонному сорбенті, що має зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм, і здійснюють двостадійне промивання, причому, на першій стадії використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при pH 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію та поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л, а на другій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при pH 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обробку сольвент-детергентною сумішшю ведуть шляхом перемішування суміші протягом 6-9 годин. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на першій стадії промивання використовують об'єм, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту, а на другій стадії промивання використовують об'єм, що відповідає трьом об'ємам сорбенту, і на першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 4,55см/хв. UA (21) a200701572 (22) 14.02.2007 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) КУРИЩУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, СКРИННИК МАКСИМ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ДІДЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, UA, С АМОЙЛЕНКО ВАДИМ АН АТОЛІЙОВИЧ, U A, КУРКІНА ОКСАН А ВІКТОРІВН А, U A (73) КУРИЩУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, СКРИННИК МАКСИМ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ДІДЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, U A (56) RU C1 2087150, 20.08.1997. Edwards CA et al.: “Tri(n-butil)phosphate/detergent treatment of licensed therapeutic and experimental blood derivatives” Vox Sang. 1987; 52(1-2):53-9. ABSTR ACT. Roberts P. “Resistance of vaccinia virus to inactivation by solvent/detergent treatment of blood products”. Biologacals. 2000 Mar;28(1):29-32. ABSTR ACT. Horowits et al.:”Solvent/detergent-treated plasma:a virus-inactivated substitute for fresh frozen plasma”. Blood/ - 1992. Feb; Volume: 79 (Issue: 3), page 82631. Internet. On-line. Kouoh Elombo F et al.:”Purification of human ceruloplasmin as a by-product of C1-inhibitor”. Biol. Pharm. Bull. 2000 Dec; Volume: 23 (Issue: 12), page 1406-9. ABSTR ACT. Hellstern P.:”Manufacture and in vitro characterization of a solvent/detergent-treated human plasma”, Vox Sang. 1992; 63(3):178-85. ABSTR ACT. RU C1 2162338, 27.01.2001. UA A 61200, 15.11.2003. RU C2 2225725, 20.03.2004. UA A 17145, 31.10.1997. UA C1 2019, 20.12.1994. US B1 6686191, 03.02.2004. RU C2 2197500, 27.01.2003. Курищук К.В. та інш. Хроматографічна очистка імуноглобулінів G як один з етапів сольвент/детергентної інактивації вірусів у те хнологічній схемі виробництва білкових препаратів плаз 2 (19) 1 3 85735 Винахід відноситься до медицини, а саме до одержання донорського ферменту церулоплазміну, що є мідьвмісним глобулярним білком плазми крові ссавців, і може бути використаний при виробництві ферментних лікарських препаратів з плазми крові. При виробництві лікарської форми церулоплазміну перевага віддається технологіям, що здатні забезпечити ефективну очистку білка при мінімальній кількості стадій, забезпечити автоматизацію та контроль виробничого процесу. Істотною проблемою, що існує при отримані лікарських препаратів з біологічного матеріалу, є небезпека контамінації вірусами. Відомі методи інактивації вірусів, зокрема, теплова обробка, не прийнятні до такої біологічної сировини як глобулярні білки плазми крові, оскільки приводить до їх р уйн ування і втрати ферментної активності. Відомі способи одержання церулоплазміну, в яких як сировину використовують осади донорської крові фракції IV та осаду Б, передбачають виділення ферменту на слабкому аніонообміннику з функціональною групою на основі третинної амонієвої основи диетиламіноетану (ДЕАЕ), привитою до різноманітних носіїв. До таких, зокрема, відносяться способи, розкриті у патентах Російської Федерації №2087150 (опубліковано 20.08.1997, кл. А61К 35/16) [1], та №2162338 (опубліковано 27.01.2001, кл. А61К 38/48, А61К 35/16) [2], а також у патентах України №2019 (опубліковано 20.12.1994, кл. А61К 38/48) [3], №17145 (опубліковано 31.10.1997, кл. А61К 35/16) [4], №61200 (опубліковано 17.11.2003, кл. А61К 35/16) [5]. Ця стадія технології