Антитіла людини, що зв’язують a-фактор некрозу пухлини людини

1 Ізольоване антитіло людини або його антиген-зв'язуюча частина, що мають легкий ланцюг з доменом CDR3, що містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 3 або SEQ ID NO 3, мо дифіковану одиничним заміщенням аланіном в позиції 1, 4, 5, 7 або 8 чи заміщенням від однієї до п'яти консервативними амінокислотами в позиціях 1, 4, 5, 7, 8 і/або 9, важкий ланцюг з доменом CDR3, що містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 4 або SEQ ID NO 4, модифіковану одиничним заміщенням аланіном в позиції 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11 чи заміщенням від однієї до п'яти консервативними амінокислотами в позиціях 2, З, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 і/або 12, причому вони дисоціюють з фактора некрозу пухлин людини TNFCC з константою спаду швидкості КсП 1 х 10 3 с 1 або менше, як встановлено шляхом резонансу поверхневого плазмона 2 Ізольоване антитіло людини або його антиген зв'язуюча частина за п 1, які відрізняються тим, що дисоціюють з фактора некрозу пухлин людини TNFCC з Кд 1 х 1 0 8 або менше та константою спаду швидкості КсП 1 х 1 0 3 с 1 або менше, як встановлено шляхом резонансу поверхневого плазмона, і нейтралізують цитотоксичність TNFCC людини в стандартному L929 ДОСЛІДІ in vitro з ICso 1 х 10 7 М або менше 3 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 1 або 2, які відрізняються тим, що дисоціюють з TNFCC людини з константою спаду швидкості КсП 5 х 10 4 с 1 або менше 4 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 1 або 2, які відрізняються тим, що дисоціюють з TNFCC людини з константою спаду швидкості КдП 1 х 10 4 с 1 або менше 5 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 2, які відрізняються тим, що нейтралізують цитотоксичність TNFCC людини в стандартному L929 ДОСЛІДІ in vitro з ICso 1 х 1 0 8 М або менше 6 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 2, які відрізняються тим, що нейтралізують цитотоксичність TNFa, людини в стандартному L929 ДОСЛІДІ in vitro з ICso 1 х 10 9 М або менше 7 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 2, які відрізняються тим, що нейтралізують цитотоксичність TNFCC людини 1П в стандартному L929 ДОСЛІДІ in vitro з ІС501 х 10 М або менше 8 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 2, які відрізняються тим, що є рекомбінантним антитілом або його антигензв'язуючою частиною 9 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 2, які відрізняються тим, що інгібують викликану TNFCC людини експресію ELAM-1 на ендотеліальних клітинах пупкової вени людини 10 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 1, які відрізняються тим, що мають варіабельний район легкого ланцюга (LCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 3, або SEQ ID NO 3, модифіковану шляхом одиничної заміни О (О 1 ю 57726 аланіном в позиції 1, 4, 5, 7 або 8, та варіабельний район важкого ланцюга (HCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 4, або SEQ ID N0 4, модифіковану шляхом одиничної заміни аланіном в позиції 2, З, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11 11 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 10, які відрізняються тим, що LCVR має домен CDR2, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 5 та HCVR має домен CDR2, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 6 12 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина за п 11, які відрізняються тим, що LCVR має домен CDR1, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 7 та HCVR має домен CDR1, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 8 13 Ізольоване антитіло людини або антигензв'язуюча його частина за п 1, які відрізняються тим, що мають варіабельний район легкого ланцюга (LCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, вибрану з групи, що складається з SEQ ID N0 З, SEQ ID N0 11, SEQ ID N0 12, SEQ ID N0 13, SEQ ID N0 14, SEQ ID N0 15, SEQ ID N0 16, SEQ ID N0 17, SEQ ID N0 18, SEQ ID N0 19 SEQ ID NO 20, SEQ ID N0 21, SEQ ID N0 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26, або варіабельний район важкого ланцюга (HCVR), що має домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, вибрану з групи, що складається з SEQ ID N0 4, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID N0 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID N0 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 33 та SEQ ID NO 34 14 Ізольоване антитіло людини або його антигензв'язуюча частина з варіабельним районом легкого ланцюга (LCVR), який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 1, та варіабельним ра йоном важкого ланцюга (HCVR), який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 2 15 Ізольоване антитіло людини за п 14, яке відрізняється тим, що має константний район важкого ланцюга lgG1 16 Ізольоване антитіло людини за п 14, яке відрізняється тим, що має константний район важкого ланцюга lgG4 17 Ізольоване антитіло людини за п 14, яке відрізняється тим, що є Fab-фрагментом 18 Ізольоване антитіло людини за п 14, яке відрізняється тим, що є Fv-фрагментом з одним ланцюгом 19 Рекомбінантне антитіло людини або його антиген-зв'язуюча частина, які нейтралізують активність TNF ОС людини, але не TNF р людини, і мають ідентифікаційні характеристики антитіла, вказані в пп 1-18 20 Рекомбінантне антитіло людини або його антиген-зв'язуюча частина за п 19, які відрізняються тим, що нейтралізують активність TNF ОС шимпанзе та, активність TNF ОС принаймні одного з додаткових приматів, вибраного з групи, яка включає TNF а бабуїна, TNF а мавпи, TNF а павіана та TNF ОС резуса 21 Рекомбінантне антитіло людини або його анти 4 ген-зв'язуюча частина за п 20, які відрізняються тим, що нейтралізують також активність TNF ОС собаки 22 Рекомбінантне антитіло людини або його антиген-зв'язуюча частина за п 20, які відрізняються тим, що нейтралізують також активність TNF ОС свині 23 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за будь-яким з пп 1-22, які відрізняються тим, що призначені для інгібування активності TNF ОС людини у людини, яка страждає від розладів, при яких активність TNF ОС є згубною 24 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за будь-яким з пп 1-22, які відрізняються тим, що призначені для приготування лікарського засобу для лікування розладів, при яких активність TNF ОС є згубною 25 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є сепсис 26 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що антитіло вводять людині разом з цитокіном інтерлікш-6 (IL-6) або вводять людині з концентрацією IL-6 в сироватці або плазмі більше ніж 500 пг/мл 27 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є аутоімунне захворювання 28 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 27, які відрізняються тим, що аутоімунне захворювання вибране з групи, яка включає ревматоїдний артрит, ревматоїдний спондиліт, остеоартритта подагричний артрит 29 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 27, які відрізняються тим, що аутоімунне захворювання вибране з групи, яка включає алергію, множинний склероз, аутоімунний діабет, аутоімунний увеїтта нефротичний синдром 30 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є інфекційне захворювання 31 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є відторгнення трансплантату або захворювання трансплантат проти хазяїна 32 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є злоякісне утворення 33 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є захворювання системи дихання 34 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є захворювання шлунково-кишкового тракту 35 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розладом є серцеве захворювання 36 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 23 або 24, які відрізняються тим, що розлад вибраний з групи, яка включає запальні розлади кісток, захворювання всмоктування кісток, алкогольний гепатит, вірусний гепатит, фульмінантний гепатит, порушення згортання, запалення, перфузивне порушення, келоідні утворення, утворення рубців, пірексію, перюдонтальне захворювання, ожиріння та радіаційну токсичність 37 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за пп 1- 22, які відрізняються тим, що призначені для застосування в терапії 38 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за пп 1- 22, які відрізняються тим, що призначені для застосування в терапії в комбінації з принаймні одним додатковим терапевтичним агентом для лікування розладів, при яких активність TNF ОС є згубною 39 Антитіло ЛЮДИНИ або його антиген-зв'язуюча частина за п 38, які відрізняються тим, що додатковий терапевтичний агент вибраний з групи, яка складається з нестероідних протизапальних ЛІКІВ, цитокшосупресивних протизапальних ЛІКІВ, CDP571/BAY-10-3356, сА2, 75 kdTNFR-IgG, 55 kdTNFRIgG, IDEC-CE9 1/SB 210396, DAB 486-IL-2, DAB 389-IL-2, Anti-Tac, IL-4, IL-10, IL-4-агоністів, IL-10агоністів, IL-1RA, TNF-bp/s-TNFR, S284, R973401, MK-966, Ілопросту, метотрексату, талідоміду, споріднених з талідомідом ЛІКІВ, лефлуноміду, транексамової кислоти, Т-614, простагландину Е1, Тенідапу, Напроксену, Мелоксикаму, Піроксикаму, Диклофенаку, Індометацину, Сульфасалазину, Азатюприну, інгібіторів ICE, інгібіторів zap-70, інгібіторів Іск, інгібіторів VEGF, інгібіторів VEGF-R, кортикостероїдів, інгібіторів TNT-конвертази, антиIL-12-антитіл, інгібіторів інтерлейкшу-11, штерлейкіну-13, інтерлейкшу-17, золота, пеніциламшу, хлорохшу, пдроксихлорохшу, хлорамбуцилу, циклофосфаміду, циклоспорину, антитимоцитного глобуліну, анти-СО4 антитіл, CD5-TOKCHHIB, пептидів, які вводять перорально, колагену, лобензаритдинатрію, агентів регулювання ЦИТОКІНІВ НР228та НР466, ІСАМ-1 антисмислових фосфоротюатних олігодеоксинуклеотидів, розчинного комплементарного рецептора 1, преднізону, орготешу, глікозаміногліканполісульфату, міноцикліну, 3HTH-IL2R антитіл, морських ЛІПІДІВ, ботанічних ЛІПІДІВ, ауранофіну, фенілбутазону, меклофенамової кислоти, флуфенамової кислоти, внутрішньовенного імуноглобуліну, зілеутону, мікофенольної кислоти, такролімусу, сіролімусу, аміприлозу, кладрибшу, азарибіну, буденозиду, фактора росту епідермісу, аміносаліцилатів, 6-меркаптопурину, метронідазолу, інгібіторів ліпоксигенази, мезаламшу, олзалазину, балзалазиду, антиоксидантів, інгібіторів тромбоксану, антагоністів IL-1 -рецептора, анти-IL1 р -моноклональних антитіл, анти-ІІ_-6 моноклональних антитіл, факторів росту, інгібіторів еластази, піридиніл-імідазольних сполук, спряжених глюкуронід-спряжених проліків преднізолону, дексаметазону або будезоніду, декстран-спряжених проліків преднізолону, дексаметазону або будезоніду, розчинного комплементарного рецептора 1, мезалазину з повільним вивільненням, антагоністів фактора активізації тромбоцитів (PAF), ципрофлоксацину, лігнокашу, преднізолону, метилпреднізолону, циклофосфаміду, 4-амшопіридину, тизанідину, штерферону-р 1а, штерферону-р 1Ь, співполімеру 1, гіпербаричного кисню, внутрішньовенного імуноглобуліну, клабрибшу, гіпертонічних соляних розчинів, антибіотиків, безперервних ге 57726 мофільтрацій, карбапенемів, антагоністів цитокінів, таких якіПРа , IL-1 р , ІL-6 та/або IL-8, SK&F 107647, чотиривалентного гуанілпдразону CNI1493, шпбітора шляхів тканинного фактора, РНР, комплексонів та хелатних сполук заліза, включаючи комплекс діетилентриамш пентаоцтової кислоти - заліза (III), лізофіліну, PGG-глюкану, аполіпопротеїну А-1, відновленого ліпідами, хіральних пдроксамових кислот, антиендотоксинних антитіл, Е5531, гВРІ2і, синтетичних антиендотоксинних пептидів, замісної терапії поверхнево-активних речовин та анти-ІІ_-8-антитіл 40 Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує легкий ланцюг антитіла за п 1, в якому домен CDR3 включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO З або SEQ ID NO 3, модифіковану шляхом одиничної заміни аланіном в позиції 1, 4, 5, 7 або 8, або заміною від однієї до п'яти консервативними амінокислотами в позиціях 1, 3, 4, 6, 7, 8 та/або 9 41 Ізольована нуклеїнова кислота за п 40, яка відрізняється тим, що кодує варіабельний район легкого ланцюга (LCVR) антитіла 42 Ізольована нуклеїнова кислота за п 41, яка відрізняється тим, що домен CDR2 варіабельного району легкого ланцюга антитіла включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 5 43 Ізольована нуклеїнова кислота за п 42, яка відрізняється тим, що домен CDR1 варіабельного району легкого ланцюга антитіла включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 7 44 Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує важкий ланцюг антитіла за п 1, в якому CDR3 домен включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 4 або SEQ ID NO 4, модифіковану шляхом одиничної заміни аланіном в позиції 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11, або заміною від однієї до п'яти консервативними амінокислотами в позиціях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 та/або 12 45 Ізольована нуклеїнова кислота за п 44, яка відрізняється тим, що кодує варіабельний район важкого ланцюга (HCVR) антитіла 46 Ізольована нуклеїнова кислота за п 45, яка відрізняється тим, що домен CDR2 варіабельного району важкого ланцюга антитіла включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 6 47 Ізольована нуклеїнова кислота за п 46, яка відрізняється тим, що домен CDR1 варіабельного району важкого ланцюга антитіла включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 8 48 Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує легкий ланцюг та важкий ланцюг антитіла за п 1, в якому CDR3 домен включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, вибрану з групи, яка складається з а) SEQ ID NO З, SEQ ID NOs 11 -26 легкого ланцюга, б) SEQ ID NO 4, SEQ ID NOs 27-34 важкого ланцюга 49 Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує варіабельний район легкого ланцюга антитіла, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 1 50 Ізольована нуклеїнова кислота за п 49, яка відрізняється тим, що кодує варіабельний район легкого ланцюга та константний район легкого ланцюга 57726 8 51 Ізольована нуклеїнова кислота за п 50, яка проксену, Мелоксикаму, Піроксикаму, Диклофенавідрізняється тим, що вона розміщена у реку, Індометацину, Сульфасалазину, Азатюприну, комбінантному векторі експресії інгібіторів ICE, інгібіторів zap-70, інгібіторів Іск, інгі52 Ізольована нуклеїнова кислота, яка кодує варібіторів VEGF, інгібіторів VEGF-R, кортикостероїдів, абельний район важкого ланцюга антитіла, що інгібіторів TNT-конвертази, анти-ІІ_-12-антитіл, інгівключає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID біторів інтерлейкшу-11, інтерлейкшу-13, штерлейN0 2 кіну-17, золота, пеніциламшу, хлорохшу, пдрокси53 Ізольована нуклеїнова кислота за п 52, яка хлорохшу, хлорамбуцилу, циклофосфаміду, відрізняється тим, що кодує варіабельний район циклоспорину, антитимоцитного глобуліну, антиважкого ланцюга та константний район важкого C D 4 антитіл, CD5-TOKCIHIB, пептидів, які вводять ланцюга перорально, колагену, лобензаритдинатрію, аген54 Ізольована нуклеїнова кислота за п 53, яка тів регулювання ЦИТОКІНІВ НР228та НР466, ІСАМ-1 відрізняється тим, що константний район важкого антисмислових фосфоротюатних олігодеоксинукланцюга антитіла є константним районом lgG1 леотидів, розчинного комплементарного рецепто55 Ізольована нуклеїнова кислота за п 53, яка ра 1, преднізону, орготешу, глікозамшогліканполівідрізняється тим, що константний район важкого сульфату, міноцикліну, 3HTH-IL-2R антитіл, ланцюга антитіла є константним районом lgG4 морських ЛІПІДІВ, ботанічних ЛІПІДІВ, ауранофіну, 56 Ізольована нуклеїнова кислота за п 54, яка фенілбутазону, меклофенамової кислоти, флуфевідрізняється тим, що вона розміщена у ренамової кислоти, внутрішньовенного імуноглобулікомбінантному векторі експресії ну, зілеутону, мікофенольної кислоти, такролімусу, 57 Рекомбінантний вектор