Кровозамінник із функцією переносу кисню, фармацевтична композиція (варіанти)

1. Кровозамінник із функцією переносу кисню, основу якого становить полімеризований глутаровим альдегідом гемоглобін, отриманий із крові тварин, який відрізняється тим, що він являє собою суху субстанцію й містить не менш 90 % полімеризованого гемоглобіну з молекулярною масою C2 2 (11) 1 3 привести до небажаних наслідків. Відомий кровозамінник «Геленпол» [RU 2132687, А61К35/18, А61К38/42, 1999], який уявляє собою суміш тетрамеру гемоглобіну й олігомерів з різною довжиною ланцюга. Олігомери отримані шляхом зшивання тетрамерів гемоглобіну глутаровим альдегідом і модифіковані глутаміновою кислотою. Недоліком препарату «Геленпол» є те, що для його готування необхідна еритроцитарна маса зі строком зберігання не більше 36 діб, а це може негативно позначитися на запасах донорської крові. До недоліків так само відноситься те, що в кровозаміннику перебуває досить великий відсоток тетрамеру гемоглобіну, що у крові дисоціює на дімери, зумовлюючі нефротосксичний ефект. Тетрамер також викликає вазоконстрикторну дію, зв'язуючи оксид азоту, крім того, тетрамер швидко елімінується із кров'яного русла, не встигаючи виконати газотранспортну функцію. Відомий кровозамінник по патенту RU 2203087, отриманий з донорської крові. Кровозамінник уявляє собою водяний розчин піридоксильованого, полімеризованого гемоглобіну, що містить приблизно 16% полімеру гемоглобіну з молекулярною масою приблизно 128, приблизно 26% полімеру гемоглобіну з молекулярною масою приблизно 192 і приблизно 58% полімеру гемоглобіну з молекулярною масою приблизно 256. Даний кровозамінник одержують із використанням окису вуглецю, що здорожує й подовжує процес, крім того, у кінцевому продукті залишається домішка токсичного карбоксигемоглобіну (до 1.5%). Описана технологія за твердженням авторів, дозволяє застосовувати кров інших ссавців. Відомий кровозамінник фірми Biopure на основі гемоглобіну, отриманий, у тому числі, з еритроцитів крові великої рогатої худоби [патенти US 5,084,558 (1992) і US 6,506,725 (2003)]. Даний кровозамінник має наступні параметри: розподіл молекулярної маси полігемоглобіну в діапазоні 68 000 - 500 000 дальтон більше 90%, причому, вміст полігемоглобіну більше 50% вміст метгемоглобіну менш 20%, вміст ендотоксину менш 0.02 ед/мл. До недоліків даного кровозамінника можна віднести високий вміст тетрамеру й метгемоглобіну. Високий вміст тетраметру обумовлює нефротоксичний ефект, а метгемоглобін є токсичним. Крім того, кровозамінник виготовлений на дегазованому розчині й тому при його введенні в організм в умовах геморрагичного шоку, він може приєднувати розчинений у крові кисень, викликаючи додаткову гіпоксію. Препарат фірми Biopure представляє собою готовий для вживання продукт із фіксованою концентрацією гемоглобіну в певному середовищі (модифікований лактирований розчин Рингер-Локка). У зв'язку із цим, можливості зміни концентрації гемоглобіну в розчині обмежені, а зміна состава розчинника не можлива. Тим часом, не виключені ситуації, при яких застосування даного розчинника не бажане й оптимальне для введення може виявитися плазмозамінник із іншими властивостями й з іншим вмістом гемоглобі 96390 4 ну. Задачею винаходу є створення кровозамінника, позбавленого зазначених недоліків. Для рішення поставленої задачі пропонується кровозамінник із функцією переносу кисню, основу якого становить полімеризований глутаровим альдегідом гемоглобін, отриманий із крові тварин. Відмінною рисою пропонованого кровозамінника є те, що розподіл молекулярної маси полігемоглобіну 90% у діапазоні 192 000 - 320 000 Да, вміст метгемоглобіну не більше 5%. Кровозамінник пропонується виконати у вигляді сухої субстанції, наприклад, у вигляді порошку або гранул з вологістю не більше 7%. Пропонований кровозамінник може додатково містити глюкозу й/або аскорбінову кислоту. Те, що розподіл молекулярної маси 90% полігемоглобіну в діапазоні 192 000 - 320 000 Да, а вміст метгемоглобіну не більше 5%, дозволяє підвищити якість кровозамінника за рахунок виключення небажаних побічних ефектів. Відомо, що полімеризований гемоглобін має менший кооперативний ефект, чим нативний гемоглобін, що приводить до зниження коефіцієнта Хилла [Preparation and in vitro characteristics of polimerized pyridoxylated hemoglobin, L.R.Sehgal, oth., TRANSFUSION, Vol. 23, No. 2-1983, p. 158-162]. Зазначений ефект можливо обумовлений стеричними утрудненнями для доступу кисню до гему. Розподіл молекулярної маси в зазначеному діапазоні дозволяє наблизити газотранспортні властивості кровозамінника, що