дозволяє на кілька порядків очистити цільовий білок при одночасному його концентруванні. Отриманий розчин містить велику кількість нерозчинних зважених механічних включень білкової і ліпідної природи, які незначною мірою видаляються під час довготривалих та те хнологічно складних стадій очистки методами центрифугування чи фільтрації. Найбільш близьким є спосіб одержання церулоплазміну, що включає розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з ДЕАЕ функціональною групою, елюцію та наступне очищення,[1], в якому отриманий після хроматографії елюат з концентрацією білка 0,5...2,0% піддають відстоюванню протягом 6...12 годин при рН 5,1...5,4 і іонній силі 0,01...0,04, центрифугують та концентрують ультрафільтрацією. Сорбцію на іонообміннику, де як такий використовують ДЕАЕ-се фадекс А-50, проводять в 0,05 М ацетатному буферному розчині при рН 5,5 протягом 5...7 годин. Після відстоювання промивання проводять 0,05 М ацетатним буферним розчином при рН 5,5...7,0, що містить 0,07М хлористого натрію Недоліком відомого способу є вірусонебезпечність цільового продукту, оскільки спосіб не забезпечує ефективного вилучення вірусів при очистці. Так, титр цільового продукту, до якого перед очисткою було внесено 4,5 log10 ТЦІД50 /см 3 модельного вірусу вір усної діареї BVD V, становить після очистки >3,5 log10 ТЦІД50/см 3. Крім того, часткова денатурація білка, що відбувається під час центрифу 4 гування, приводить до зниження виходу цільового продукту. Задачею винаходу є удосконалення способу одержання церулоплазміну, в якому за рахунок запропонованої комплексної обробки і умов її проведення підвищується ефективність вилучення та інактивації вірусів при очистці, що гарантує вірусну безпечність отриманого церулоплазміну. Крім того, запропонований спосіб є більш технологічним і дозволяє знизити денатурацію білка, що приводить до підвищення виходу цільового продукту. Поставлена задача вирішується запропонованим способом одержання церулоплазміну, що включає розчинення вихідної сировини в ацетатному буферному розчині, сорбцію ферменту на іонообміннику з функціональною групою ДЕАЕ, елюцію та наступне очищення, в якому як іонообмінник з ДЕАЕ функціональною групою використовують сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з привитою групою ДЕАЕ, а при очищенні фермент у вигляді розчину спочатку обробляють сольвент-детергентною сумішшю, потім оброблений фермент іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають ацетатним буфером, що містить хлорид натрію, і проводять елюцію очищеного ферменту. Сорбція ферменту на сорбенті з жорсткою стиролдивінілбензольною матрицею з привитою групою ДЕАЕ, що має зерна фракції 200-250мкм і розмір пор 30нм, проводиться за допомогою колоночної хроматографії у «киплячому шарі», що не дозволяє нерозчиненому матеріалу накопичуватися в хроматографічній колоні. Зважений стан сорбенту забезпечується організацією потоку знизу вгору та великим розміром зерна. Іммобілізація ферменту і наступна промивка на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм, також проводиться за допомогою колоночної хроматографії. Даний сорбент дозволяє іммобілізувати не менше 25мг/см 3 цільового ферменту, не створює високого тиску, практично не зсідається при використанні. Краще, сольвент-детергентна суміш для обробки ферменту складається з 0,1М ацетатного буферного розчину при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Обробку ведуть шляхом перемішування сольвентдетергентної суміші з розчином ферменту в реакторі протягом 6...9 годин з наступним розбавленням 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений фермент, іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті, промивають у дві стадії, де на першій стадії використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію та пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Для промивки на першій стадії використовують об'єм, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту. На др угій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію, в об'ємі, що відповідає трьом об' 5 85735 ємам сорбенту. На першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 4,5...5см/хв. Елюція