експреси, який кодує сіролімусу, аміприлозу, кладрибшу, азарибшу, булегкий ланцюг антитіла за п 1, причому легкий денозиду, фактора росту епідермісу, аміносаліциланцюг має варіабельний район, який включає латів, 6-меркаптопурину, метронідазолу, інгібіторів амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 1, та важліпоксигенази, мезаламшу, олзалазину, балзалакий ланцюг антитіла, причому важкий ланцюг має зиду, антиоксидантів, інгібіторів тромбоксану, анваріабельний район, який включає амінокислотну тагоністів 1L-1 -рецептора, анти-IL-i р П О С Л І Д О В Н І С Т Ь S E Q ID N O 2 моноклональних антитіл, анти-И-6 моноклональ58 Штам культивованих клітин-хазяїв, який них антитіл, факторів росту, інгібіторів еластази, відрізняється тим, що містить рекомбінантний векпіридиніл-імідазольних сполук, спряжених глюкутор експресії за п 57 ронід-спряжених проліків преднізолону, дексаме59 Спосіб синтезу антитіла людини, яке зв'язує тазону або будезоніду, декстран-спряжених проліTNF ОС людини, який відрізняється тим, що ків преднізолону, дексаметазону або будезоніду, включає культивування штаму клітин-хазяїв за п розчинного комплементарного рецептора 1, меза58 в культуральному середовищі протягом часу, лазину з повільним вивільненням, антагоністів достатнього для синтезу клітинами вказаних антифактора активізації тромбоцитів (PAF), ципрофлотіл людини, які зв'язують TNF ОС ксацину, лігнокашу, преднізолону, метилпреднізо60 Фармацевтична композиція, яка включає ефеклону, циклофосфаміду, 4-амшопіридину, тизанідитивну КІЛЬКІСТЬ антитіла або його антигенну, штерферону-р 1а, штерферону-р 1Ь, зв'язуючої частини за п 1-22 та фармацевтично співполімеру 1, гіпербаричного кисню, внутрішньоприйнятний носій венного імуноглобуліну, клабрибшу, гіпертонічних 61 Фармацевтична композиція за п 60, яка відрізняється тим, що включає принаймні один додатсоляних розчинів, антибіотиків, безперервних гековий терапевтичний агент для лікування розладу, мофільтрацій, карбапенемів, антагоністів ЦИТОКІпри якому активність TNF ОС є згубною НІВ, таких flKTNFCK, IL-1 р , ІL-6 та/або IL-8, SK&F 62 Фармацевтична композиція за п 61, яка відрі107647, чотиривалентного гуанілпдразону CNIзняється тим, що додатковий терапевтичний 1493, шпбітора шляхів тканинного фактора, РНР, агент вибраний з групи, яка складається з нестекомплексонів та хелатних сполук заліза, включаюроїдних протизапальних ЛІКІВ, цитокшосупресивчи комплекс діетилентриамш пентаоцтової кислоних протизапальних ЛІКІВ, CDP-571/BAY-10-3356, ти - заліза (III), лізофіліну, PGG-глюкану, аполіпопсА2, 75 kdTNFR-IgG, 55 kdTNFR-IgG, IDECротеїну А-1, відновленого ліпідами, хіральних СЕ9 1/SB 210396, DAB 486-IL-2, DAB 389-IL-2, Antiпдроксамових кислот, антиендотоксинних антитіл, Tac, IL-4, IL-10, IL-4-агоністів, IL-10-агоністів, ILЕ5531, гВРІ2і, синтетичних антиендотоксинних 1RA, TNF-bp/s-TNFR, S284, R973401, MK-966, пептидів, замісної терапії поверхнево-активних Ілопросту, метотрексату, талідоміду, споріднених з речовин та анти-1 L-8-антитіл талідомідом ЛІКІВ, лефлуноміду, транексамової кислоти, Т-614, простагландину Е1, Тенідапу, На Фактор а некрозу пухлин (TNFa) є цитокіном, що виробляється багатьма видами клітин, включаючи моноцити та макрофаги, що було спершу досліджено, базуючись на його здібності стимулювати некроз певних мишачих пухлин (див, наприклад, Old, L (1985) Science 23u 630-632) Поступово було показано, що фактор, названий кахектином, пов'язаний з кахексією, є тією ж самою молекулою, що і TNFa TNFa використовували при опосередкуванні шоку (див, наприклад, Beutler, В та Сегаглі, А (1998) Annu Rev Вюchem 57 505-518, Beutler, В та Сегаті, А (1998) Annu Rev Immunol 7 625-655) Більш того, TNFa використовували у патофізіології багатьох інших захворювань та розладів людини, включаючи сепсис, інфекції, автоімунні захворювання, відторгнення трансплантата та захворювання типу трансплантат проти хазяїна (див , наприклад, Moeller, A, et аі (1990) Cytokme 2 162-169, Патент США No 5,231,024 Moller et all, Європейська Патентна Публікація No 260 610 В1 Moeller, A , et al, Vasilh, Р (1992) Annu Rev Immunol 111 411-452, Tracey, K J та Cerami, A (1994) Annu Rev Med 45 491503) Внаслідок згубної ролі TNFa людини (hTNFa) в багатьох розладах людини було розроблено терапевтичні стратегії для інгібування або протидії активності hTNFa Зокрема, вважали, що антитіла, які зв'язують та нейтралізують hTNFa, є засобом інгібування активності hTNFa Деякі з таких перших антитіл були мишачими моноклональними антитілами (мАТ), які секретувались пбридомами, одержаними з лімфоцитів мишей, імунізованих hTNFa (див , наприклад, Напп Т , et аі, (1985) Ргос Natl Acad Sei USA 82 3814-3818, Liang, C-M , et al (1986) Biochem Biophys Res Commun 157 847854, Hiarai, M, et al (1987) J Immunol Methods 96 57-62, Fendly, B M et al (1987) Hybndoma 6 359-370, Moeller, A , et al (1990) Cytokme 2 162169, Патент США No 5,231,024 Moeller et al , Європейська Патентна Публікація № 186 833 B1 Wallach, D , Європейська Патентна Публікація № 218 868 А1 Old et al, Європейська Патентна Публікація № 260 610 В1 Moeller, A et al) В той час, як такі мишачі анти-hTNFa антитіла часто демонструють високу афінність до hTNFa (наприклад, Кд s 10 9М) та здатні нейтралізувати активність hTNFa, їх використання in vivo може бути обмежено такими проблемами, пов'язаними з уведенням мишачих антитіл людині, як коротке напівжиття сироватки, нездатність запускати деякі ефекторні функції людини та та викликання небажаної імунної ВІДПОВІДІ проти мишачих антитіл у людини (реакція "антимишачі антитіла людини" - НАМА) Спробою уникнути проблем, пов'язаних з використанням повністю мишачих антитіл для людини була зміна мишачих анти-hTNFa антитіл шляхом генної інженери для того, щоб вони були більш "людиноподібні" Наприклад, були одержані химерні антитіла, в яких варіабельні райони ланцюгів антитіла походять від мишачих антитіл, а константні райони ланцюгів антитіла походять від антитіл людини (Khight, D М , et al (1993) Мої Immunol 301443-1453, РСТ Публікація № WO 92/16553 Daddona, Р Е , et al) Додатково були одержані також олюдненні антитіла, в яких пперваріабельні домени варіабельних районів антитіл походять від миші, але залишок варіабельних районів та константні райони антитіла походять від людини (РСТ Публікація № WO 92/11383 Adair, J R , et al) Однак, оскільки в цих химерних олюднених антитілах все ще залишаються деякі мишачі ПОСЛІДОВНОСТІ, вони можуть викликати небажану імунну реакцію, реакцію людини проти химерного антитіла (МАСА), особливо при введенні протягом довгого періоду, зокрема, при хронічних захворюваннях, таких як ревматоїдний артрит (див, зокрема, Elliott, М J , et al (1994) Lancet 344 1125-1127, Elliot, M J , et al (1994) Lancet 344 1105-1110) Найкращим інгібуючим агентом hTNFa для мишачих мАТ або їх похідних (зокрема, химерних та олюднених антитіл) були б повністю антиhTNFa антитіла людини, оскільки такий агент не викликатиме реакції НАМА навіть при використані протягом довгого часу Були одержані моноклональні автоантитіла проти hTNFa при використанні пбридомної технології людини (Boyle, P, et al (1993) Cell Immunol 152 556-568, Boyle, P , et al (1993) Се/А Immunol 152 569-581, Публікація Європейської Патентної Заявки № 614 984 А2 Boyle et аі) Однак, повідомлялось, що ці пбридомаПОХІДНІ моноклональні автоантитіла мають афінність до hTNFa, яка надто мала для встановлення и традиційними способами, та не здатні зв'язувати розчинний hTNFa та нейтралізувати індуковану hTNFa цитотоксичність (див Boyle, et аі , вищевказане посилання) Більш ТОГО, успіх пбридомної технології людини залежить від природної присутності в людській периферійній крові лімфоцитів, які виробляють автоантитіла, специфічні до hTNFa Певні досліди виявили автоантитіла сироватки проти hTNFa в людських препаратах (Fomsgaard, A, et al (1989) Scand J Immunol 3Q 219-223, Bendtzen, К, et al (1990) Prog Leukocyte Biol IQB 447-452), в той час, як ІНШІ не виявили (Leusch, H-G , et al (1991) J Immunol Methods 129 145-147) Альтернативою до анти-hTNFa антитіл, природно існуючих, є рекомбінантні анти-hTNFa антитіла Були описані рекомбінантні антитіла людини, які зв'язують hTNFa з порівняно низькою активністю (а саме, Кд~ 10 7М) та високим спадом швидкості (а саме, К;п ~ Ю 2 с 1) (Griffiths, A D , et al (1993) ЕМВО J 12 725-734) Однак, внаслідок їх порівняно швидкої кінетики дисоціації, ці антитіла не можуть бути зручними для терапевтичного використання Додатково, було показано, що рекомбінантні анти-hTNFa антитіла людини не нейтралізують активність hTNFa, а скоріше посилюють зв'язування hTNFa з поверхнею клітин та посилюють інтерналізацію hTNFa (Lidbury, A , et al (1994) BiotechnoL Ther 5 27-45, Публікація РСТ No WO 92/03145 Aston, R etal) ВІДПОВІДНО, існує потреба в антитілах людини, таких як рекомбінантні антитіла людини, що зв'язують розчинний hTNFa з високою афінністю та повільною кінетикою дисоціації, та здібні нейтралізувати активність hTNFa, включаючи індуковану hTNFa цитотоксичність (in vitro та in vivo) та індуковану hTNFa активацію клітин Опис винаходу Даний винахід забезпечує антитілами людини, переважно рекомбінантними антитілами людини, які специфічно зв'язують hTNFa людини Антитіла 12 11 57726 даного винаходу характеризуються зв'язуванням з Ще в одному втіленні даний винахід забезпеhTNFa з високою афінністю та повільною кінетичує людськими антитілами або їх антигенкою дисоціації та нейтралізацією активності зв'язуючими частинами з LCVR, які мають домен hTNFa, включаючи викликану hTNFa цитотоксичCDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ ність (in vitro та in vivo) та викликану hTNFa актиSEQ ID N0 3, або модифіковану SEQ ID N0 3 вацію клітин Антитіла даного винаходу надалі шляхом заміни одного аланіну в положенні 1, 4, 5, характеризуються за зв'язуванням з hTNFa, але не 7 чи 8, та з HCVR, що має домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 4 3 hTNFp (лімфотоксин), та за наявністю здібності або модифіковану SEQ IS NO 4 шляхом заміни зв'язувати ІНШІ hTNFa приматів та hTNFa не приодного аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 матів разом з hTNFa людини або 11 Краще, LCVR надалі має домен CDR2, Антитіла даного винаходу можуть бути цільноякий включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID ланцюговими (а саме, lgG1 або lgG4 антитіла) або N0 5, а HCVR надалі має домен CDR2, який вклюможуть включати тільки антиген-зв'язуючу частину чає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 6 Ще (а саме, фрагменти Fab, F(ab')2 або scFv) Найкраще, щоб LCVR мав надалі домен CDR1, що кращі рекомбінантні антитіла даного винаходу, включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID позначені як D2E7, мають домен CDR3 легкого N0 7, а HCVR мав домен CDR1, що включає аміланцюгу, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 3, та домен CDR3 важкого ланцюгу, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 4 Антитіла D2E7 мають переважно варіабельний район легкого ланцюгу (LCVR), що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 1, та варіабельний район важкого ланцюгу (HCVR), що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 2 В одному з втілень даний винахід забезпечує ізольованими людськими антитілами або їх антиген-зв'язуючими частинами, які дисоціюють від людського hTNFa з Кд 1 х 10 8 М або менше та Ксп константою швидкості 1 х 10 З с 1 або менше, що одержано способом резонансу поверхневого плазмона, та нейтралізують цитотоксичність hTNFa людини в стандартному ДОСЛІДІ L929 in vitro з ICso 1 х 10 7 М або менше Добре, якщо ізольовані людські антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини дисоціюють з hTNFa людини з Ксп 5 х 10 4 с 1 або менше, або ще краще з Ксл 1 х 1 0 4 с 1 або менше Краще, якщо ізольовані антитіла людини або їх антиген-зв'язуючі частини нейтралізують цитотоксичність hTNFa людини в стандартному ДОСЛІДІ ІП vitro L929 з ІС50 1 х 10 8 М або менше, навіть переважніше з ІС50 1 х 10 9 М або менше, та ще пере10 ' ї ї важніше з ІС50 5x10 М або менше В іншому втіленні даний винахід забезпечує антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами, що мають такі характеристики а) дисоціюють з людського hTNFa з Ксп 1 х 10 3 с 1 або менше, що досліджено шляхом резонансу поверхневого плазмону, б) мають домен CDR3 легкого ланцюгу, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO З або модифіковану SEQ ID NO 3 шляхом одиничної заміни аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 чи 8, або від одного до п'яти консервативних амінокислотних заміщень в положеннях 1, 3, 4, 6, 7, 8 та/або 9, в) мають домен CDR3 важкого ланцюгу, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 4, або модифіковану SEQ ID NO 4 шляхом одиничного заміщення аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 або 11, або від одного до п'яти заміщень в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 та/або 12 Краще, дані антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини дисоціюють від hTNFa людини з Ксп 5 х 10 4 с 1 або менше Все ж таки найкраще, щоб антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини дисоціювали з hTNFa людини з Ксп 1 х 1 0 4 с 1 або менше нокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 8 В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами з LCVR, що включають амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N01, та HCVR, що включають амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 2 В певних втіленнях дані антитіла мають константну частину важкого ланцюгу lgG1 або константну частину важкого ланцюгу lgG4 В ще одному втіленні такі антитіла є Fab фрагментами, F(ab')2 фрагментами або одноланцюговим Fv фрагментом В ще інших втіленнях даний винахід забезпечує антитілами або їх антиген-зв'язуючими частинами, в яких домен CDR3 LCVR включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, вибрану з наступної групи SEQ ID N0 3, SEQ ID N0 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID N0 16, SEQ ID N0 17, SEQ ID N0 18, SEQ ID N0 19, SEQ ID N0 20, SEQ ID N0 21, SEQ ID N0 22, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 26 з або без HCVR, що має домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, обрану з групи SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID N0 31, SEQ ID N0 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34 та SEQ ID NO 35 Ще в одному втіленні даний винахід забезпечує виділеними антитілами людини або їх антигензв'язуючими частинами, що нейтралізують активність TNFa людини, але не TNFp людини (лімфотоксин) В переважному втіленні антитіла людини або їх антиген-зв'язуюча частина нейтралізує активність TNFa людини, TNFa шимпанзе та TNFa принаймні одного примата, вибраного з групи, до якої входять TNFa бабуїна, TNFa мавпи, TNFa павіана, та TNFa резуса Переважно, дані антитіла також нейтралізують активність TNFa принаймні одного не примата Наприклад, в одному з втілень ізольовані антитіла людини або їх антигензв'язуючі частини також нейтралізують і активність собачого TNFa В іншому втіленні ізольовані антитіла людини або їх аниген-зв'язуючі частини також нейтралізують активність TNFa свині В ще одному втіленні ізольовані антитіла людини або їх антиген-зв'язуючі частини також нейтралізують активність TNFa миші Інший аспект даного винаходу торкається молекул нуклеїнових кислот, що кодують антитіла 14 13 57726 даного винаходу або їх антиген-зв'язуючі частини фігурі 2В зображено домени FR3, CDR3 та FR4 Переважною нуклеїновою кислотою даного винаДомени важкого ланцюга CDR1 ("CDR H1"), CDR2 ходу, що кодує D2E7 LCVR, є нуклеотидна ПОСЛІ("CDR H2") та CDR3 ("CDR H3") обведено прямоДОВНІСТЬ, яка показана на Фіг 7 та SEQ ID NO 36 кутником Іншою переважною нуклеїновою кислотою даного Фігура 3 є графічним зображенням інгібування винаходу, що кодує D2E7 HCVR, є нуклеотидна викликаної TNFa цитотоксичності L929 