Спосіб інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну

1. Спосіб інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, що включає очистку хроматографією розчину ферменту шляхом промивання ацетатним буферним розчином з наступною елюцією, який відрізняється тим, що розчин ферменту попередньо обробляють сольвент-детергентною сумішшю у вигляді 0,1М ацетатного буферного розчину при pH 5,8, що містить 1% мас. три-нбутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80 з наступним розбавленням 0,1М ацетатним буферним розчином при pH 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л і здійснюють двостадійне промивання обробленого ферменту, іммобілізованого на сульфопропілкатіонному сорбенті з розміром зерен фракції 100-200мкм, діаметром пор 30нм і сорбційною ємністю 25...30мг/см 3, причому, на першій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при pH 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05 М хлориду натрію і поліпропіленгліколь у кількості 0,2г/л, на другій стадії використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при pH 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що обробку сольвент-детергентною сумішшю ведуть шляхом перемішування суміші протягом 6...9 годин. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на першій стадії промивання ведуть об'ємом, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на другій стадії промивання ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що на першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 4,5...5см/хв. 6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при pH 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. UA (21) a200701570 (22) 14.02.2007 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) КУРИЩУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, СКРИННИК МАКСИМ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ДІДЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, UA, С АМОЙЛЕНКО ВАДИМ АН АТОЛІЙОВИЧ, U A, КУРКІНА ОКСАН А ВІКТОРІВН А, U A (73) КУРИЩУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, UA, СКРИННИК МАКСИМ МИ ХАЙЛОВИЧ, UA, ДІДЕНКО НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, U A (56) RU C1 2087150, 20.08.1997. Edwards CA et al.: “Tri(n-butil)phosphate/detergent treatment of licensed therapeutic and experimental blood derivatives” Vox Sang. 1987; 52(1-2):53-9. ABSTR ACT. Roberts P. “Resistance of vaccinia virus to inactivation by solvent/detergent treatment of blood products”. Biologacals. 2000 Mar;28(1):29-32. ABSTR ACT. Horowits et al.:”Solvent/detergent-treated plasma:a virus-inactivated substitute for fresh frozen plasma”. Blood/ - 1992. Feb; Volume: 79 (Issue: 3), page 82631. ABSTR ACT. Kouoh Elombo F et al.:”Purification of human ceruloplasmin as a by-product of C1-inhibitor”. Biol. Pharm. Bull. 2000 Dec; Volume: 23 (Issue: 12), page 1406-9. ABSTR ACT. Hellstern P.:”Manufacture and in vitro characterization of a solvent/detergent-treated human plasma” , Vox Sang. 1992; 63(3):178-85. ABSTR ACT. RU C1 2162338, 27.01.2001. UA A 61200, 15.11.2003. RU C2 2225725, 20.03.2004. UA A 17145, 31.10.1997. UA C1 2019, 20.12.1994. US B1 6686191, 03.02.2004. RU C2 2197500, 27.01.2003. Курищук К.В. та інш. Хроматографічна очистка імуноглобулінів G як один з етапів сольвент/детергентної інактивації вірусів у те хнологічній схемі виробництва білкових препаратів плазми”, Укр. журнал гематології та трансфузіології. №5(6). – 2006. – стр. 29-33. Курищук К.