очищеного ферменту здійснюється 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5.8. що містить 0,3М хлориду натрію. Експериментально було встановлено, що попереднє виділення ферменту з ви хідної сировини методом колоночної хроматографії за допомогою сорбенту з привитими до стиролдивінілбензольної матриці групами ДЕАДЕ, обробка розчину ферменту сольвент-детергентною сумішшю з наступною його іммобілізацією і промивкою на сульфопропілкатіонітному сорбенті - дозволили максимально і без руйнації виділити фермент, очистити його від домішок, ефективно видалити віруси при їх наявності, і концентрувати церулоплазмін для лікарської форми. Важливо, що лікарську форму церулоплазміну одержують без проведення таких нетехнологічних стадій як центифугування та ліофілізація. Всі процеси, що проводяться при колоночній хроматографії, легко автоматизуються і контролюються. Таким чином, запропонований спосіб гарантує вірусобезпечність одержаного лікарського препарату церулоплазмін та дозволяє підвищити вихід цільового церулоплазміну. Спосіб здійснюється таким чином. Фракції крові IV-I та осаду Б, що містять церулоплазмін, зміщують з ацетатним буферним розчином у ємності з мішалкою при 0...5°С і перемішують протягом 3...5 годин. Розчин фільтрують через капронове сито. Осад утилізують. Фільтрат за допомогою насосу пропускають знизу вгору через хроматографічну колону, що як іонообмінник містить сорбент на жорсткій стиролдивінілбензольній матриці з привитою групою ДЕАЕ з зернами фракції 200-250мкм і розміром пор 30нм, який знаходиться у зваженому стані. Елюат збирають у ємність. Елюат розбавляють 3...5 об'ємами ацетатного буферного розчину і обробляють сольвентдетергентною сумішшю. Як сольвент використовують, наприклад, три-н-бутилфосфат, як детергент - полісорбат 80, октоксинол 10, bпропіолактон та інші поверхнево активні речовини. Змішування проводять в реакторі. Наприклад, 0, М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфа ту і 1% мас. полісорбату 80, змішують з розчином ферменту. Суміш перемішують протягом 6...9 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений фермент іммобілізують колоночною хроматографією при лінійній швидкості елюенту 2см/хв. на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25...30мг/см 3 і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм. Іммобілізований фермент промивають на сульфопропілкатіонітному сорбенті зі швидкістю 4,5...5см/хв протягом 80-120 хвилин. Таке промивання краще здійснювати у дві стадії: на першій стадії 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л; на др угій 6 - 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5.8, що містить 0,05М хлориду натрію. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту на першій стадії, і об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту на другій стадії. Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Процес елюції триває 50...80хв. Елюат містить очищений церулоплазмін, який збирають до стерильної скляної тари і подають на ультрафільтрацію. Нижче наведені приклади, що демонструють спосіб одержання церулоплазміну, але не обмежують його. Приклад 1 30кг осаду IV змішували з 500л ацетатного буферного розчину у ємності з мішалкою при температурі 0°С і перемішували протягом 3 годин. Розчин фільтрували через капронове сито. Осад утилізували. Одержали 520л фільтрату, який за допомогою насосу пропускають знизу вгору через хроматографічну колону, діаметром 400мм, що містить 20дм 3 сорбенту з привитою групою ДЕАЕ на стиролдивінілбензольній матриці фракції 200250мкм і розміром пор 30нм. Об'ємна швидкість елюенту - 100л/год. Через приблизно 5 годин у ємності зібрали 30л елюату, що містить церулоплазмін. Для перевірки ефективності вилучення вірусів при реалізації запропонованого способу використовували модельні віруси вірусної діареї ВРХ (BVD V), які були внесені до розбавленого після елюції розчину ферменту у кількості 4,5 log10 ТЦІД50/см 3 вірусу BVD V. Згідно до вимог GMP навмисне внесення будь-якого вірусу у виробничі приміщення не допускається. Тому валідація проводилась у окремій лабораторії, обладнаній відповідним чином, з використанням моделі виробничого процесу. Розбавлений