анти-hTNFa ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка показана на Фіг 8 та SEQ ID антитілами людини D2E7, що порівнюють з мишаN0 37 Вектори рекомбінантної експреси, які нечими анти-hTNFa антитілами МАК 195 суть нуклеотидні ПОСЛІДОВНОСТІ, кодуючі антитіла На фігурі 4 графічно зображено інгібування даного винаходу, та клітини-хазяї, в які такі вектозв'язування rhTNFa з рецепторами hTNFa на кліри були уведені, також охоплюються даним винатинах U-937 анти-hTNFa антитілами людини D2E7, ходом, як і способи одержання антитіл винаходу що порівнюють з мишачими анти-hTNFa антитілашляхом культивування клітин-хазяїв винаходу ми МАК 195 Ще одним аспектом даного винаходу є спосоНа фігурі 5 графічно показано інгібування індуби інгібування активності TNFa людини завдяки кованої TNFa експресії ELAM-1 на HUVEC антивикористанню антитіл винаходу або їх антигенhTNFa антитілами людини D2E7, що порівнюють з зв'язуючих частин В одному з втілень даний спомишачими анти-hTNFa антитілами МАК 195 сіб включає контактування людського TNFa з анНа фігурі 6 у вигляді стовпчиків графічно покатитілом винаходу або його антиген-зв'язуючою зано захист від індукованої TNFa летальності мичастиною, таким чином, що інгібується активність шей, чутливих до D-галактозамшу, шляхом увеTNFa людини В іншому втіленні спосіб включає дення анти-hTNFa антитіл людини D2E7 (чорні уведення антитіл винаходу або їх антигенстовпчики), що порівнюють з мишачими антизв'язуючих частин людині, яка страждає на розhTNFa антитілами МАК 195 (заштриховані стовплад, при якому активність TNFa є згубною таким чики) чином, що активність TNFa в організмі людини На фігурі 7 зображено нуклеотидну ПОСЛІДОВінгібується Таким розладом може бути, наприНІСТЬ варіабельного району легкого ланцюга D2E7 клад, сепсис, автоімунне захворювання (а саме, з розрахованою амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ ревматоїдний артрит, алергія, множинний склероз, знизу під нуклеотидною ПОСЛІДОВНІСТЮ Райони автоімунний діабет, автоімунний увеїт та нефроCDR L1, CDR L2 та CDR L3 підкреслені тичний синдром), інфекційне захворювання, злоНа фігурі 8 зображено нуклеотидну ПОСЛІДОВякісне утворення, відторження трансплантата або НІСТЬ варіабельного району важкого ланцюга D2E7 захворювання трансплантат-проти-хазяїна, пульз розрахованою амінокислотною ПОСЛІДОВНІСТЮ мональний розлад, кістковий розлад, кишковий знизу під нуклеотидною ПОСЛІДОВНІСТЮ Райони розлад або серцевий розлад CDR H1, CDR H2 та CDR H3 підкреслені Короткий опис фігур На фігурі 9 графічно показано вплив обробки На фігурах 1А та 1В зображено амінокислотні антитілами D2E7 на середній розмір суглоба ПОСЛІДОВНОСТІ варіабельного району легкого лантрансгенних мишей Тд197 в якості моделі поліартцюга D2E7 (D2E7 VL, також показано на SEQ ID риту N0 1 ), мутанти по аланіну D2E7 VL (LD2E7*A1, Детальний опис винаходу LD2E7* A3, LD2E7* А4, LD2E7* А5, LD2E7* А7 та Даний винахід відноситься до ізольованих анLD2E7* А8), варіабельний район легкого ланцюга титіл людини або їх антиген-зв'язуючих частин, які О2Е7-родинних антитіл 2SD4 (2SD4 VL, також позв'язуються з TNFa людини з високою афінністю, казано на SEQ ID NO 9) та інший О2Е7-родинні низькою швидкістю розпаду та високою нейтраліваріабельні райони легкого ланцюгу (ЕР В12, зуючою здібністю Різноманітні аспекти даного VL10E4, VL100A9, VL100D2, VL10F4, L0E5, винаходу відносяться до антитіл та фрагментів VLL0F9, VLLOF10, VLL0G7, VLL0G9, VLL0H1, антитіл і їх фармацевтичних композицій, а також VLLOH10, VL1B7, VL1C1, VL1C7, VL0 1F4, до нуклеїнових кислот, векторів рекомбінантної VL0 1H8, L0E7, L0E7 А та L0E7 Т) На фігурі 1А експресії та клітин-хазяїв для приготування таких показано домени FR1, CDR1, FR2 та CDR2 На антитіл та фрагментів Способи використання анфігурі 1В зображено домени FR3, CDR3 та FR4 титіл даного винаходу для дослідження людського Домени CDR1 ("CDR L1"), CDR2 ("CDR L2") та TNFa або гальмування активності людського CDR3 ("CDR L3") легкого ланцюга обведено пряTNFa, in vivo або in vitro, також охоплюються дамокутником ним винаходом На фігурах 2А та 2В зображено амінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ варіабельного району важкого ланцюга D2E7 (D2E7 VH, також показано на SEQ ID N0 2), мутанти по аланіну D2E7 VH (HD2E7*A1, HD2E7*A2, HD2E7*A3, HD2E7* А4, HD2E7*A5, HD2E7* A6, HD2E7* A7, HD2E7* A8 та HD2E7* A9), варіабельний район важкого ланцюга D2E7родинних антитіл 2SD4 (2SD4 VH, також показано на SEQ ID NO 10), та інший 02Е7-родинні варіабельні райони важкого ланцюга (VH1B11, VH1D8, VH1A11, VH1B12, VH1-D2, VH1E4, VH1F6, VH1G1, ЗС-Н2, VH1-D2N та VH1-D2Y) На фігурі 2А зображено домени FR1, CDR1, FR2 та CDR2 На З метою кращого розуміння даного винаходу спочатку визначають деякі терміни Термін "TNFa людини" (абревіатура hTNFa або просто hTNF), як тут використовують, відноситься до цитокшу людини, якій існує як 17кДа в секретованій формі та як 26кДа в мембраназв'язаній формі, біологічно активна форма якого складається з тримера нековалентно зв'язаних молекул 17кДа Структуру hTNFa описують, наприклад, Реппіса, D , et аі, (1984) Nature 312 724729, Davis, J M , et al (1987) Biochemistry Ж13221326, Jones, E Y , et al (1989) Nature 338 225-228 Термін TNFa людини включає рекомбінований 16 15 57726 TNFa людини (rhTNFa), який можна одержати ста(див, напр Holhnger, P , et al (1993) Proc Natl Aндартним способом рекомбінантної експресії або cad Sei USA Ш 6444-6448, Poljak, R J , et al купити (R & D Systems, Catalog No 210-TA, Minne(1994) Structure 2 1121 -1123) apolis, MN) Далі, антитіло або його антиген-зв'язуюча частина може бути частиною більш крупної імуноадТермін "антитіло" так, як тут використовують, гезивної молекули, сформованої ковалентним або відноситься до молекул імуноглобулінів, що скланековалентним сполученням антитіла або частини даються з чотирьох поліпептидних ланцюгів, двох антитіла з одним або більше білком чи пептидом важких (Н) та двох легких (L), зв'язаних дисульфіПриклади таких імуноадгезивних молекул вклюдними зв'язками Кожен важкий ланцюг складаєтьчають район кора стрептавідшу для утворення ся з варіабельного району важкого ланцюга (скотетравимірної молекули scFv (Kipnanov, S M et al рочення HCVR або VH) та константного району Константний район важкого ланцюга складається з (1995) Human Antibodies and Hybndomas 6 93-101) трьох доменів - СН1, СН2 та СНЗ Кожен легкий та використання залишку цистеїну, пептидаланцюг складається з варіабельного району (скомаркера та С-кінцевої вільної ділянки поліпстидирочення LCVR або VL) та константного району ну для утворення бівалентних та бютінованих молегкого ланцюга Константний район легкого ланлекул scFv (Kipnanov et al (1994) Мої Immuol цюга включає один домен - CL Райони VH та VL 31 1047-1058) Такі частини антитіл, як Fab та надалі розділяють на пперваріабельні райони, F(ab')2 фрагменти, можна одержати з цілих молеозначені як комплементарно детерміновані райони кул антитіл, використовуючи традиційні способи, (CDR), в яких присутні райони, що є більш консертакі як розщеплення папаїном або пепсином, ВІДвативними, що позначають як матричні райони ПОВІДНО, ЦІЛИХ антитіл Більш того, антитіла, час(FR) Кожний VH та VL складається з трьох CDR та тини антитіл та імуноадгезивні молекули можна чотирьох FR, які розміщені, починаючи від аміноодержати з використанням стандартної технології кінця до карбокси-кінця, в такому порядку FR1, рекомбінантних ДНК так, як тут описано CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 Термін "антитіло людини" в контексті винаходу включає антитіла, що мають варіабельні та консТермін "антиген-зв'язуюча частина" антитіла тантні райони, які походять від послідовностей (або просто "частина антитіла") в контексті опису імуноглобулінів зародка людини Антитіла людини відноситься до одного або більше фрагментів анданого винаходу можуть включати амінокислотні титіла, які зберігають здібність специфічно залишки, які не кодуються послідовностями імунозв'язувати антиген (а саме, hTNFa) Було показаглобулінів зародка людини (напр, мутації, що но, що антиген-зв'язуюча функція антитіла може представлені випадковим або сайт-специфічним бути представлена фрагментами цільномутагенезом in vitro або соматичною мутацією m ланцюгового антитіла Приклади зв'язуючих фрагvivo), наприклад в CDR і, особливо, CDR3 Однак, ментів, що підпадають під термін "антигентермін "людське антитіло" в контексті винаходу не зв'язуюча частина" антитіла, включають (1) Fab включатиме антитіла, де ПОСЛІДОВНОСТІ CDR, які фрагмент, моно валентний фрагмент, що складапоходять від зародкових або інших ЛІНІЙ ссавців, ється з VL, VH, CL та СН1 доменів, (2) F(ab')2 таких як миша, були пришиті на людських матричфрагмент, бівалентний фрагмент, що включає два них послідовностях Fab фрагмента, зв'язаних дисульфідним містком в шарнірній ДІЛЯНЦІ, (3) Fd фрагмент, що складаєтьТермін "рекомбінантне антитіло людини" в ся з доменів VH та СН1, (4) Fv фрагмент, що склаконтексті винаходу включає всі антитіла, які одердається з доменів VL та VH однієї гілки антитіла, жують, експресують, створюють або виділяють (5) dAb фрагмент (Ward et al (1989) Nature рекомбінантними засобами, такі як експресовані з 341 544-546), який включає домен VH, (6) ізольовикористанням векторів рекомбінантої експреси, ваний комплементарний детермінований район поміщених у клітину-хазяїна (описано далі в РОЗ(CDR) Більш ТОГО, хоча два домени фрагменту Fv, ДІЛІ II), антитіла, одержані з комбінаторної бібліоVL та VH, кодуються окремими генами, їх можна теки рекомбінантних антитіл людини (описується об'єднати, використовуючи рекомбінантні способи далі в РОЗДІЛІ III), антитіла, виділені з тварин за допомогою синтетичної зв'язки, що зробить їх (напр , мишей), які є трансгеними для генів імуноспроможними утворювати єдиний білковий ланглобулінів людини (див , напр, Taylor, L D , et al цюг, в якому райони VL та VH розташовані так, що (1992) Nucl Acid Res 20 6287-6295) або антитіла, можуть утворювати моновалентну молекулу (відоодержані, експресовані, створені або ізольовані му як одноланцюгова Fv (scFv), див , напр Bird et будь-яким іншим способом, який включає сплайai (1988) Science 242 423-426, та Huston et al синг послідовностей гена імуноглобуліну людини (1988) Proc, Natl Аса Sei USA S5 5879-5883) Такі до інших послідовностей ДНК Такі рекомбінантні одноланцюгові антитіла також входять до терміну антитіла людини мають варіабельні та константні "антиген-зв'язуюча частина" антитіла Також охопрайони, що походять від послідовностей імуноглолюються ІНШІ одноланцюгові антитіла, такі як діабулінів зародка людини В певних втіленнях, одтіла Діатіла є бівалентними, біспецифічними аннак, такі рекомбінантні антитіла людини підлягатитілами, в яких домени VH та VL експресовані в ють мутагенезу in vitro (або, якщо використовують одному поліпептидному ланцюгу, але з використваринну ПОСЛІДОВНІСТЬ, трансгенну до людського танням зв'язки, яка надто мала, щоб дозволити Ід, соматичному мутагенезу in vivo), і, таким чином, парування між цими двома доменами на тому саамінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ районів VH та VL ремому ланцюгу, цим сприяючи тому, щоб домени комбгнантних антитіл є ПОСЛІДОВНОСТЯМИ, ЩО ПОпарувались з комплементарними доменами іншого ХОДЯТЬ ВІД та є родинними послідовностями VH та ланцюгу, та створюючи два сайти зв'язування VL зародкової лінії людини, та можуть не існувати 18 17 57726 природно в людських антитілах зародковій лінії m тіла або частини антитіл, є вільними від інших нукvivo леотидних послідовностей, що кодують антитіла або частини антитіл, які зв'язують ВІДМІННІ ВІД "Ізольоване антитіло" в контексті винаходу hTNFa антигени, чиї ІНШІ ПОСЛІДОВНОСТІ можуть відноситься до антитіла, яке суттєво вільне від природно обрамляти дану нуклеотидну кислоту в інших антитіл, що мають іншу антигенну специфічлюдській геномній ДНК Так, наприклад, ізольованість (напр , ізольовані антитіла, що специфічно на нуклеїнова кислота даного винаходу, що кодує зв'язують hTNFa, є суттєво вільним від антитіл, які район VH анти-hTNFa антитіл, містить ІНШІ ПОСЛІспецифічно зв'язують ВІДМІННІ від hTNFa антитіла) ДОВНОСТІ, що кодують ІНШІ райони VH, які зв'язують Ізольовані антитіла, які специфічно зв'язують ВІДМІННІ від hTNFa антигени hTNFa, можуть, однак, мати перехресну реактивність з іншими антигенами, такими, як молекули Термін "вектор" в контексті винаходу відноTNFa інших ЛІНІЙ (обговорюється надалі) Більш ситься до молекули нуклеїнової кислоти, що здаттого, ізольовані антитіла можуть бути суттєво віна транспортувати іншу нуклеїнову кислоту, до льними від інших клітинних матеріалів та/або реякої вона причеплена Одним типом векторів є човин "плазміда", якою називають кільцеву дволанцюгову петлю ДНК, в яку можна вставити додаткові "Нейтралізуюче антитіло" (або "антитіло, що сегменти ДНК Іншим типом вектора є вірусний нейтралізує активність hTNFa") відноситься в конвектор, де додаткові сегменти ДНК можуть вбудотексті винаходу до антитіл, чиє приєднання до вуватись в геном вірусу Деякі вектори здатні до hTNFa призводить до інгібування його біологічної автономної реплікації в КЛІТИНІ хазяїна, в якій вони активності Таке інгібування біологічної активності представлені (напр , бактеріальні вектори, що маhTNFa можна дослідити шляхом вимірювання одють бактеріальний оріджин реплікації, та епісоманого чи більше індикаторів біологічної активності льні мамілярні вектори) Інші вектори (напр , неhTNFa, наприклад, індукованої hTNFa цитотоксичепісомальні мамілярні вектори) можна інтегрувати ності (або /V vitro або in vivo), індукованої hTNFa в геном клітини-хазяїна при інтродукції в КЛІТИНІклітинної активації та зв'язування hTNFa з рецепхазяїні, та завдяки цьому реплікуються разом з торами hTNFa Ці показники біологічної активності геномом хазяїна Більш цього, деякі вектори здатні hTNFa можна оцінити завдяки кільком стандартспрямовувати експресію генів, до яких вони операним дослідам in vitro та in vivo, відомим з рівня тивно пришиті Такі вектори тут називають "вектотехніки (див Приклад 4) Переважно, здібність рами рекомбінантної експреси" (або просто "векантитіл нейтралізувати активність hTNFa вимірюторами експреси") Загалом, вектори експреси, що ється по інгібуванню індукованої hTNFa цитотоквикористовують в технології рекомбінантних ДНК, сичності клітин L929 В якості альтернативного часто знаходяться у формі плазмід В даному опипараметра активності hTNFa можна оцінювати сі "плазміду" та " вектор" можна використовувати здібність антитіл інгібувати індуковану hTNFa експоперемінно, оскільки плазміда є найбільш широко пресію ELAM-1 на HUVEC як вимірювання індуковикористовуваною формою вектора Однак, даний ваної hTNFa клітинної активації винахід включає і такі ІНШІ форми векторів експреТермін "резонанс поверхневого плазмону" в си як вірусні вектори (напр, реплікон-дефіцитні контексті винаходу відноситься до поверхневого ретровіруси, аденовіруси та адено-зв'язані віруси), феномену, що дозволяє аналізувати бюспецифічщо виконують такі самі функції ну взаємодію в реальному часі шляхом детекцм зміни концентрації білка в біосенсорному матриксі, Термін "рекомбінантна клітина-хазяїн" (або наприклад, використовуючи систему ВІАсоге просто "клітина-хазяїн") в контексті винаходу озна(Pharmacia Biosensor AB, Sweden and Piscataway, чає клітину, в якій представлений вектор рекомбіNJ) Для подальшого опису див Приклад 1 та нантної експресії Треба зрозуміти, що такі терміни Jonsson U , et al (1993) Ann Б/о/ Clm 51 19-26, відносяться не тільки до певної дослідної клітини, Jonsson, U , et ai (1991) Biotechniques 11 620-627, але і до потомства такої клітини Оскільки певні Johnson, B, et al (1995) J Мої Recogmt 3 125модифікації можуть зустрічатись у наступних по131, Johnson, B, et al (1991) Anal Biochem коліннях внаслідок або мутацій або впливу зовні, 103 268-277) таке потомство може, фактично, не бути ідентичним батьківській