В. та інш. Оцінка ефективності сольвент/детергентної інактивації вірусів, впровадже 2 (19) 1 3 85733 Винахід відноситься до медицини, а саме до інактивації вірусів у виробництві донорського ферменту церулоплазміну, що є мідьвмісним глобулярним білком плазми крові ссавців, і може бути використаний при виробництві ферментних лікарських препаратів з плазми крові. Істотною проблемою, що існує при використанні лікарських препаратів, отриманих з біологічного матеріалу, є небезпека контамінації вірусами. Відомі методи інактивації вірусів, зокрема, теплова обробка, не прийнятні до такої біологічної сировини як глобулярні білки плазми крові, оскільки приводить до їх руйнування і втрати ферментної активності. Найбільш близьким є спосіб інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, що включає очистку хроматографією розчину ферменту - виділеного з вихідної сировини церулоплазміну, шляхом промивання ацетатним буферним розчином і елюції [RU, патент №2087150, кл. А61К 35/16, опубл. 20.08.1997]. Для промивання використовують 0,05М ацетатний буферний розчин при рН 5,5-7,0 що містить 0,07М хлористого натрію. Недоліком відомого способу є низький рівень вилучення вірусів при одержанні церулоплазміну, що залишає його вірусонебезпечним. Титр після інактивації напівфабрикату церулоплазміну, до якого було внесено 6,3 log10 ТЦІД50/см 3 модельного вірусу вірусної діареї BVD V, становить 4,5 log10 ТЦІД50/см 3. Задачею винаходу є удосконалення способу інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, в якому за рахунок запропонованої обробки і умов її проведення підвищується вірусн у безпечність церулоплазміну за рахунок ефективного вилучення та інактивації вірусів. Поставлена задача вирішується запропонованим способом інактивації вірусів при одержанні церулоплазміну, що включає очистку хроматографією розчину ферменту шляхом промивання ацетатним буферним розчином і елюції, в якому розчин ферменту попередньо обробляють сольвентдетергентною сумішшю і здійснюють двостадійне промивання попередньо обробленого ферменту, іммобілізованого на сульфопропілкатіонітному сорбенті, причому, на першій стадії використовують ацетатний буферний розчин, що містить каприлат натрію, хлорид натрію і пропіленгліколь, на другій стадії використовують ацетатний буферний розчин, що містить хлорид натрію. Як сольвент - детергентну суміш використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80, яку змішують з розчином ферменту. С уміш ферменту з сольвент - детергентною сумішшю перемішують протягом 6...9 годин з наступним розбавленням 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Сульфопропілкатіонітний сорбент, на якому іммобілізують оброблений фермент, має сорбцій 4 ну ємність 25-30мг/см 3 і зерна, фракції 100200мкм. Краще, на першій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 7-ми об'ємам сорбенту. На другій стадії промивання використовують 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Промивання ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сорбенту. На першій і другій стадіях промивання ведуть зі швидкістю 4,5-5см/хв. Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду натрію. Експериментально було встановлено, що попередня сольвент – детергент на обробка розчину ферменту, з наступною його іммобілізацією на сульфопропілкатіонітному сорбенті і промивкою певним ацетатним буферним розчином, приводять до підвищення ефективності вилучення та інактивації вірусів, що забезпечує вірусн у безпечність препарату церулоплазміну. Спосіб здійснюється таким чином. Розчин ферменту, отриманий з вихідної сировини шляхом розчинення фракцій IV та осаду Б фракціонуванням плазми крові за методом Кона, або отриманий після хроматографічної очистки, обробляють сольвент - детергентною сумішшю. Ця стадія технологічного процесу включає експозицію ферменту розчином, що містить сольвент і детергент. Як сольвент використовують три-нбутилфосфат, як детергент - полісорбат 80, октоксинол 10, b- пропіоллактон та інші поверхнево активні речовини. Змішування проводять в реакторі. Наприклад, 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. три-н - бутилфосфату і 1% мас. полісорбату 80, змішують з розчином ферменту. С уміш перемішують протягом 6...9 годин при температурі 25°С. Далі суміш розбавляють 0,1М ацетатним буферним розчином при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. Оброблений таким чином фермент колоночною хроматографією при лінійній швидкості елюенту 2см/хв іммобілізують на