розчин ферменту переносили до реактору, де обробляли сольвент-детергентною сумішшю. Як сольвент-детергентну суміш використовували 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують протягом 7 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляли 5-ма об'ємами 0,1М ацетатного буферного розчину при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Оброблений фермент колоночною хроматографією (діаметр колонки 14см) при лінійній швидкості елюенту 2см/хв іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25мг/см 3 і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм. Одержаний розчин утилізували. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті фермент промивали зі швидкістю 5см/хв протягом 90 хвилин у дві стадії: на першій стадії 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л; на другій 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. 7 85735 Елюцію здійснювали 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Процес елюції тривав 60хв. Елюат збирали до стерильної скляної тари, піддавали ультрафільтрації з наступною стерелізуючою фільтрацією. Одержали 20л розчину церулоплазміну, що має вміст білку 30г з питомою біологічною активністю 30ум. од./мг. Вихід цільового продукту - 99%, співвідношення Е610/Е 280-0,045, концентрація білку - 30мг/мл. Титр після інактивації показав відсутність вірусу BVD V. Приклад 2 30г фракції IV-I змішували з 450мл ацетатного буферного розчину у ємності з мішалкою при температурі 3°С і перемішували протягом 5 годин. Розчин фільтрували через капронове сито. Осад утилізували. Одержали 420мл фільтрату, який за допомогою насосу пропускають знизу вгору через хроматографічну колону, діаметром 45мм, що містить 200см 3 сорбенту з привитою групою ДЕАЕ на стиролдивінілбензольній матриці фракції 200250мкм і розміром пор 30нм. Об'ємна швидкість елюенту - 1,5мл/хв. Через 5 годин у ємності зібрали 300мл елюату, що містить церулоплазмін, який перенесли до реактору з мішалкою і перемішували протягом 5 годин. Для перевірки ефективності вилучення вірусів при реалізації запропонованого способу використовували модельні віруси псевдосказу (PRV), які були внесені до розбавленого після елюції розчину ферменту у кількості ³5,12 log10 ТЦІД50/см 3 вірусу PRV. Валідація проводилась у окремій лабораторії, обладнаній відповідним чином, з використанням моделі виробничого процесу. Розбавлений розчин ферменту з модельним вірусом переносили до ємності, де обробляли сольвент-детергентною сумішшю. Як сольвентдетергентну суміш використовували 0,1М ацетат Комп’ютерна в ерстка В. Клюкін 8 ний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфа ту і 1% мас. полісорбату 80. Суміш перемішують протягом 9 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляли 5-ма об'ємами 0,1М ацетатного буферного розчину при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у концентрації 0,2г/л. Оброблений фермент колоночною хроматографією (діаметр колонки 15мм) при лінійній швидкості елюенту 2см/хв іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25мг/см 3 і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм. Одержаний розчин утилізували. Іммобілізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті фермент промивали зі швидкістю 5см/хв протягом у дві стадії: на першій стадії 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05 М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л; на другій - 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Елюцію здійснювали 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Через 7 годин отримали елюат, який піддавали ультрафільтрації з наступною стерелізуючою фільтрацією. Одержали 12мл розчину церулоплазміну, що має вміст білку 470мг з питомою біологічною активністю 30ум. од./мг. Вихід цільового продукту - 98%, співвідношення Е610/Е 280-0,044, концентрація білку - 39мг/мл. Титр після інактивації показав відсутність вірусу PR V. Таким чином, запропонований спосіб гарантує вірусобезпечність одержаного лікарського препарату церулоплазмін та дозволяє підвищити вихід цільового церулоплазміну. З технології вилучено всі стадії центрифугування. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601