КЛІТИНІ, але входить до рамок виТермін "Ксп" в контексті винаходу відноситься значення "клітина-хазяїн" в контексті винаходу до константи спаду швидкості для дисоціації антитіла з комплексу антиген/антитіло РІЗНІ аспекти даного винаходу описуються детально надалі в підрозділах Термін "Кд" в контексті винаходу відноситься до константи дисоціації специфічної реакції антиІ Антитіла людини, що зв'язують людський ген-антитіло TNFa Термін "молекула нуклеїнової кислоти" в конДаний винахід забезпечує антитілами або їх тексті винаходу включає молекули ДНК та РНК антиген-зв'язуючими частинами, які зв'язують Молекула нуклеїнової кислоти може бути однолюдський TNFa з високою афінністю, низькою ланцюговою та дволанцюговою, але переважно швидкістю спаду та високою нейтралізуючою продволанцюговою ДНК дуктивністю Переважно, людські антитіла даного винаходу є рекомбінантними нейтралізуючими Термін "ізольована молекула нуклеїнової кислюдськими анти-hTNFa антитілами Найкращі пелоти" в контексті винаходу при посиланнях на нукреважні рекомбінантні нейтралізуючі антитіла далеїнові кислоти, кодуючі антитіла або частини анного винаходу називаються D2E7 та мають ПОСЛІтитіл (напр, VH, VL, CDR3), які зв'язують hTNFa, ДОВНОСТІ VLTa VH, що вказані на Фіг 1 А, 1В та Фіг відноситься до молекули нуклеїнової кислоти, в 2А, 2В ВІДПОВІДНО (амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ якій нуклеотидні ПОСЛІДОВНОСТІ, кодуючі дані анти 20 19 57726 району VL D2E7 також показана в SEQ ID NO 1, які показують високу афінність та повільну кінетику амінокислотна ПОСЛІДОВНІСТЬ VH D2E7 також покадисоціації, та інших анти-hTNFa антитіл людини, зана в SEQ ID NO 2) Зв'язуюча здібність D2E7 родинних до ПОСЛІДОВНОСТІ D2E7, 2SD4, зведена в порівняно з мишачими анти-hTNFa мАТ МАК 195, таблиці внизу Антитіла D2E7 laG1 2SD4 lgG4 MAK195F(ab')2 •у 1 MV 1,91 x10D 4,20 x10D 1,90x10° Коп 1 с D 8,81 x 1 0 8,4x10' D 8,70 х 10 Антитіла D2E7 та родинні антитіла також демонструють хорошу продуктивність нейтралізації активності hTNFa, що було вивчено в декількох дослідах in vitro та in vivo (див Приклад 4) Наприклад, такі антитіла нейтралізують індуковану hTNFa цитотоксичність клітин L929 з величиною 7 1ҐІ ІС5о в районі приблизно від 10 М до 10 М D2E7 при експресії як ЦІЛІ lgG1 антитіла нейтралізують індуковану hTNFa цитотоксичність клітин L929 з ІС50 приблизно 1,25 х 10 10 М Більш того, нейтралізуюча дія D2E7 має місце, якщо антитіла експресуються як Fab, F(ab')2 або scFv фрагменти D2E7 також інгібують індуковану hTNFa клітинну активацію, що вимірюється за індукованою hTNFa експресією ELAM-1 на HUVEC (ІС5о=приблизно 1,85 х 10 10 М), та зв'язування hTNFa з hTNFaрецепторами на клітинах U-937 (ICso-приблизно 1,56 х 10 1 0 М) На закінчення, D2E7 інгібують зв'язування hTNFa з як з р55 так і р75 рецептором hTNFa Більш ТОГО, ЦІ антитіла інгібують викликану hTNFa летальність in vivo у мишей (EDso-1-2,5 мкг/миша) Що стосується специфічності зв'язування D2E7, ці антитіла зв'язують TNFa людини в різних формах, включаючи розчинний hTNFa, трансмембранний hTNFa та hTNFa, зв'язаний з клітинними рецепторами D2E7 не зв'язує специфічно ІНШІ ЦИТОКІНИ, такі як лімфотоксин (TNFp), IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IFNy та TGFp Однак, D2E7 не показують перехресної реактивності до факторів некрозу пухлини з інших видів Наприклад, , антитіла нейтралізують активність TNFa принаймні п'яти приматів (шимпанзе, бабуїна, мавпи, павіана та резусу) з величиною ICso, приблизно рівною тій, що потрібна в разі нейтралізації hTNFa (див Приклад 4, підрозділ Е) D2E7 також нейтралізують активність мишачого TNFa, хоча і приблизно в 1000 разів слабіше, ніж TNFa людини (див Приклад 4, підрозділ Е) D2E7 також зв'язують собачий та свиний TNFa В одному з аспектів винахід відноситься до D2E7 антитіл та їх частин, О2Е7-родинних антитіл та їх частин та інших антитіл людини та їх частин з еквівалентними D2E7 властивостями, такими, як високоафінне зв'язування з hTNFa з низькою кінетикою дисоціації та високою нейтралізуючою продуктивністю В одному з втілень винахід забезпечує ізольованими антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами, що дисоціюють з TNFa людини з К д 1 х 1 0 8 М або менше та константою спаду швидкості Ксп 1 х 10 3 с 1 або менше, обидві величини виміряні методом резонансу поверхневого плазмону, та нейтралізують цитотоксичність людського TNFa в стандартному ДОСЛІДІ in vitro на L929 з ІС5о 1 х 10 7 М або менше Пере кд м 6,09x10 IU 2,00x10" 4,60x10 IU Стехіометрія 1,2 0,8 1,4 важно, ізольовані антитіла людини або їх антигензв'язуючі частини дисоціюють з TNFa людини з Ксп 4 1 4 5 х 10 с чи менше, навіть ще краще, з Ксп 1 х 10 1 с або менше Краще, ізольовані антитіла людини або їх антиген-зв'язуючі частини нейтралізують цитотоксичність TNFa людини в стандартному ДОСЛІДІ in vitro з L929 з ICso 1x10 8 М або менше, навіть краще з ICso 1x10 9 М або менше та ще краще з ІС50 5x10 10 М та менше В переважному втіленні антитіла є ізольованими рекомбінантними антитілами людини або їх антиген-зв'язуючими частинами В іншому переважному втіленні дані антитіла також нейтралізують індуковану TNFa клітинну активацію, що досліджувалось, використовуючи стандартний дослід in vitro для TNFaіндукованої експресії ELAM-1 на ендотеліальних клітинах пупової вени (HUVEC) Резонанс поверхневого плазмона для визначення Кд та Ксп можна провести так, як показано в прикладі 1 Стандартний дослід in vitro на L929 для визначення ICso показано на Прикладі 4, підрозділ А Стандартний дослід in vitro для індукованої TNFa експресії ELAM-1 на ендотеліальних клітинах пупкової вени людини (HUVEC) описаний в Прикладі 4, підрозділ С Приклади рекомбінантних антитіл людини, які задовольняють або передбачається, щовони задовольняють, наведені вище критерії кінетики та нейтралізації, включають антитіла, що мають слідуючі пари [VH/VL], ПОСЛІДОВНОСТІ яких показані на Фіг 1А, 1В, 2А та 2В (див також Приклади 2, 3 та 4 для аналізів кінетики та нейтралізації) [D2E7 VH/D2E7 VL], HD2E7*A1/D2E7 VL], [HD2E7* A2/D2E7 VL], [HD2E7* A3/D2E7 VL], [HD2E7* A4/D2E7 VL], [HD2E7* A5/D2E7 VL] [H02E7* A6/D2E7 VL], [HD2E7* A7/D2E7 VL], [HD2E7* A8/D2E7 VL], [HD2E7* A9/D2E7 VL], [D2E7 VH/LD2E7* A1], [D2E7 VH/LD2E7* A4], [D2E7 VH/LD2E7* A5], [D2E7 VH/LD2E7* A7], [D2E7 VH/LD2E7* A8], [HD2E7* A9/LD2E7* A1], [VH1-D2/LOE7], VH1D2N/LOE7T], [VH1-D2 Y/LOE7 A], [VH1D2 N/LOE7 A], [VH1-D2/EP B12] та [3C-H2/LOE7] З рівня техніки добре відомо, що домени CDR3 легких та важких ланцюгів антитіл грають важливу роль в специфічності/афінності зв'язування антитіл з антигеном ВІДПОВІДНО, В іншому аспекті даний винахід відноситься до антитіл людини, які мають повільну кінетику дисоціації для асоціації з hTNFa та які мають домени CDR3 легких та важких ланцюгів, що структурно ідентичні або родинні таким самим з D2E7 Як показано в прикладі 3, положення 9 D2E7 VL CDR3 може займати АІа або Thr без суттєвого впливу на Ксп ВІДПОВІДНО, консенсусний мотив для D2E7 VL CDR3 включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ Q-R 22 21 57726 Y-N-R-A-P-Y-(TVA) (SEQ ID N0 3) Додатково, по10, 11 та/або 12 ложення 12 D2E7 VH CDR3 може займати Туг або Краще, коли антитіла або їх антиген-зв'язуючі 4 Asn без суттєвого впливу на Ксп ВІДПОВІДНО, кончастини дисоціюють з TNFa людини з Ксп 5 х 10 с 1 сенсусний мотив для D2E7 VH CDR3 включає аміабо менше Навіть найкраще, якщо антитіла або нокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-Dїх антиген-зв'язуючі частини дисоціюють з TNFa 4 1 (Y/N) (SEQ ID NO 4) Більш того, як показано в людини з Ксп 1 х 1 0 с або менше Прикладі 2, домен CDR3 легких та важких ланцюВ ще одному втіленні даний винахід забезпегів D2E7 піддається заміщенню одним залишком чує ізольованими антитілами людини або їх антиаланіну (в положеннях 1, 4, 5, 7 або 8 в VL CDR3 ген-зв'язуючими частинами з варіабельним райоабо в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11 в VH ном легкого ланцюгу (LCVR), що має домен CDR3, CDR3) без суттєвого впливу на Ксп Далі, спеціаліякий включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID сти в даній області зрозуміють, що беручи до уваN0 3 або модифіковану SEQ ID NO 3 шляхом одиги здатність доменів CDR3 D2E7 VL та VH до замін ничної заміни аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 або 8, аланіном, можлива заміна інших амінокислот в та з варіабельним районом важкого ланцюгу доменах CDR3, якщо зберігається низька констан(HCVR), що має домен CDR3, який включає амінота спаду швидкості антитіл, особливо заміни на кислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 4 або модифіконсервативні амінокислоти "Заміна консервативковану ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 4 шляхом одининої амінокислоти" так, як тут використовується, чної заміни аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, означає, що один амінокислотний залишок замі10 або 11 Переважно, LCVR надалі має домен щується іншим амінокислотним залишком, який CDR2, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ має подібний боковий ланцюг Родини амінокислоSEQ ID NO 5 (тобто, D2E7 VL CDR2) та HCVR натних залишків, що мають подібні бокові ланцюги, далі має домен CDR2, який включає амінокислотбули описані в рівні техніки, включаючи основні ну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 6 (тобто, D2E7 VH бокові ланцюги (а саме, лізин, аргінін, пстидін), CDR2) Навіть краще, якщо LCVR надалі має докислотні бокові ланцюги (а саме, аспарагінова кимен CDR1, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВслота, глутамшова кислота), незаряджені полярні НІСТЬ SEQ ID N0 7 (тобто, D2E7 VL CDR1), та бокові ланцюги (а саме, гліцин, аспарагін, глутаHCVR надалі має домен CDR1, який включає амімін, серін, треонін, тірозин, цистеїн), неполярні нокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N0 8 (тобто, бокові ланцюги (а саме, аланін, валін, лейцин, ізоD2E7 VH CDR1) Райони рамки для VL переважно лейцин, пролін, фенілаланін, метионін, триптоналежать до родини VKI людської зародкової лінії, фан), бета-розгалужені бокові ланцюги (а саме, краще, з гена Vk людської зародкової лінії А20, та треонін, валін, ізолейцин) та ароматичні бокові найкраще, з послідовностей рамки D2E7 VL, золанцюги (а саме, тирозін, фенілаланін, триптофан, бражених на Фіг 1А та 1В Райони рамки для VH пстидін) Переважно, можна робити не більше від переважно належать до родини людської зародкоодної до п'яти замін консервативних амінокислот в вої лінії VH3, краще до VH-гена зародкової людсьдоменах D2E7 VL та/або VH Краще робити не кої лінії DP-31, та найкраще, до послідовностей більше ніж від одної до трьох консервативних амірамки D2E7 VH, зображених на Фіг 2А та 2В нокислот в доменах D2E7 VL та/або VH Додатково, заміни консервативних амінокислот не повинно В іншому втіленні винахід забезпечує ізольоробити в положеннях, критичних для зв'язування з ваними антитілами людини або їх антигенhTNFa Як показано в Прикладі 3, положення 2 та зв'язуючими частинами з варіабельним районом 5 CDR3 D2E7 VL та положення 1 та 7 CDR3 D2E7 легкого ланцюга (LCVR), що включає амінокислотVH виявились критичними для взаємодії з hTNFa, ну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 1 (D2E7 VL), та варіаі, таким чином, заміни консервативних амінокислот бельним районом важкого ланцюга (HCVR), що не робились в даних положеннях (хоча заміна включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 2 аланіна в положенні 5 CDR3 VL D2E7 прийнятна, (D2E7 VH) В певних втіленнях дані антитіла вклюяк описано вище) чають такий константний район важкого ланцюга, як константні райони lgG1, lgG2, IgGS, lgG4, IgA, IgE, IgM або IgD Переважно, константний район ВІДПОВІДНО, В іншому втіленні даний винахід важкого ланцюга є константним районом важкого забезпечує ізольованими антитілами людини або ланцюга lgG1 або lgG4 Більш того, дані антитіла їх антиген-зв'язуючими частинами з наступними можуть включати константний район легкого ланхарактеристиками цюга, що є або каппа або лямбда константним а) дисоціюють з TNFa людини з Ксп 1x10 3 с 1 районом легкого ланцюга Переважно дані антитіабо менше, що визначають за поверхневим резола включають константний район легкого ланцюга нансом плазмону, каппа б) мають домен CDR3 легкого ланцюгу, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO З Навпаки, частина антитіл може бути, наприабо модифіковану SEQ ID NO 3 шляхом одиничної клад, Fab фрагментом або одноланцюговим Fv заміни аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 або 8 або фрагментом шляхом заміни від однієї до п'яти консервативних В інших втіленнях даний винахід забезпечує амінокислот в положеннях 1, 3, 4, 6, 7, 8, та/або 9, ізольованими антитілами людини або їх антигензв'язуючими частинами, що мають 02Е7-родинні в) мають домен CDR3 важкого ланцюга, який VL або VH домени CDR3, наприклад, антитіла або включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 4 їх антиген-зв'язуючі частини з варіабельним райоабо модифіковану SEQ ID NO 4 шляхом одиничної ном легкого ланцюга (LCVR), який має домен заміни аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або CDR3, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, 11 або шляхом заміни від одної до п'яти консерваобрану з групи, яка складається з SEQ ID NO З, тивних амінокислот в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 24 57726 суберат) Такі зшивки можна одержати в Pierce Chemical Company, Rockford, IL Корисними агентами, які можна детектувати, з якими можна зв'язати антитіла винаходу або їх N0 23, SEQ ID N0 24, SEQ ID NO 25 та SEQ ID частини, включають флуоресцентні речовини NO 26, або варіабельним районом важкого ланцюІлюстративні флуоресцентні агенти, які можна дега (HCVR), що має домен CDR3, який включає тектувати, включають флуоресцеїн, флуоресцеїн амінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ, обрані з групи, яка ізотюціанат, родамін, 5-диметиламш-1складається з SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 27, SEQ ID нафталенсульфонил хлорид, фікоерітрин та подіN0 28, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID бні речовини Антитіла можна також зв'язати з N0 31, SEQ ID N0 32, SEQ ID NO 33, SEQ ID ферментами, що можна детектувати, такими, як NO 34 та SEQ ID NO 35 лужна фосфатаза, пероксидаза хріну, глюкозоксидаза та т п Якщо антитіла зв'язують з ферментом, В іншому втіленні даний винахід забезпечує що можна детектувати, їх детектують шляхом дорекомбінантними антитілами людини або їх антидавання додаткових реагентів, які фермент викоген-зв'язуючими частинами, які нейтралізують акристовує для виробки продукту реакції, що можна тивність TNFa людини, але не TNFf3> Переважно, детектувати Наприклад, якщо агент пероксидази антитіла або їх антиген-зв'язуючі частини також хріну, що можна детектувати, присутній, додаваннейтралізують активність TNFa шимпанзе та приня пероксиду водню та діамінобензидину призвонаймні TNFa одного примата, обраний з групи, яка дить до кольорового продукту реакції Антитіла включає TNFa бабуїна, TNFa мавпи, TNFa павіана можна також зв'язати з біотином та детектувати та TNFa резуса Переважно, дані антитіла або їх шляхом непрямого вимірювання зв'язування авіантиген-зв'язуючі частини нейтралізують TNFa дин-стрептавідин людини, шимпанзе та/або іще одного примата в стандартному ДОСЛІДІ in vitro з L929 з ICso 1 х10 8 М II Експресія антитіл або менше, переважно 1 х 10 9 М або менше, та Антитіла винаходу або їх антиген-зв'язуючі ча10 ще краще, 5 х 10 М або менше В одному підвастини можна приготувати шляхом рекомбінантної ріанті реалізації дані антитіла також нейтралізують експресії генів легкого та важкого ланцюгів імуноактивність собачого TNFa, переважно в стандартглобулінів в клітині-хазяїні Для того, щоб провести ному ДОСЛІДІ in vitro з L929 з ICso 1 х 10 7 М або експресію антитіл рекомбінантно, проводять 8 менше, краще 1 х 10 М або