заявляють, до натівного гемоглобіну за рахунок більшої доступності гема для кисню. Введення глюкози дозволяє використати ліофільне сушіння для одержання сухого продукту, а аскорбінова кислота збільшує строк зберігання препарату. Виконання кровозамінника у вигляді сухої субстанції дозволяє підвищити строки зберігання продукту, а також підсилює протишоковий ефект препарату й, крім того, дозволяє розширити набір специфічних терапевтичних впливів за рахунок можливості розчинити його в одному із прикладених до препарату плазмозамінюючих розчинів. Вибір розчину визначається причиною, яка привела до необхідності переливати кровозамінник, станом хворого й характером передбачуваної терапії (лікувального процесу). Таким чином, досягається технічний результат. Кровозамінник одержують осмотичним гемолізом еритроцитів крові великої рогатої худоби. Для цього ерітроцитарну масу, виділену зі стабілізованої крові великої рогатої худоби, шляхом сепарування, піддають гемолізу водою для ін'єкцій. Строму (оболонку) відокремлюють мікрофільтрацією, використовуючи фільтри з діаметром пор 50; 20; 10; 5 і 1 мкм. Фільтрат обробляють концентрованим розчином хлористого натрію для висаджування негемових білків. Розчин удруге фільтрують через фільтри з діаметром пор 5; 1 і 0,65 мкм, піддають процесу ультрафільтрації з мембранами 300 кДа, що відтинають, й проводять фільтрацію, що стерилізує. 5 Концентрацію натівного гемоглобіну й продуктів його хімічної модифікації визначають спектрофотометрично по ціанметгемоглобіновому похідному при довжині хвилі 540 нм [М.С.Кушаковский / Клінічні форми ушкодження гемоглобіну, Л-д: Медицина, 1968. - C 23]. Використовують хлористий натрій марки ХЧ ("Хімічно чистий", ДЕРЖСТАНДАРТ 42-2572-88), глюкозу (ФС 42-2419-86), аскорбінову кислоту (ГФ X, C. - 6), ізотонічний розчин (ГФ XI, вип. 1, стор. 175). Полімеризація: 1-10 мас. % водяний розчин гемоглобіну дезоксигенирують і при 4° - 8°С, додають 1 - 5 мас. % водяний розчин глутарового альдегіду при молярному відношенні глутаровий альдегід : гемоглобін (10:1) Ц20:1). Реакцію завершують додаванням водяного розчину боргідриду натрію (рН 8-9). Розчин полігемоглобіну піддають ультрафільтрації на мембранах, що відтинають, 450 кДа, а потім для проведення концентрування й промивання діафільтрацією подають на мембрани, що відтинають, полімери менш 150 кДа. Розчин полігемоглобіну промивають діафільтрацією для видалення тетрамеру й низькомолекулярних з'єднань, концентрують до 10% полі гемоглобіну й подають на сушіння. Якість препарату на предмет відповідності фракційному складу полі гемоглобіну контролюють електрофорезом і гельпроникливою хроматографією. Як розчинник кровозамінника, що заявляють, із препаратів з гемодинамічною (протишоковою) дією запропоновано використовувати поліоксидин, що містить 1,5% розчин поліетиленгліколю з молекулярною масою 20 кДа в 0,9 % розчину хлориду натрію з додаванням йодиду калію. Поліоксидин має протишокову дію, здатністю викликати аутогемодилюцію й утримувати рідину в судинному руслі. Володіючи дезагрегуючою дією поліоксидин відновлює капілярний кровотік. У якості дезінтоксикаційного препарату запропоновано використовувати гемодез - 6% розчин полівинілпіролідона з молекулярною масою 12,6 кДа з додаванням збалансованих по іонному составу солей. Як регулятори водно-сольового обміну й кислотно-основного стану пропонується використовувати розчин Рінгера зі вмістом інгредієнтів ммоль/л Na - 147, K - 4,0, Ca - 2,3, Cl - 155, HCO3 1,2. У якості поліфункціонального (комплексного) препарату пропонується використовувати мафусол - розчин солей (хлориду натрію, хлориду калію й хлориду магнію) і фумарата натрію. Концентрація кровозамінника, що рекомендують в розчинах, - 1%. Приклад 1. Стабілізована, охолоджена до +2+4°C кров BPC, у пластикових ємностях об'ємом 10 літрів, у кількості 30 л, з холодильної камери через шлюз передається у виробниче приміщення. За допомогою перистальтичного насоса кров подається у прийомну чашу працюючого сепаратора А1-ФКЖ. Сепарування здійснюється при 4000 об/хв. Отримана ерітромаса EM у кількості 12 л по трубопроводу надходить до ємності для гемолізу. Після завантаження 12 л EM в одноразовий 96390 6 біоконтейнер Флексель 3D (E1) для гемолізу обсягом 50 л (всі ємності постачені охолодною сорочкою) включається перистальтичний насос для перемішування, й у ємність подається 36 л води для ін'єкцій (ВДІ) температурою +6-+8°C (контроль температури - датчик у палетанке) зі збірної ємності, розміщеної в приміщенні підготовки розчинів. Гемоліз проходить протягом 40 хвилин при