сульфопропілкатіонітному сорбенті, що має сорбційну ємність 25...30мг/см 3 і зерна фракції 100-200мкм з діаметром пор 30нм.. Сорбцію проводять 6...8 годин. Після завершення сорбції здійснюють двостадійне промивання попередньо обробленого ферменту, іммобілізованого на сульфопропілкатіонітному сорбенті, зі швидкістю 4,5..5см/хв. Процес промивання займає 80...120хв. На першій стадії промивання використовують ацетатний буферний розчин, що містить каприлат натрію, хлорид натрію і пропіленгліколь, Краще, на першій стадії промивання використовувати за складом той самий розчин, що і для розбавлення суміші: 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату натрію, 0,05М 5 85733 6 хлориду натрію і пропіленгліколь у кількості 0,2г/л. хроматографії, вносили 7,33 log10 ТЦІД50 /см 3 Промивання ведуть об'ємом, що відповідає 7-ми вірусу PR V. об'ємам сорбенту. До ємності, що містить 32мл 1%-ного розчину На другій стадії промивання використовують виділеного з вихідної сировини ферменту з віруацетатний буферний розчин, що містить хлорид сом PRV додають 32мл сольвент- детергентної натрію: 0,1М ацетатний буферний розчин при рН суміші: 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію. Промивання 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% ведуть об'ємом, що відповідає трьом об'ємам сормас. полісорбату 80. С уміш перемішують при тембенту. пературі 25°С протягом 7 годин при швидкості Елюцію здійснюють 0,1М ацетатним буферним обертання мішалки 80об./хв. Далі до ректору порозчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду дають 64мл розчину, що містить: 0,1 М ацетатного натрію. Процес елюції триває 50...80хв. Елюат буферного розчину при рН 5,8, 1% мас. каприлату містить очищений церулоплазмін, який збирають натрію, 0,05М хлориду натрію і 0,2г/л пропіленглідо стерильної скляної тари і подають на ультрафіколю. Оброблений таким чином фермент пропусльтрацію. кають через попередньо урівноважену хроматогНижче наведені приклади, що демонструють рафічну колону діаметром 14мм, що містить 7мл ефективність способу інактивації вірусів при одерсульфопропілкатіонітного сорбенту, при об'ємній жанні церулоплазміну, але не обмежує його. швидкості потоку 3мл/хв (лінійна швидкість елюенПриклад 1 ту - 2см/хв). Сорбцію проводять 40 хвилин. ІммоДля демонстрації ефективності вилучення та білізований на сульфопропілкатіонітному сорбенті інактивації вірусів запропонованим способом випопередньо оброблений фермент піддають двокористовували модельні віруси вірусної діареї ВРХ стадійному промиванню. Для цього через колонну (BVD V). В 1%-ний розчин виділеного з вихідної пропускають 50мл 0,1М ацетатного буферного сировини ферменту (напівфабрикату церулоплазрозчину при рН 5,8, що містить 1% мас. каприлату міну) вносили 6,45 log10 ТЦІД50/см 3 вірусу BVD V. натрію, 0,05М хлориду натрію і 0,2г/л пропіленгліДо ємності, що містить 32мл 1%-ного розчину колю. Розчин пропускають при об'ємній швидкості виділеного з вихідної сировини ферменту з віру5мл/хв, протягом 10 хвилин. Потім промивають сом BVDV додають 32мл сольвент - детергентної 20мл 0,1М ацетатним буферним розчином при рН суміші: 0,1М ацетатний буферний розчин при рН 5,8, що містить 0,05М хлориду натрію, при об'ємній 5,8, що містить 1% мас. три-н-бутилфосфату і 1% швидкості 7,5мл/хв (відповідає лінійній швидкості мас. полісорбату 80. С уміш перемішують при тем5см/хв), протягом 3 хвилини. пературі 25°С протягом 7 годин при швидкості Елюцію здійснювали 0,1М ацетатним буферобертання мішалки 80об./хв. Далі до ректору поним розчином при рН 5,8, що містить 0,3М хлориду дають 64мл розчину, що містить: 0,1 М ацетатного натрію, при швидкості потоку 3мл/хв. Процес елюбуферного розчину при рН 5,8, 1% мас. каприлату ції тривав 10 хвилин. Елюат у кількості 13мл зінатрію, 0,05М хлориду натрію і 0,2г/л пропіленглібрали у стерильний скляний посуд. колю. Оброблений таким чином фермент пропусТитр інфекційності після інактивації становив кають через попередньо урівноважену хроматог