менше та, навіть, ще трансфекцію клітини-хазяїна одним або більше краще, 5 х 10 9 М або менше В іншому підваріанті векторами рекомбінантної експреси, які несуть реалізації дані антитіла також нейтралізують актифрагменти ДНК, що кодують легкий та важкий ла5 вність TNFa свині, переважно з ICso 1 х 10 М або нцюги антитіл так, що легкий та важкий ланцюг менше, переважніше, 1 х 10 6 М або менше та ще експресуються в клітині-хазяїні та, переважно, 7 краще 5 х 10 М або менше В іще одному втіленні секретуються в середовище, в якій культивують дані антитіла нейтралізують активність мишачого клітину-хазяїна та з якої можна виділити антитіла 4 TNFa, переважно з ICso 1x10 М або менше та, ще Використовують стандартні методики рекомбінан6 краще, 5 х 10 М та менше тних ДНК для одержання генів важкого та легкого ланцюгів антитіл, інкорпорації цих генів у вектори Антитіла даного винаходу або їх частини морекомбінантної експресії та інтродукції цих вектожуть бути модифіковані або пришиті до іншої фунрів в клітину-хазяїна так, як це описано в кціональної молекули (напр , іншого пептида або Sambrook, Fntsch and Mamatis (eds), Molecular білка) ВІДПОВІДНО, антитіла винаходу або їх частиcloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold ни можуть призначатись для включення дериватів Spring Harbor, N Y , (1989), Ausubel, P M et al та інших модифікованих форм анти-TNFot антитіл (eds) Current Protocols in Molecular Biology, Green людини, описаних тут, включаючи імуноадгезивні Publishing Associates, (1989) та в патенті США № молекули Наприклад, антитіла даного винаходу 4,816, 397 Bossetal або їх частини можна функціонально зв'язувати 23 SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID N0 17, SEQ ID N0 18, SEQ ID N0 19, SEQ ID N0 20, SEQ ID N0 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID (ХІМІЧНИМ зв'язуванням, генетичним плавленням, нековалентним поєднанням або інакше) до однієї або більше молекулярних одиниць, таких як, наприклад, інше антитіло (напр , біспецифічне антитіло або діантитіло), агент, що можна детектувати, цитотоксичний агент, фармацевтичний агент та/або білок чи пептид, що може опосередковувати зв'язування антитіла або його частини з іншою молекулою (такою як район поверхні стрептавідина або вільний поліпстидін) Один з видів похідних антитіл одержують завдяки перехресному зв'язуванню двох або більше антитіл (одного виду або різних видів, наприклад, для створення біспецифічних антитіл) ПІДХОДЯЩІ зшиваючі агенти можуть бути гетеробіфункцюнальні, що мають дві окремі реактивні групи, розділені підходящим спейсером (напр, mмалеімідобензоіл-^пдроксисукцинімідний ефір), або гомобіфункцюнальні (напр, дісукциніміділ Для експресії D2E7 або О2Е7-родинних антитіл спершу одержують фрагменти ДНК, що кодують варіабельні райони легкого та важкого ланцюгів Ці ДНК можна одержати ампліфікацією та модифікацією варіабельних послідовностей легкого та важкого ланцюгів зародкової лінії, використовуючи ланцюгову полімеразну реакцію (PCR) ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК зародкової лінії для генів варіабельних районів легкого та важкого ланцюгів людини ВІДОМІ в рівні техніки (див, напр , базу даних послідовностей зародкової лінії людини "Vbase" , також див Kabat, Е А , et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U S Department of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242, Tomlmson, I M , et al (1992) "The Repertoire of Human Germlme VH Sequences Reveals about Fofty Groups of VH Segments with Different Hypervanable Loops" J Мої Biol 227 776-798, Cox, J P L et al (1994) "A Direc 26 25 57726 tory of Human Germ-line VK Segments Reveals a бельно зв'язаний" в контексті винаходу означає, Strong Bias in Their Usage" Eur J Immunol 24 827що два фрагменти ДНК сполучені так, що аміноки836, зміст кожної з яких точно включений тут шляхом посилання) Для того, щоб отримати фрагмент ДНК, який кодує варіабельний район важкого ланцюгу D2E7 або О2Е7-родинних антитіл, член родини VH3 генів зародкової лінії людини VH ампліфікують в стандартній PCR Переважно, ампліфікують ПОСЛІДОВНІСТЬ зародкової лінії VH DP-31 Для того, щоб одержати фрагмент ДНК, що кодує варіабельний район легкого ланцюгу D2E7 або О2Е7-родинних антитіл, ампліфікують член родини VKI гена людини зародкової лінії VL шляхом стандартної PCR Найкраще, ампліфікують ПОСЛІДОВНІСТЬ А20 VL зародкової лінії Праймери PCR, зручні для використання для ампліфікації ПОСЛІДОВНОСТІ VH зародкової лінії DP-31 та VL зародкової лінії А20, можна створити на основі нуклеотидних послідовностей, вказаних вище як посилання, використовуючи стандартні способи Одержавши фрагменти VL та VH зародкової лінії, можна провести мутацію цих послідовностей так, щоб вони кодували D2E7 або О2Е7-родинні амінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ, ЯКІ тут описані Спочатку амінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ, ЩО кодуються послідовностями ДНК VH та VL зародкової лінії порівнюють з D2E7 або О2Е7-родинними амінокислотними послідовностями VH та VL для ідентифікації тих залишків амінокислот в D2E7 або D2E7родинних послідовностях, які відрізняються від зародкової лінії Потім проводять мутацію по придатних нуклеотидах ПОСЛІДОВНОСТІ ДНК зародкової лінії так, що мутована ПОСЛІДОВНІСТЬ зародкової лінії кодує D2E7 або О2Е7-родинну амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, використовуючи даний генетичний код для дослідження того, які нуклеотидні зміни потрібно зробити Мутагенез послідовностей зародкової лінії проводять стандартними способами, такими як PCR-опосередкований мутагенез (в якому мутовані нуклеотиди інкорпоровані в праймери PCR так, що продукт PCR містить мутації) або сайт-спрямований мутагенез Більш ТОГО, СЛІД сказати, що якщо ПОСЛІДОВНО СТІ "зародкової лінії", отримані шляхом ампліфікації PCR, кодують амінокислотні зміни в районі рамки істинної конфігурації зародкової лінії (тобто, розбіжності в ампліфікованій ПОСЛІДОВНОСТІ порівняно з істинною ПОСЛІДОВНІСТЮ зародкової лінії, наприклад, є результатом соматичної мутації), може бути бажано змінити дані розбіжності амінокислот назад до істинної ПОСЛІДОВНОСТІ зародкової лінії (тобто, "зворотні мутаци" залишків рамки до конфігурації зародкової лінії") При одержанні фрагментів ДНК, що кодують D2E7 або В2Е7-родинні сегменти VH та VL (шляхом ампліфікації та мутагенезу VH та VL генів зародкової лінії, як описано вище), з цими фрагментами ДНК можна маніпулювати завдяки стандартному способу рекомбінантних ДНК, наприклад, для конвертації генів варіабельного району до генів цільно-ланцюгового антитіла, гену Fab фрагменту або гену scFv При цих маніпуляціях фрагменти ДНК, що кодують, VL та VH, операбельно зв'язують з іншим фрагментом ДНК, що кодує інший білок, такий, як константний район антитіла або шарнірна ділянка Термін "опера слотні ПОСЛІДОВНОСТІ, які кодуються даними двома фрагментами ДНК, залишаються в рамці Ізольовану ДНК, яка кодує район VH, можна конвертувати в ген повного важкого ланцюга шляхом операбельного зв'язування з ДНК, що кодує VH, до іншої молекули ДНК, що кодує константні райони важкого ланцюгу (СН1, СН2 та СНЗ) ПОСЛІДОВНОСТІ генів, які кодують константні райони людського важкого ланцюгу, ВІДОМІ В рівні техніки (див, напр , Kabat, E A , et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U S Department of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242) та фрагменти ДНК, що оточують ці райони, можна одержати стандартною ампліфікацією PCR Константний район важкого ланцюгу може бути константним районом lgG1, lgG2, IgGS, lgG4, IgA, IgE, IgM або IgD, але краще lgG1 або lgG4 Для гена важкого ланцюга Fab фрагмента, ДНК, що кодує VH, можна оперативно зв'язати з іншою молекулою ДНК, що кодує тільки константний район СН1 важкого ланцюгу Ізольовану ДНК, яка кодує район VL, можна конвертувати до гена повного легкого ланцюга (як і гена легкого ланцюга Fab), шляхом оперативного зв'язування ДНК, що кодує VL, до іншої молекули ДНК, яка кодує константний район CL легкого ланцюгу ПОСЛІДОВНОСТІ генів константних районів легких ланцюгів людини ВІДОМІ В рівні техніки (див , напр Karat, Е А , et al (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, Fifth Edition, U S Department of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242), та фрагменти ДНК, що оточують ці райони, можна одержати стандартною ампліфікацією PCR Константний район легкого ланцюга може бути каппа або лямбда, але переважно каппа районом Для створення гена scFv фрагменти ДНК, які кодують VL та VH, оперативно зв'язують з іншим фрагментом, який кодує гнучку зв'язку, н а п р , кодує амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ (Глі4-Сер)з так, що ПОСЛІДОВНОСТІ VH та VL можна експресувати в одному білковому ланцюгу, де райони VL та VH сполучаються гнучкою зв'язкою (див, напр , Bird et al , (1988) Science 242 423-426, Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sei USA 85 5879-5883, McCafferty et al , Nature (1990) 348 552-554) Для того, щоб експресувати антитіла винаходу або їх фрагменти, ДНК, що кодує частини або ЦІЛІ легкі та важкі ланцюги, одержані так, як описано вище, поміщають в експресійні вектори так, що ці гени є оперативно зв'язаними з послідовностями контролю транскрипції та трансляції В контексті винаходу термін "оперативно зв'язаний" означає, що ген антитіла поміщений в вектор так, що ПОСЛІДОВНОСТІ контролю транскрипції та трансляції всередині вектора виконують свої належні функції по регуляції транскрипції та трансляції гена антитіла Вектори експресії та ПОСЛІДОВНОСТІ контролю за експресією обирають в залежності від експресії клітини-хазяїна, що використовується Ген легкого ланцюгу антитіла та ген важкого ланцюгу антитіла можна помістити в окремий вектор або, що більш типово, обидва гени поміщають в той самий експресійний вектор Гени антитіл поміщають в екс 28 27 57726 пресійний вектор стандартними способами (напр , селективного маркера надає резистентності до зшиванням комплементарних сайтів рестрикції в ЛІКІВ, таких як G418, пдроміцин або метотрексат, фрагменті гена антитіла та векторі, або зшиванклітин і-хазяїну, в яку був введений даний вектор ням по тупих кінцяхм, якщо немає сайтів рестрикПереважні гени селективних маркерів включають ції) До втручання D2E7 та О2Е7-родинних посліген дипдрофолатредуктази (DHFR) (для викорисдовностей легкого та важкого ланцюгів вектор тання на клітинах-хазяях dhfr з селекціекспресії може вже нести ПОСЛІДОВНОСТІ константєю/ампліфікацією метотрексатом) та ген пео (для них районів антитіл Наприклад, одним з ПІДХОДІВ селекції G418) до конвертації D2E7 та О2Е7-родинних послідовДля експресії легкого та важкого ланцюгів векностей VH та VL до повних генів антитіл є помітор(и) експреси, які кодують важкий та легкий ланщення їх до векторів експреси, що вже кодують цюги, поміщають шляхом трансфекцп в клітинуконстантні райони важкого та легкого ланцюгів, хазяїн стантартними способами РІЗНІ форми терВІДПОВІДНО, таким чином, що сегмент VH є операміну "трансфекція" включають широке різноманіттивно зв'язаним з сегментом(ами) СН в цьому вектя способів, що звичайно використовують для інтторі, та сегмент VL є оперативно зв'язаним з сегродукції екзогених ДНК в прокарютичні або ментом CL в цьому векторі Додатково або еукарютичні клітни-хазяї, а саме, електропорацію, альтернативно, вектор рекомбінантної експресії кальцій-фосфатне осадження, трансфекцію DEAEможе кодувати сигнальний пептид, що сприяє секдекстраном та ІНШІ Хоча теоретично можливо реції ланцюгу антитіла з клітини-хазяїна Ген ланпровести експресію антитіл винаходу або в прокацюгу антитіла можна тонувати у вектор так, що рютичних, або в еукарютичних клітинах-хазяях, даний сигнальний пептид буде зв'язаним в рамці з переважною є експресія антитіл в еукарютичній амінокінцем гена ланцюга антитіла Сигнальний КЛІТИНІ, і найкращою в клітинах-хазяях ссавців, пептид може бути сигнальним пептидом імуноглотому що в таких еукарютичних клітинах та, особбуліну або гетеролопчним сигнальним пептидом ливо, мамілярних клітинах з більшою вірогідністю, (тобто, сигнальним пептидом з білка, що не є імуніж у прокарютичних клітинах, антитіла будуть ноглобуліном) зібрані та секретовані в належним чином згорнутій та імунологічне активній формі Сповіщалось Разом з генами ланцюгів антитіл вектори ре(Boss M A and Wood C R (1985) Immunology Toкомбінантної експресії даного винаходу несуть day 6 12-13), що експресія прокаріотами генів анрегуляторні ПОСЛІДОВНОСТІ, які контролюють екститіл є неефективною для вироблення високої пресію генів ланцюгів антитіла в клітині-хазяїні КІЛЬКОСТІ активних антитіл Термін "регуляторна ПОСЛІДОВНІСТЬ" включає промотори, енхансери та ІНШІ елементи контролю Переважними мамілярними клітинами-хазяями експресії (напр, сигнали поліаденілювання), які для експресії рекомбінантних антитіл винаходу є контролюють транскрипцію або трансляцію генів клітини яєчника китайського хом'яка (СНО-клітини) ланцюгів антитіл Такі регуляторні ПОСЛІДОВНОСТІ (включаючи dhfr-CHO-клітини, описані в Urlaub and описані, наприклад, в Goeddel, Gene Expression Chasm (1980) Proc Natl Acad Sei USA 77 4216Technology Methods in Enzymology 185, Academic 4220, які використовують з DHFR-селективним Press, San Diego, CA (1990) Для спеціалістів в маркером, як напр , описано в R J Kaufman and даній області буде зрозумілим, що дизайн векторів PA Sharp (1982) Мої Б/о/ 159 601-621), клітини експреси, включаючи вибір регуляторної ПОСЛІДОВмієломи NS0, клітини COS та клітини SP2 Якщо НОСТІ, може залежати від таких факторів, як вибір вектори рекомбінантної експреси, які кодують гени клітини-хазяїна, що трансформують, бажаного антитіл, представлені в клітинах-хазяях ссавців, рівня експресії білка, та ш Переважні регуляторні антитіла отримують шляхом культивування клітинПОСЛІДОВНОСТІ для експресії мамілярних клітинхазяїв протягом проміжку часу, що є достатнім для хазяїв включають вірусні елементи, які спрямовуекспресії антитіл в клітинах-хазяях або, краще, ють високий рівень експресії білка в мамілярних секреції антитіл в культуральне середовище, в клітинах, такі як промотори та/або енхансери, що якому вирощують клітини-хазяї Антитіла можна походять з цитомегаловірусів (CMV) (такі як провиділити з культу рал ьного середовища за допомотор/е нхан сер CMV), Вірусу мавпи 40 (SV40) могою стандартних способів очистки білка (такі як промотор/енхансер SV40), аденовірусу Клітини-хазяї також можна використовувати (напр, головний ПІЗНІЙ промотор аденовірусу для одержання частин інтактних антитіл, таких як (AdMLP)) та полюми Для подальшого опису вірусFab фрагменти або scFv молекули Буде зрозуміних регуляторних елементів див патент США № лим, що варіації в описаній вище процедурі знахо5,168,062 Stmski з спів , патент США № 4,510,245 дяться в межах даного винаходу Наприклад, моBell з спів , патент США № 4,968,615 Schaffner з же бути потрібно провести трансфекцію клітиниспів хазяїна ДНК, яка кодує або легкий або важкий ланцюг (але не обидва) антитіл даного винаходу На додаток до генів ланцюгів антитіл та регуМетод рекомбінантних ДНК можна використовуваляторних послідовностей вектори рекомбінантної ти для видалення деяких або усіх ДНК, що кодуекспресії даного винаходу можуть нести додаткові ють один або обидва, легкий та важкий ланцюги, ПОСЛІДОВНОСТІ, такі як ті, що регулюють реплікацію які не є необхідними для зв'язування з hTNFa Мовектора в клітині-хазяїні (напр , оріджини реплікалекули, що експресовані з таких обрізаних молеції) та гени селективних маркерів Ці гени селектикул ДНК, також підпадають під антитіла даного вних маркерів полегшують селекцію клітин-хазяїв, винаходу Додатково, біфункцюнальні антитіла в яких був представлений даний вектор (див можна одержувати шляхом зшивання антитіла напр, патенти США № 4,399,216, 4,634,665 та винаходу з другим антитілом стандартними спосо5,179,017 всі Axel з спів ) Наприклад, звичайно ген 29 бами