перемішуванні. Отриманий гемолізат перекачують насосом на патронні фільтри з розміром пор 50; 20; 10; 5 і 1 мкм, розташовані послідовно, і далі в біоконтейнер Флексель для осадження негемових білків. Після фільтрації розчин подається в біоконтейнер для осадження негемових білків об'ємом 50 л. Після перекачування насосом усього об'єму, у ємність подається концентрований (33.3%) розчин NaCl у кількості 0,84 кг (ВР.6). Процес осадження триває 30 хв. Після осадження негемових білків розчин гемоглобіну перекачують насосом на патронні фільтри з розміром пор 5; 1 і 0,65 мкм, розташовані послідовно, й далі в ємність для концентрування розчину гемоглобіну. Очищення розчину гемоглобіну від високомолекулярних домішок проводять на ультрафільтраційній установці з мембранами, що відтинають речовини із MM понад 300 кДа. Концентрування розчину гемоглобіну проводять на ультрафільтраційній установці з мембранами, що відтинають речовини із MM понад 70 кДа до концентрації 10 % по гемоглобіну. Фільтрацію, що стерилізує, проводять на цій же установці з використанням мембран з розміром пор 0,2 мкм. Після концентрування 23,5 л розчину гемоглобіну надходить у газовихревий реактор. У реактор подається потік стерильного азоту (контроль по ротаметру), для перемішування й дезоксигенації. Дезоксигенацію проводять до досягнення концентрації кисню в рівноважному газовому середовищі 1,0-2,0 об.% (у реакторі датчик концентрації кисню). Розчин 2,5% глутарового альдегіду в кількості 1,83 кг переносять у реактор P1, що містить дезоксигемоглобін (ТП.3.1.) протягом 40 хв. Реакцію проводять при перемішуванні протягом 1 години, при температурі +6+8°C у струмі азоту. Для зупинки реакції додають розчин боргідриду натрію в кількості 0,2 кг у реактор з розчином полігемоглобіну. Реакцію проводять 30 хв при перемішуванні. Потім реакційна суміш передавлюється азотом (надлишковий тиск 0,5-1 атм.) у ємність для діафільтрації. З біореактора реакційна суміш передавлюється азотом (надлишковий тиск 0,5-1 атм.) і подається в біоконтейнер об'ємом 50 л. Далі розчин полігемоглобіну перекачується ПН на діафільтрацію 30 кДа для видалення високомолекулярних (понад 6 молекул гемоглобіну) з'єднань. Після діафільтрації розчин подається ПН у ємність об'ємом 20 л, що концентрує, й для промивній діафільтрації 100 кДа. Розчин промивається 150 л ВДІ для видалення модифікованого гемоглобіну (внутрішньомолекулярнозшитого тетрамеру) і низькомолекулярних з'єднань, концентрується до 20 л. Промивний роз 7 96390 чин направляється на станцію очищення стоків. У біоконтейнер з розчином полігемоглобіну додають 4,83 л 40% стерильного розчину глюкози шляхом стерильного з'єднання конектором 0,2 л 13,6 % стерильного розчину аскорбінової кислоти, перемішують. Потім приготовлений розчин перистальтичним насосом подають на установку фільтрації, що стерилізує, з розміром пор 0,22 мкм. Фі 8 льтрат надходить у накопичувальну ємність для подачі на сушіння. Для сушіння препарату використовується ліофільна або вакуумна сушарка, що забезпечує одержання стерильного порошку в кількості 4,8 кг. Порівняльні значення коефіцієнта Хілла наведені в таблиці. Таблиця Коефіцієнт Хілла Натівний гемоглобін Кровозамінник фірми Biopure Кровозамінник, що заявляють 2.0 1.4 1.8 Лікувальну ефективність отриманого кровозамінника оцінювали на моделі геморагичного шоку у собак. Для досліджень застосовували стерильний ліофільно висушений полігемоглобін, що містить глюкозу й аскорбінову кислоту. Порошок розводили сольовим розчином. Для досвіду використовували 10 безпородних собак - самців масою 10-20 кг, у яких штучно викликали геморагичний шок при гострій крововтраті із тривалою гіпотензією. Обсяг крововтрати становив 45-55 мл/кг, тривалість гіпотензії на рівні артеріального тиску, рівному 40 мм рт. ст. 60-70 хв. Внутрішньовенне введення розчину полімеризованого модифікованим глутаровим альдегідом гемоглобіну починали в період виражених розладів системної Комп’ютерна верстка А. Крулевський гемодинаміки, транспорту кисню й кислотноосновного стану організму, викликаних масивною втратою крові й тривалою гіпотензією. Введення препарату, отриманого методом, що заявляють, здійснювали в обсязі крововтрати. З 10 досліджених собак вижило 10, при цьому виявлено, що уливання розчину з низькою концентрацією полі1 гемоглобіну (0,8 р. дл" ) забезпечує не тільки стійке відновлення системної гемодинаміки, але й більше високий рівень споживання тканинами кисню. При використанні препарату з характеристиками прототипу в аналогічному досвіді вижило 9 тварин з 10. Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601