хімічної зшивання так, що один важкий та один легкий ланцюг є антитілами винаходу, а інший важкий та інший легкий ланцюг є більш специфічними для іншого антигена, ніж hTNFa В переважній системі для рекомбінантної експреси антитіл винаходу або їх антиген-зв'язуючих частин вектор рекомбінантної експреси, який кодує як важкий ланцюг антитіла так і легкий ланцюг антитіла представляють в dhfr-CHO-клітини шляхом кальційфосфат-опосеред кованої трансфекцп У векторі рекомбінантної експресії кожен з генів важкого та легкого ланцюгів антитіла оперативно зв'язаний з регуляторним елементом - енхансером/промотором (напр , з SV40, CMV, аденовірусу та подібного, такий як регуляторний елемент CMV енхансер/AdMLP промотор або SV40 енхансер/AdMLP промотор) для забезпечення високого рівня транскрипції генів Вектор рекомбінантної експресії також несе ген DHFR, який дозволяє проводити селекцію СНО-клітин, які були транфековані вектором, використовуючи селекцію/ампліфікацію метотрексатом Дані відібрані трансформати - клітини-хазяї є культурою, що дозволяє експресію важкого та легкого ланцюгів антитіл та виділення інтактних антитіл з культурального середовища Стандартні молекулярно біологічні способи використовують для приготування векторів рекомбінантної експресії трансфекцм клітини-хазяїна, селекції трансформатов, культивування клітин-хазяїв та виділення антитіл з культурального середовища Виходячи з вищезгаданого, іншим аспектом винаходу є композиції нуклеїнової кислоти, вектора та клітини-хазяїна, які можна використовувати для рекомбінантної експресії антитіл винаходу та їх частин Нуклеотидна ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка кодує варіабельний район легкого ланцюгу D2E7, показано на Фіг 7 та SEQ ID NO 36 Домен CDR1 LCVR включає нуклеотиди 70-102, домен CDR2 включає нуклеотиди 148-168 та домен CDR3 включає нуклеотиди 265-291 Нуклеотидна ПОСЛІДОВНІСТЬ, яка кодує варіабельний район важкого ланцюгу D2E7, зображена на Фіг 8 та SEQ ID NO 37 Домен CDR1 HCVR включає нуклеотиди 91-105, домен CDR2 включає нуклеотиди 148-198 та домен CDR3 включає нуклеотиди 295-330 Спеціалістам в цій галузі буде очевидним, що нуклеотидні ПОСЛІДОВНОСТІ, що кодують О2Е7-родинні антитіла або їх частини (напр , такий домен CDR, як CDR3) можна одержати з нуклеотидних послідовностей, що кодують LCVR та HCVR D2E7, використовуючи генетичний код та стандартний способи молекулярної біологи В одному втіленні винахід забезпечує ізольованою нуклеїновою кислотою, яка кодує домен CDR3 легкого ланцюгу, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N 0 3 (напр , D2E7 VL CDR3), або SEQ ID NO 3, модифіковану заміною одного аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 або 8 заміною від однієї до п'яти консервативних амінокислот в положеннях 1, 3, 4, 6 7, 8 та/або 9 Ця нуклеїнова кислота може кодувати тільки район CDR3, або, більш переважно, кодує варіабельний район легкого ланцюгу повного антитіла (LCVR) Наприклад, нуклеїнова кислота може кодувати LCVR, який має домен CDR2, що включає амінокислотну послідо 57726 30 вність SEQ ID N 0 5 (напр , D2E7 VL CDR2) та домен CDR1, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N 0 7 (напр , D2E7 VL CDR1) В іншому втіленні винахід забезпечує ізольованою нуклеїновою кислотою, яка кодує домен CDR3 важкого ланцюга, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID N 0 4 (напр , D2E7 VH CDR3), або SEQ ID NO 4, модифіковану заміною одного аланіну в положенні 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 або 11 заміною від одної до п'яти консервативних амінокислот в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 та/або 12 Ця нуклеїнова кислота може кодувати тільки район CDR3, або, краще, кодує варіабельний район легкого ланцюгу повного антитіла (HCVR) Наприклад, нуклеїнова кислота може кодувати HCVR, яка має домен CDR2, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 6 (напр , D2E7 VH CDR2) та домен CDR1, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 8 (напр , D2E7VHCDR1) В ще одному втіленні винахід забеспечує ізольованими нуклеїновими кислотами, які кодують О2Е7-родинний домен CDR3, який включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ, що обрана з групи, яка складається з SEQ ID NO З, SEQ ID NO 4, SEQ ID N 0 11, SEQ ID N 0 12, SEQ ID N 0 13, SEQ ID N 0 14, SEQ ID N 0 15, SEQ ID N 0 16, SEQ ID N 0 17, SEQ ID N 0 18, SEQ ID N 0 19, SEQ ID N 0 20, SEQ ID N 0 21, SEQ ID NO 22, SEQ ID N 0 23, SEQ ID N 0 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID N 0 26, SEQ ID N 0 27, SEQ ID NO 28, SEQ ID N 0 29, SEQ ID NO 30, SEQ ID N 0 31, SEQ ID N 0 32, SEQ ID N 0 33, SEQ ID NO 34 та SEQ ID N 0 35 В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольовану нуклеїнову кислоту, яка кодує варіабельний район легкого ланцюга антитіла, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 1 (тобто, D2E7 LCVR) Переважно ця нуклеїнова кислота включає нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 36, однак спеціалісту буде зрозуміло, що внаслідок виродження генетичного коду амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 1 можуть кодувати ІНШІ нуклеотидні ПОСЛІДОВНОСТІ Дана нуклеїнова кислота може кодувати тільки LCVR або може також кодувати константний район легкого ланцюга антитіла, оперативно зв'язаний з LCVR В одному з втілень дана нуклеїнова кислота знаходиться в векторі рекомбінантної експресії В ще одному втіленні даний винахід забезпечує ізольованою нуклеїновою кислотою, яка кодує варіабельний район важкого ланцюгу антитіла, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 2 (тобто, D2E7 HCVR) Переважно ця нуклеїнова кислота включає нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 37, однак спеціалісту буде зрозуміло, що внаслідок виродження генетичного коду амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 2 можуть кодувати ІНШІ нуклеотидні ПОСЛІДОВНОСТІ Дана нуклеїнова кислота може кодувати тільки HCVR або може також кодувати константний район важкого ланцюга антитіла, оперативно зв'язаний з HCVR Наприклад, така нуклеїнова кислота може включати константний район lgG1 та lgG4 В одному з втілень дана нуклеїнова кислота знаходиться в векторі рекомбінантної експресії 31 Даний винахід також забезпечує векторами рекомбінантної експреси, які кодують як важкі, так і легкі ланцюги антитіл Наприклад, в одному втіленні даний винахід забезпечує вектором рекомбінантної експреси, який кодує а) легкий ланцюг антитіла, що має варіабельний район, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 1 (тобто, D2E7 LCVR), та б) важкий ланцюг антитіла, що має варіабельний район, що включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ SEQ ID NO 2 (тобто, D2E7 HCVR) Даний винахід також забезпечує клітинухазяїна, в якій представлені один або більше векторів рекомбінантної експресії Переважно, клітина-хазя'ш є мамілярною клітиною, ще краще - клітиною СНО, NSO або COS Далі даний винахід забезпечує способом синтезу рекомбінантного людського антитіла даного винаходу шляхом культивації клітини-хазяїна винаходу в прийнятному культуральному середовищі до тих пір, поки синтезується рекомбінантне антитіло людини для цього винаходу Спосіб надалі включає виділення рекомбінантного антитіла людини з культурального середовища III Селекція рекомбінантних антитіл людини Рекомбінантні антитіла людини для цього винаходу, як і D2E7T3 О2Е7-родинні антитіла, що тут описуються, можна одержати при скрінінгу комбінаторної бібліотеки рекомбінантних антитіл, переважно бібліотеки фага scFv, одержаної з використанням ДНК людини VL та VH, що одержують з мРНК, яка походить з лімфоцитів людини Спосіб одержання та скринування такої бібліотеки ВІДОМІ в рівні техніки На додаток до комерційне доступних наборів для одержання бібліотек фапв (напр , the Pharmacia Recombmant Phage Antibody System, catalog No 27-9400-01, Stratagene SurfZAP tm phage display kit, catalog no 240612), приклади способів та реагентів, особливо підходящих для одержання та скрикування бібліотек антитіл, можна знайти, наприклад, в Lander et al , US Patent No 5,223,409, Kang et a l , PCT Publication No 57726 32 людини, що мають подібну зв'язуючу активність до hTNFa, використовуючи епітопні відбитки або спрямовану селекцію, способи, описані в Hoogenboom et al , PCT Publ No W O 93/06213 Бібліотеки антитіл, що використовуються в цих способах, є переважно scFv бібліотеками, які одержані та скриновані так, як описано в McCafferty et al PCT Pub No W O 92/01047, McCafferty et a l , Nature (1990) 348 552-554, Griffiths et al (1993) EMBO J 12 725-734 Бібліотеки scFv антитіл переважно скринують, використовуючи рекомбінантний TNFa людини як антиген При відборі вихідних сегментів VL та VH людини проводять експерименти "змішування та підбір" ("mix and match"), в якому спершу обираються різні пари сегментів VL та VH та скринуються на зв'язування з hTNFa, для вибору переважної комбінації пари VL/VH Додатково, для подальшого покращення афінності та/або зниження константи спаду швидкості для зв'язування hTNFa, можна викликати мутацію в сегментах VL та VH переважних пар VL/VH, переважно, в районі CDR3 VH та/або VL, способом, аналогічним процесу соматичної мутації in vivo, що відповідає за афінне дозрівання антитіл під час природної імунної ВІДПОВІДІ Таке афінне дозрівання in vitro може супроводжуватись ампліфікацією районів VH та VL, використовуючи праймери PCR, комплементарні VH CDR3 та VL CDR3, ВІДПОВІДНО, чиї праймери були "причеплені" до випадкової суміші нуклеотидних основ в певних позиціях так, що кінцеві продукти PCR кодують сегменти VH та VL, в яких були представлені випадкові мутації в районах CDR3 VH та/або VL Такі випадково мутовані сегменти VH та VL можна рескринувати ,на зв'язування з hTNFa та можна відібрати ПОСЛІДОВНОСТІ, ЯКІ демонструють високу афінність та низьку швидкість спаду для зв'язування з hTNFa АМІНОКИСЛОТНІ ПОСЛІДОВНОСТІ легких та важких W O 92/18619, Dower et al , PCT Publication No W O 91/17271, Winter et al PCT Publ No W O 92/20791, Markland et al , PCT Pub No WO 92/15679, Breitlmg et al , PCT Publ No WO 93/01288, McCafferty et al PCT Pub No WO 92/01047, Garrard et al , PCT P , No W O 92/09690, Fuchs et al , (1991) Bio/Technology 9 1370-1372, Hay et al (1992) Hum Antibod Hybndomas 3 81-85, Huse et al , (1989) Science 240 1275-1281, McCafferty et al , Nature (1990) 34B 552-554, Griffiths et al (1993) EMBO J 12 725-734, Hawkins et al , (1992) J Мої, Biol 226 889-896, Clackson et a l , (1991) Nature 352 624-628, Gram et al (1992) PNAS Ш 3576-3580, Garrad et al (1991) Bio/Technology 9 1373-1377, Hoogenboom et al , (1991) Nuc Acid Res 15 41334137, B a r b a s e t a l , (1991) PNAS 88 7978-7982 ланцюгів обраних антитіл можна порівнювати з амінокислотними послідовностями легких та важких ланцюгів антитіл зародкової лінії У випадках, коли певні залишки рамки обраних ланцюгів VL та VH відрізняються від конфігурації зародкової лінії (напр , внаслідок соматичної мутації генів імуноглобуліну, що використовуються для одержання бібліотеки фапв), може бути бажано "зворотньо мутувати" ("backmutate") змінені залишки рамки обраних антитіл до конфігурації зародкової лінії (тобто, змінити амінокислотні ПОСЛІДОВНОСТІ рамки обраних антитіл так, щоб вони були ідентичні амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ рамки зародкової лінії") Таку "зворотню мутацію" (або "germlinmg") залишків рамки можна здійснити за допомогою стандартних молекулярно-біологічних способів для внесення специфічних мутацій (напр, сайтспрямований мутагенез, PCR-опосеред кований мутагенез та подібне) В переважному втіленні для виділення антитіл людини з високою афінністю та низькою константною спаду швидкості для hTNFa, спершу використовували мишачі анти-hTNFa антитіла, що мають високу афінність та низьку константу спаду швидкості для hTNFa ( н а п р , МАК 195, пбридома яких має депозитний номер ЕСАСС 87 050801), для селекції послідовностей важких та легких ланцюгів Після скрінінгу та виділення анти-hTNFa антитіл винаходу з бібліотеки рекомбінантних імуноглобулінів можна одержати з пакету даних нуклеїнову кислоту, яка кодує обране антитіло (напр , з геному фапв) та субклонувати в інший експресійний вектор стандартним способом рекомбінантних ДНК При бажанні дану нуклеїнову кислоту можна надалі використовувати для створення інших 34 33 57726 форм антитіл винаходу (напр , прив'язати їх до редовище та ІНШІ необхідні інгредієнти з вказаних нуклеїнової кислоти, що кодує додаткові домени вище В разі стерильних порошків для приготуванімуноглобулінів, такі як додаткові константні районя стерильних розчинів для ІН'ЄКЦІЙ переважними ни) Для експресії рекомбінантного антитіла людиспособами одержання є вакуумне висушування та ни, виділеного при скринуванні комбінаторної біблюфілізація, яка дає порошок активного інгредієнліотеки, ДНК, що кодує антитіло, клонують в та плюс будь-який додатковий бажаний інгредієнт вектор рекомбінантної експресії та поміщають в з передчасно стерилізованого фільтруванням його мамілярну клітину-хазяїна, як описано більш детарозчину Густину, властиву розчину, можна встально в РОЗДІЛІ II вище новити, наприклад, при використанні покриття, такого як лецитин, встановленні належного розміIV Фармацевтичні композиції та фармацевтиру частинок в разі дисперсії та використанні сурчне уведення фактантів Пролонгованого всмоктування компоАнтитіла винаходу та їх частини можна помісзицій для ІН'ЄКЦІЙ можна досягти включенням до тити в фармацевтичні композиції, зручні для увекомпозиції агента, який затримує всмоктування, дення суб"єкту Звичайно, така фармацевтична наприклад, солей моностеарату та желатину композиція включає антитіло винаходу або його частину та фармацевтичне прийнятний носій ТеАнтитіла винаходу та їх частини можна уводирмін "фармацевтичне прийнятний носій" включає ти різними способами, відомими з рівня техніки, будь-який та всі розчинники, дисперсійне середооднак, для багатьох терапевтичних використань вище, оболонку, антибактеріальні та антигрибкові переважним шляхом/способом уведення є внутріагенти, ІЗОТОНІЧНІ та пролонгуючі абсорбцію агенти шньовенна ІН'ЄКЦІЯ або інфузія Як буде зрозуміло та таке ш , що є фізіологічне сумісним Приклади спеціалісту в цій галузі, шлях/спосіб уведення буде фармацевтичне прийнятних носив включають залежати від бажаного результату В певних втіодин або більше з наступних вода, фізіологічний леннях активний компонент можна приготувати з розчин, забуферений фосфатом фізіологічний носієм, який буде захищати цю речовину від швидрозчин, декстроза, гліцерин, етанол, та таке ш , а кого вивільнювання, як композиція з контрольоватакож їх комбінації В багатьох випадках буде ним вивільненням, включаючи трансплантати, краще включати ІЗОТОНІЧНІ агенти, наприклад, цуктрансдермальний пластир та мікрокапсульовані ри, поліспирти, такі як манітол, сорбітол, або хлосистеми уведення Можуть бути використані такі рид натрію, в дану композицію Фармацевтично бюдеградуючі бюсумісні полімери, як етиленвініприйнятні носи можуть надалі включати мінорну лацетат, поліанпдриди, полігліколева кислота, КІЛЬКІСТЬ допоміжних речовин таких, як агенти, що колаген, полюртоефіри та полімолочна кислота набухають, емульгатори, консерванти або буфери, Спеціалістам відомо багато способів одержання що подовжують строк зберігання або ефективність таких композицій Див , наприклад, Sustained and даних антитіл або їх частин Controlled Release Drug Delivery Systems, J R Robinson Ed, Marcel Dekker, Inc , New York, 1978 Композиція даного винаходу може знаходитись в різних формах Вони включають, наприВ певних втіленнях антитіла винаходу або їх клад, рідку, напівтверду та тверду форми, такі як частини можна уводити орально, наприклад, з рідкий розчин (напр, розчин для ІН'ЄКЦІЙ та тугопінертним розріджувачем або їстівним носієм, що лавкий розчин), дисперсії та суспензії, таблетки, засвоюється Речовину (та ІНШІ інгредієнти, при ПІЛЮЛІ, порошки, ліпосоми та супозіторм Переважбажанні) можна помістити в тверді желатинові кана форма залежить від майбутнього шляху увепсули, спресувати в таблетки або безпосередньо дення та терапевтичного використання Типовими включити в індивідуальну дієту Для орального переважними композиціями є розчини для ІН"ЄКЦІЙ терапевтичного уведення речовину можна інкорта інфузм, композиції, схожі на ті, що використовупорувати з інертним наповнювачем та використоють для пасивної імунізації людей іншими антитівувати у формі неперетравлюваних таблеток, болами Переважним шляхом уведення є парентекальних (ротових) таблеток, пастилок, капсул, ральний (тобто, внутришньовено, підшкірно, еліксирів, суспензій, сиропів, облаток та т п Для штраперитонеально, внутрішньом'язово) В переуведення речовини винаходу ВІДМІННИМ ВІД паренважному втіленні антитіла уводять внутрішньовентерального шляхом може бути необхідно покрити ною ІН'ЄКЦІЄЮ або інфузією В іншому переважному речовину матеріалом, або уводити разом з нею втіленні антитіла уводять внутрішньом'язово або матеріал для запобігання II інактивації підшкірно Додаткові активні речовини також можна Звичайно, терапевтичні композиції повинні бути стерильними та стабільними в умовах виробництва та зберігання Композицію можна виробляти як розчин, мікроемульсію, дисперсію, ліпосоми або іншу впорядковану структуру, зручну для високих концентрацій ЛІКІВ Стерильні розчини для ІН'ЄКЦІЙ можна приготувати шляхом включення активного компонента (напр , антитіла або частин антитіла) в належній КІЛЬКОСТІ в підходящому розчиннику з одним або комбінацією інгредієнтів, вказаних вище, що є необхідними, після стерилізації фільтрацією Загалом, дисперсії готують шляхом включення активної речовини в стерильний засіб транспорту, який містить основне дисперсійне се включати в такі композиції В певних втіленнях антитіла винаходу або їх частини готують разом або^а уводять разом з одним або більше додатковим терапевтичним агентом, який є корисним для лікування розладів, в яких активність TNFa є небажаною Наприклад, анти-hTNFa антитіла винаходу або їх частини можна одержувати або^а уводити разом з одними або більше додатковими антитілами, які зв'язують ІНШІ мішені (напр , антитіла, що зв'язують ІНШІ цитокіни або зв'язують молекули поверхні клітин),ОДНИМ або більше цитокінами, розчинним рецептором TNFa ( див , напр , публікацію РСТ № WO 94/06476) та/або одним або більше ХІМІЧНИМИ агентами, які інгібують виробку 35 TNFa або його активність (такі як циклогексаніліден ПОХІДНІ, як описано в публікації РСТ № W O 93/19751) Більш ТОГО, ОДИН ВИД або більше антитіл даного винаходу можна використовувати в комбінації з двома або більше попередніми терапевтичними агентами При такій комбінованій терапії можна переважно використовувати більш низькі дози терапевтичних агентів, що уводять, таким чином запобігаючи можливій токсичності або ускладненням, пов'язаним з різними монотерапіями Необмежені приклади терапевтичних агентів для ревматоїдного артриту, з якими антитіла винаходу або їх частини можна комбінувати, включають наступні нестероідні протизапальні ЛІКІ (NSAID), цитокш-супресивні анти-запальні ЛІКІ (CSAID), CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені антиTNFa антитіла, Celltech/Baveh cA2 (химерні антиTNFa антитіла, Centocor), 75кДа TNFR-IgG (75кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок, Immunex, д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1994) Vol 37, S295, J Invest Med (1996) Vol 44, 235A), 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор-lgG плавлений білок, Hoffmann-LaRoche), IDEC-CE9 1/SB 210396 (не виснажені приматизовані анти-СО4 антитіла, IDEC/SmithKhne, див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1995) Vol 38, S185), DAB 486-IL-2 та/або DAB 389-IL-2 (IL-2 плавлені білки, Seragen, див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1993) Vol 36, 1223), анти-Тас (олюднені aHTH-IL-2Ra, Protein Design Labs/Roche), IL-4 (анти-запальний цитокін, DNAX/Schenng), IL-10 (SCH 52000, рекомбінантний IL-10 (анти-запальний цитокін, DNAX/Schenng), антагоністи IL-4, IL-10 та/або IL-4 (наприклад антитіла агоністи), IL-1RA (антагоніст рецептора IL-1, Synergen/Amgen), TNF-bp/s-TNFR (розчинний TNFзв'язуючий білок, див, наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S284, Amer J Physiol Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol 268, pp 37-42), R973401 (інгібітор типу IV фосфодіестерази, д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S282), MK-966 (інгібітор СОХ-2, див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S81), їлопрост (lloprost) (див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S82), метотрексат талідомід (див, наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S282) та ліки групи талідоміду (напр , Целген, celgen), лефлюнамід (анти-запальний та цитокіновий інгібітор, д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S131, Inflamation Research (1996) Vol 45, pp 103107), транексамінова кислота (інгібітор активації плазміногену, див „наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S284), T-614 (інгібітор цитокшу, д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S282), простагландін Е1 (див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S282), Тенідап (нестероідні анти-запальні ліки, д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S280), Напроксен (нестероідні протизапальні ліки, див , наприклад, Neuro Report (1996) Vol 7, pp 1209-1213), Мелоксікам (нестероідні протизапальні ліки), Ібупрофен 57726 36 (нестероідні протизапальні 39 ліки), Пероксикам (нестероідні протизапальні ліки), Діклофенак (не стероїдні протизапальні ліки), Індометацин (нестероїдні протизапальні ліки), Сульфазалазин (див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S281), Азатюприн ( д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S281), ICE інгібітор (інгібітор фермента, конвертуючого інтерлейкш-1р), zap-70 та/або Ick інгібітор (інгібітор тирозін-кінази zap-70 або Іск), інгібітор VEGF та/або VEGF-R (інгібітори фактора росту васкулярних ендотеліальних клітин або рецептора фактора росту васкулярних ендотеліальних клітин, інгібітори анпогенезу), кортикостероїдні протизапальні ліки (напр, SB203580), інгібітори TNF-конвертази, 3 H T H - I L - 1 2 антитіла, штерлейкін11 ( д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S296), інтерлейкш-13 (див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S308), інгібітори штерлейкіна-17 ( д и в , наприклад, Artntis & Rheumatism (1996) Vol 39, No 9 (supplement), S120), золото, пеніциламш, хлорохін, пдроксихлорохін, хлорамбуцил, циклофосфамід, циклоспорин, загальне лімфоідне опромінювання, антитимоцітний глобулін, анти-СО4 антитіла, CD5-TOKCHHH, пептиди, що уводять орально, та колаген, динатрієвии лобензарит, Цитокін регулюючі агенти (CRAs) HP228 та НР466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc), ICAM-1 антисмислові фосфортюатні олігодезоксинуклеотиди (ISIS 2302, Isis Pharmaceuticals, Inc), розчинний рецептор комплемента 1 (ТР10, Т Cell Sciences, Inc), преднізолон, орготеш, глюкозамшогліканполісульфат, міноциклін, 3HTH-IL2R антитіла, морські та ботанічні ЛІПІДИ (жирні кислоти риб та рослинного насіння, д и в , напр, DeLuca et al (1995) Rheum D/s Clm North Am 21 759-777), ауранофін, фенілбутазон, меклофенамшова кислота, флуменамшова кислота, внутришньовенний імуноглобулін, зілейтон, мікофенолієва кислота (RS061443), такролімус (FK-506), сіролімус (рапаміцин), аміпрілоза (терафектин), кладрібін (2хлордезоксиаденозин) та азарібін Необмеженими прикладами терапевтичних агентів для захворювань запалень кишкового тракту, з якими можна комбінувати антитіла винаходу або їх частини, є такі буденозид, фактор епідермального росту, кортикостероїди, циклоспорин, сульфазалазін, 6-меркаптопурин, азатюрш, метронідазол, Інгібітори ліпоксигенази, мезаламш, олсазалін, бальзалазід, антиоксиданти, інгібітори тромбоксану, антагоністи рецептора IL-1, анти-IL1(3 моноклональні антитіла, 3HTH-IL-6 моноклональні антитіла, фактори росту, інгібітори еластази, сполуки пірідиніл-імідазолу, CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNFa антитіла, Celltech/Вауег), сА2 (химерні анти-TNFa антитіла, Centocor), 75кДа TNFR-IgG (75кДа TNF рецептор -IgG плавлений білок, Immunex, див , наприклад, Artntis & Rheumatism (1994) Vol 37, S295, J Invest Med (1996) Vol 44, 235A), 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор IgG плавлений білок, Hoffmann-LaRoche), інтерлейкш-10 (SCH 52000, Schenng Plough), IL-4, агоністи IL-10 та/або IL-4 (напр , антитіла - агоністи), штерлейкін-11, глюкоронід-або декстранкон'юговані преліки преднізолону, дексаметазону 38 37 57726 або будезоніду, ІСАМ-1 антисмислові фосфоротіреспіраторного дистрес-синдрому дорослих, з оатні олігодезоксинуклеотиди (ISIS 2302, Isis якими можна комбінувати антитіла винаходу, або Pharmaceuticals, Inc), розчинний рецептор коплеїх частини, включають наступні анти-ІІ-8 антитіла, мента 1 (ТР10, TCell Sciences, Inc), мезалазін, що сурфактант заміщуюча терапія, CDP-571/BAY-10повільно вивільнюється, метотрексат, антагоністи 3356 (олюднені анти-TNFa антитіла, Cellфактору активації тромбоцитів (PAF), ципрофлокtech/Bayer), сА2 (химерні анти-TNFa антитіла, Cenсацин та лігнокаш tocor), 75кДа TNFR-IgG (75кДа TNF рецептор-lgG плавлений білок, Immunex, див , наприклад, Artntis Необмежені приклади терапевтичних агентів & Rheumatism (1994) Vol 37, S295, J Invest Med для множинного склерозу, з якими антитіла вина(1996) Vol 44, 235A), 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF ходу або їх частини можна комбінувати, включарецептор -IgG плавлений білок, Hoffmannють такі кортикостероїди, преднізолон, метил LaRoche) преднізолон, азатюпрін, циклофосфамід, циклоспорин, метотрексат, 4-амінопіридин, тіназідин, Використання антитіл винаходу або їх частин в інтерферон-р1а (AvonexTM, Biegen), штерферонкомбінації з іншими терапевтичними агентами об[31b (BetaseronTM, Chiron/Berlex), Сополімер 1 говорюється надалі в підрозділі IV/ (Cop-1, CopaxoneTM, Teva Pharmaceutical IndustФармацевтичні композиції даного винаходу ries, Inc), гіпербаричний косень, внутришньовенможуть включати "терапевтично ефективну КІЛЬний імуноглобулін, клабрінін, CDP-571 /BAY-10КІСТЬ" або "профілактично ефективну КІЛЬКІСТЬ" 3356 (олюднені анти-TNFa антитіла, Cellантитіл винаходу або їх частин "Терапевтичне tech/Bayer), сА2 (химерні анти-TNFa антитіла, Сепефективною КІЛЬКІСТЮ" називається КІЛЬКІСТЬ, ЩО Є tocor), 75кДа TNFR-IgG (75кДа TNF рецептор-lgG ефективною в необхідних дозах та періодах часу плавлений білок, Immunex, див , наприклад, Artntis для досягнення бажаного терапевтичного резуль& Rheumatism (1994) Vol 37, S295, J Invest Med тату Терапевтичне ефективна КІЛЬКІСТЬ антитіл (1996) Vol 44, 235A), 55кДа TNFR-IgG (55кДа TNF або їх частин може змінюватись в залежності від рецептор -IgG плавлений білок, Hoffmannтаких факторів, як стан хвороби, вік, стать та вага LaRoche), інтерлейкін-10 (SCH 52000, Schenng індивіда, а також здібності антитіл або їх частин Plough), IL-4, агоністи IL-1 Ота/або IL-4 (напр, анвикликати бажану ВІДПОВІДЬ у індивіда При тератитіла - агоністи) певтичне ефективній КІЛЬКОСТІ небажані ефекти антитіл або їх частин перекриваються терапевтичБезліч прикладів терапевтичних агентів для ним позитивним ефектом "Профілактично ефексепсісу, з якими можна комбінувати антитіла винативною КІЛЬКІСТЮ" називається КІЛЬКІСТЬ, ефективходу, або їх частини, включають наступні гіпертона в дозах та періодах часу, необхідних для нічний фізіологічний розчин, антибіотики, внутрішдосягнення бажаного профілактичного результату ньовенний гамма глобулін, тривала Звичайно, оскільки профілактичні дози використогемофільтрація, вують у пацієнта до або на ранніх стадіях захвокарбапенеми (а саме, меропенем), такі антарювання, профілактично ефективна КІЛЬКІСТЬ буде гоністи ЦИТОКІНІВ, як TNFa, IL-1 [З, IL-6 та/або IL-8, менше, ніж терапевтично ефективна КІЛЬКІСТЬ CDP-571/BAY-10-3356 (олюднені анти-TNFa антитіла, Celltech/Вауег), сА2 (химерні анти-TNFa антиДозовий режим можна впорядкувати для затіла, Centocor), 75кДа TNFR-IgG (75кДа TNF ребезпечення оптимальної бажаної ВІДПОВІДІ (тобто, цептор-lgG плавлений білок, Immunex, див, терапевтичної або профілактичної ВІДПОВІДІ) Нанаприклад, Artntis & Rheumatism (1994) Vol 37, приклад, можна уводити одну таблетку, кілька S295, J Invest Med (1996) Vol 44, 235A), 55кДа окремих доз через певний час, або дозу можна TNFR-IgG (55кДа TNF рецептор -IgG плавлений пропорційно знизити або підвищити, як того побілок, Hoffmann-LaRoche), Цитокін регулюючі агентребує терапевтична ситуація Особливо зручно ти (CRAs) НР228та НР466 (Houghten Pharmaceutiготувати парентеральні композиції в одиничній cals, Inc), SK & F 107647 (низькомолекулярний дозованій формі для простого уведення та уніфіпептид, SmithKlme Beecham), чотирьох-валентний кації дозування Дозованою формою в рамках вигуанілпдразон CNI-1493 (Picower Institute), інгібітор находу називається фізично дйіжретні одиниці, що тканинного фактора шляху (TFPI, Chiron), PHP підходять для одиничного дозування ссавців, яких (ХІМІЧНО модифікований гемоглобін, APEX Biosлікують, причому кожна одиниця містить передбаcience), хелатоутворювачі та хелати заліза, включену КІЛЬКІСТЬ активного компонента, розрахованочаючи комплекс диетилентриамш пентаоцтова го для одержання терапевтичного ефекту, в комкислота - залізо (III) (DTPA залізо (III), Mohchem плексі з потрібним фармацевтичним носієм Medicines), лізофілін (синтетичний низькомолекуСпецифікація дозованих форм винаходу диктуєтьлярний метилксантин, CeJJ Therapeutics, Inc), ся та прямо залежить від (а) унікальних характеPGG-глюкан (водорозчинний [31,3 глюкан, Alphaристик активної речовини та особливостей тераBeta Technology), аполіпопротеш А-1, відновленпевтичного або профілактичного ефекту, що ний ліпідами, хіральні пдроксамові кислоти (синтепотрібно досягти, та (б) обмежень, властивих датичні бактеріциди, які інгібують біосинтез ліпіда А), ній області, для включення такої активної речовианти-ендотоксинові антитіла, Е5531 (синтетичний ни для лікування чутливості ІНДИВІДІВ антагоніст ліпіда A, Eisai America, Inc), rBPbi (peНаприклад, необмежені рамки для терапевтикомбінантний N-кшцевий фрагмент людського бакчної або профілактичної КІЛЬКОСТІ антитіл винаходу терицидного/підвищуючого проникливість білка) та або їх частин є 0,1-20мг/кг, краще 1-10мг/кг Слід синтетичні анти-ендотоксинні пептиди (SAEP, Вюсказати, що величина дози може змінюватись в sYnth Research Laboratories) залежності від типу та тяжкості стану, який треба зняти Далі буде зрозумілим, що для багатьох Безліч прикладів терапевтичних агентів для 40 39 57726 особливих пацієнтів специфічний режим доз повикому організмі або інших мамілярних об'єктах, які нен бути підібраний протягом часу, ВІДПОВІДНОГО мають TNFa, з якими перехресно реагують антитііндивідуальній потребі, а професійний вибір при ла винаходу (а саме, шимпанзе, бабуїна, мавпи, підборі та уведенні композицій, та рамки доз, попавіана та резуса, свині або миші) В одному з втіміщених далі, є тільки прикладами без обмежень лень даний винахід забезпечує способом інгібумасштабу та практики композицій формули вання активності TNFa, який включає контактування TNFa з антитілами винаходу або їх частинами IV Використання антитіл винаходу так, що інгібується активність TNFa Переважно, Внаслідок своєї здатності зв'язувати hTNFa, TNFa є TNFa людини Наприклад, в культуральне анти-hTNFa антитіла винаходу або їх частини мосередовище культури клітин, яка містить або може жна використовувати для детекцм hTNFa (напримістити TNFa, можна додати антитіла винаходу клад, в біологічних пробах, таких, як сироватка та або їх частини для інгібування активності TNFa плазма), використовуючи традиційний імуноаналіз, такий як твердофазний імуноферментний аналіз В іншому втіленні винахід забезпечує спосіб (ELISA), радюімуноаналіз (RIA) або тканинну імуінгібування активності TNFa у суб'єкта, що стражНОПСТОХІМІЮ Винахід забезпечує способом визнадає на розлад, при якому активність TNFa є згубчення hTNFa в біологічних пробах, що включає ною TNFa залучений в патофізіологію багатьох контактування біологічної проби з антитілами вирозладів (див , напр , Moeller, A , et аі (1990) Cytoнаходу або їх частинами та детекцію або антитіл kme 2 162-169, Патент США No 5,231,024 Moeller (або їх частин), зв'язаних з hTNFa, або незв'язаних et аі , Європейська Патентна публікація No 260 антитіл (або частин антитіл), за допомогою чого 610 Moeller et аі) Даний винахід забезпечує сподосліджують hTNFa в біологічних пробах Антитіла соби для уведення суб'єкту антитіл винаходу або прямо чи непрямо мітять речовиною, яку можна їх частин так, що активність TNFa у суб'єкта інгібуспостерігати, для полегшення детекцм зв'язаних та ється Переважно, TNFa є TNFa людини, а суб'єкт незв'язаних антитіл Зручні речовини, що можна є людиною Суб'єкт, навпаки, може бути ссавцем, спостерігати, включають різноманітні ферменти, який експресує TNFa, з яким перехресно реагують простатичні групи, флуоресцентні матеріали, люантитіла винаходу Надалі суб'єкт може бути ссавмінесцентні матеріали та радіоактивні матеріали цем, якому уводили hTNFa (напр, уведенням Приклади зручних ферментів включають пероксиhTNFa, або експресією трансгенного hTNFa) Андазу хріну, лужну фосфатазу, (і-галактозид аз у або титіла винаходу можна уводити людині з терапевацетилхолінестеразу, приклади зручних комплектичними цілями (обговорюється далі) Більш того, сів простатичних груп включають стрептавіантитіла винаходу можна уводити ссавцю, що не є дин/бютин та авідин/бютин, приклади зручних людиною, який експресує TNFa, з яким перехресфлуоресцентних матеріалів включають умбелліно реагують дані антитіла (напр , примати, свиня ферон, флуоресцеїн, флуоресцеїн ізоціанат, роабо миша) для ветеринарних цілей або в твариндамін, діхлортриазініламш флуоресцеїн, дансіл них моделях людських хвороб Відносно останньохлорид або фікоерітрин, приклади люмінісцентинх го, такі тваринні моделі можуть бути корисними матеріалів включають люмінол, приклади зручних для дослідження терапевтичної ефективності анрадіоактивних матеріалів включають 1 І, 1 1 І, 3 5 S титіл винаходу (напр , дослідженням доз та курсу та 3 Н уведення) Альтернативно до мічення данних антитіл hTNFa можна дослідити в біологічній рідині конкурентним імуноаналізом, використовуючи стандарти hTNFa, помічені речовиною, що можна спостерігати, та немічені анти-hTNFa антитіла В даному ДОСЛІДІ сполучають біологічну пробу, мічені стандарти rhTNFa та анти-hTNFa антитіла та вимірюють КІЛЬКІСТЬ мічених стандартів rhTNFa, зв'язаних з неміченими антитілами КІЛЬКІСТЬ hTNFa в біологічному зразку є зворотньо пропорційною КІЛЬКОСТІ мічених стандартів rhTNFa, зв'язаних з неміченими анти-hTNFa антитілами Антитіла D2E7 винаходу можна також використовувати для детекцм TNFa ВІДМІННИХ ВІД ЛЮДИНИ ВИДІВ, особливо TNFa приматів (а саме, шимпанзе, бабуїна, мавпи, павіана та резуса), свині та миші, оскільки D2E7 можуть зв'язуватись з кожним з цих TNFas (обговорюється далі в Прикладі 4, підрозділі Е) Антитіла винаходу або їх частини здатні нейтралізувати активність hTNFa як in vitro, так і in vivo (див Приклад 4) Більш того, принаймні деякі з антитіл винаходу, такі як D2E7, можуть нейтралізувати активність TNFa інших видів ВІДПОВІДНО, антитіла винаходу або їх частини можна використовувати для інгібування активності TNFa, наприклад, в культурі клітин, що містить TNFa, в людсь В даному контексті термін "розлади, при яких активність TNFa є згубною", включає захворювання та ІНШІ розлади, при яких показано або підозрюється, що присутність TNFa у суб'єкта, що страждає на такий розлад, є відповідальною за патофізіологію розладу або фактором, що привносить погіршення розладу ВІДПОВІДНО, розлад, при якому активність TNFa є згубною, є розладом, в якому очікується, що інгібування активності TNFa полегшить симптоми та/або прогрес розладу Такі розлади можна виявити, наприклад, по підвищенню концентрації TNFa в біологічній рідині суб'єкта, що страждає на розлад ( напр , підвищенню концентрації TNFa в сироватці, плазмі, синовіальній рідині, і т д суб'єкта), яку можна дослідити, наприклад, використовуючи анти-TNFa антитіла так, як описано вище Є багато прикладів розладів, в яких активність TNFa є згубною Використання антитіл винаходу та їх частин при лікуванні специфічних розладів обговорюється надалі А Сепсис Фактор некрозу пухлини має встановлену роль у патофізіології сепсису з біологічним ефектом, який включає ГІПОТОНІЮ, мюкардіальну супресію, синдром васкулярної течі, некроз органів, стимуляцію вивільнення токсичних вторинних медіаторів та активацію каскаду згорнення (див , наприклад, 42 41 57726 див , напр , Moeller, A , et al (1990) Cytokme 2 162вигідним локальне уведення антитіл або їх частин 169, Патент США No 5,231,024 Moeller et al , Євв місце запалення (напр , локальне уведення в ропейська Патентна публікація No 260 610 Moeller суглоби при ревматоїдному артриті або місцеві et al , Tracey, К J and Cerami, A (1994) Annu Rev аплікації при діабетичній виразці, одні або в комбіMed 45 491-503, Russel, D and Thompson, RC нації з похідними циклогексан-ілідена так, як описано в публікації РСТ WO 93/19751) Антитіла ви(1993) Curr Opm Biotech 4 714-721) ВІДПОВІДНО, находу і їх частини можна уводити з одним або ЛЮДСЬКІ антитіла винаходу та їх частини можна більше терапевтичними агентами, корисними в використовувати для лікування сепсису в будь-якій лікуванні автоімунних захворювань, як описано КЛІНІЧНІЙ формі, включаючи сепсисний шок, ендонадалі в підрозділі III токсичний шок, грам-негативний сепсис та синдром токсичного шоку С Інфекційні захворювання Більш ТОГО, ДЛЯ лікування сепсису антиФактор некрозу пухлини бере участь в опосеhTNFa-антитіла винаходу або їх частини можуть редкуванні біологічних ефектів, які спостерігаютьуводитися разом з одним або більше терапевтичся в багатьох інфекційних захворюваннях Наприних агентів, які надалі можуть пригнічувати сепсис, клад, TNFa опосередковує мозкове запалення та таким, як інгібітор інтерлейкша-1 (як це описано в капілярний тромбоз та інфаркт при малярії TNFa публікаціях РСТ WO 92/16221 та WO 92/17583), також опосередковує мозкове запалення, викликацитокін інтерлейкш-6 (див публікацію РСТ WO не порушенням гемато-інцефалічного бар'єру, за93/11793) або антагоніст фактора активації тромпуск синдрому септичного шоку та активацію венобоцитів (див , напр , Європейську патентну публізного інфаркту при менінгіті TNFa також бере кацію ЕР 374 510) Інші комбіновані терапії для участь в викликанні кахексії, стимулюванні вірусної лікування сепсису обговорюються надалі в підрозпроліферації та опосередкуванні ураження ділі III центральної нервової системи при синдромі надбаного імунодефіциту (СНІД) ВІДПОВІДНО, антитіла Додатково, в переважному втіленні антивинаходу та їх частини можна використовувати ІіЖРос-антитіла винаходу або їх частини уводятьпри лікуванні інфекційних захворювань, включаюся людині з підгрупи пацієнтів з сепсисом, що мачи бактеріальний менінгіт (див , напр , Європейсьють концентрацію IL-6 сироватки або плазми прику патентну публікацію ЕР 585 705), церебральну близно 500 пг/мл та більше, переважно 1000пг/мл, малярію, СНІД та СНІД-пов'язаний комплекс (ARC) під час лікування (див, публікацію РСТ WO (див, напр, Європейську патентну заявку ЕР 95/20978 Daum, L, et al) 230574), а також вторинну після трансплантації В Автоімунні захворювання цитомегаловірусну інфекцію (див , напр , Hetze, E , Показано, що фактор некрозу пухлини грає et al (1994) Transplantation 58 675-680) Антитіла значну роль в патофізіології багатьох автоімунних винаходу та їх частини також можна використовузахворювань Наприклад, знайдено, що TNFa грає вати для зняття симптомів, пов'язаних з інфекційроль в активації запалення тканин та викликанні ними хворобами, включаючи лихоманку та міалпю, супутних порушень при ревматоїдному артриті викликані інфекцією, (такою, як грип) та кахексію, (див , напр , Moeller, A , et al (1990) Cytokme 2 162викликану інфекцією (напр , вторинною до СНІДу 169, Патент США No 5,231,024 Moeller et al , Євта ARC) ропейська Патентна публікація No 260 610 Moeller et al , Tracey, К J and Cerami, А вищевказане поD Трансплантація силання, Arend, W P and Dayer, J-M (1995) Arth Фактор некрозу пухлини є ключовим медіатоRheum 38 151-160, Fava, R A , et al (1993) Clin ром при відторженні алотрансплантата та захвоExp Immunol 94 261-266) TNFot також залучений рювання типу трансплантат проти хазяїна (GVHD) до підсилення загибелі острівних клітин та опосета опосередкуванні реакції відторження, яку споредкуванні інсулінової резистентності при діабеті стерігають, якщо антитіла щурів ОКТЗ, спрямовані (див , напр , Tracev and Cerami, вищевказане попроти комплексу CD3 рецептора Т-клітин, викорисилання, публікацію РСТ WO 94/08609) TNFa тастовують для інгібування відторження транспланкож залучений до опосередкуванні цитотоксичностатів нирок (див, напр, Eason, J D , et al (1995) ті до олігодендроцитів та індукції запальних Transplantation 53 300-305, Suthanthnan M and тромбоцитів при множинному склерозі (див , напр , Strom Т В (1994) New Engl J Med 331 365-375) Tracey and Cerami, вищевказане посилання) ХиВІДПОВІДНО, антитіла винаходу та їх частини можна мерні та олюдненні мишачі анти-hTNFa антитіла використовувати для інгібування відторження проходять клінічне випробовування для лікування трансплантата, включаючи відторження алотрансревматоїдного артриту (див , напр , Bhott, M J , et плантатів та ксенотрансплантатів та інгібування al (1994) Lancet 344 1125-1127, Elliot, M J , et al GVHD Хоча антитіла та їх частини можна використовувати так, краще їх використовують в комбіна(1994) Lancet 344 1105-1110, Rankm, E G , et al ції з одним або більше інших агентів, які інгібують (1995) Br J Rheumatol 34 334-342) імунну ВІДПОВІДЬ проти аллотрансплантата або Антитіла людини винаходу та їх частини можінгібують GVHD Наприклад, в одному з втілень на використовувати для лікування автоімунних антитіла винаходу або їх частини використовують захворювань, особливо тих, що пов'язані з запав комбінації з ОКТЗ для інгібування ОКТЗленням, включаючи ревматоїдний артрит, ревмастимульованої реакції В іншому втіленні антитіла тоїдний спондиліт, остеоартрит та подагричний винаходу або їх частини використовують в комбіартрит, алергію, множинний склероз, автоімунний нації з одними або більше антитілами, спрямовадіабет, автоімунний ювеїт та нефротичний синдними на ІНШІ ЦІЛІ, що включені до регулювання ром Звичайно, антитіла або їх частини уводять імунної ВІДПОВІДІ, такі як молекули поверхні клітин системно, хоча при деяких розладах може бути 44 43 57726 CD25 (а-рецептор інтерлейкша-2), CD11a (LFA-1), Антитіла винаходу та їх частини також можна CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 використовувати для лікування інших хвороб та (B7-1) та/або CD86 (B7-2) В ще одному втіленні розладів, в яких активність TNFa є згубною Приданого антитіла винаходу або їх частини викорискладами інших хвороб та розладів, в яких активтовують в комбінації з одним або більше загальність TNFa має значення у патофізіології та, отже, ним імуносупресивним агентом, таким як циклосякі можна лікувати, використовуючи антитіла випорин А або FK506 находу або їх частини, є запальні захворювання суглобів та захворювання всмоктування кісток Е ЗЛОЯКІСНІ утворення (див , наприклад, Bertohni D R , et al , (1986) Nature Фактор некрозу пухлин бере участь у викли319 516-518, Komg A , et al (1988) J Bone Miner канні кахексії, що викликає ріст пухлин, поширює Res 3 621-627, Lerner, U H , and Ohhn, A (1993) J метастичний потенціал та опосередковує цитотокBone Miner Res 8 147-155, Shankar, G and Stern сичність злоякісних утворень ВІДПОВІДНО, антитіла P M (1993) Bone 14 871-876), гепатит, включаючи винаходу та їх частини можна використовувати з алкогольний (див , напр , McClam, C J and Cohen метою лікування злоякісних утворень для інгібуD A (1989) Hepatology 9 349-351, Felvar M E , et al вання пухлинного росту або метастазу та/ або для (1990) Alcohol Clm Exp Res 14 255-259, and Hanзняття кахексії, що є вторинною до злоякісного sen, J et al , (1994) Hepatology 20 461-4741 утворення Дані антитіла або їх частини можна BJDVCHHU гепатит (Sheron N et al (1991) J уводити системно або локально у місце пухлини Henatnl 12 241-245, Hussain, M J , et al J Clm F Розлади дихальної системи Pathol 41 1112-1115) та скоротічнии гепатит, поФактор некрозу пухлин бере участь в патофірушення згортання (див , напр , van der Poll, T et зіології респіраторного дистрес-синдрома доросal (1990) N Engl J Med 322 1622-1627, van der лих (ARDS), включаючи стимулювання лейкоцитPoll T et al , (1991) Prog, Clm Bloi Res 361 55-60), ендотеліальної активації, спрямовуючи цитотоксизапалення (див , напр , Giroir, В Р , et al (1994) Am чність до пневмоцитів та викликаючи васкулярний J Physiol 2GZH118-124, Liu, X S , et al (1994) синдром ВІДПОВІДНО, антитіла винаходу або їх Burns 20 40-44), ураження перфузм (див напр, частини можна використовувати для лікування Scales, W E , et al (1994) Am J Physiol різноманітних розладів системи дихання, включа267 G1122-1127, Sernck, C, (1994) Transplantation ючи респіраторний дистрес-синдром дорослих 50 1158-1162, Yao, V M , et al (1995) Resuscitation (див , напр , публікацію РСТ № WO 91/04054), ле29 157-168), келоідні утворення (McCauley, R L, et геневий шок, хронічне запалення дихальної сисal (1992) J Clm Immunol 12 300-308), утворення теми, саркоідоз легенів, фіброз та СІЛІКОЗ легенів рубців, пірексія, перюдонтальне захворювання, Дані антитіла або їх частини можна уводити сисожиріння та радіаційна токсичність темно або локально на поверхню легенів, наприклад, у вигляді аерозолю Антитіла даного винахоДаний винахід надалі демонструється наступду або їх частини можна уводити з одним або ними прикладами, які не є обмежуючими Вміст більшою КІЛЬКІСТЮ додаткових терапевтичних агевсіх засилок, патентів та опублікованих патентних нтів, корисних при лікуванні розладів дихальної заявок поміщений тут шляхом посилання системи, як описано в підрозділі ПРИКЛАД 1 Кінетичний аналіз зв'язування антитіл людини з hTNFa G Розлади кишкового тракту Фактор некрозу пухлин бере участь у патофізіЗв'язування в реальному часі між лігандом ології розладів шлунково-кишкового тракту (див , (бютинільований рекомбінантний TNFa людини наприклад, Tracy, К J , et al (1986) Science (rhTNFa), іммобілізований на бюсенсорній матри234470-474, Sun, X-M , et al (1988) J Clm Invest ці) та аналітом (антитілами у розчині) вимірювали 81 1328-1331, MacDonald, T T , et al (1990) Clm методом резонансу поверхневого плазмону (SPR) Exp Immunol 81 301-305) Химерні мишачі антив системі BIAcore (Pharmacia Biosensor, hTNFa антитіла пройшли КЛІНІЧНІ випробовування Piscataway, NY) Ця система використовує оптичні при лікуванні кишкового захворювання (van Dulleвластивості SPR для визначення змін концентрації men, H M , et al (1995) Gastroenterology 109 129білка всередині декстранового бюсенсорного мат135) Антитіла людини даного винаходу або їх часриксу Білки ковалентно зв'язують з декстрановим тини також можна використовувати для лікування бюсенсорним матриксом у відомих концентраціях розладів кишкового тракту, таких як ідюпатична Антитіла уводять через декстрановий матрикс, а запальна хвороба, яка включає два синдроми, специфічне зв'язування між уведеними антитілами хворобу Крона та виразковий коліт Антитіла вината іммобілізованими лігандами призводить до підходу та їх частини також можна уводити з одним вищення концентрації білка в матриксі та кінцевої або більше терапевтичними агентами, корисними зміни сигналу SPR Такі зміни в сигналі SPR випри лікуванні розладів кишкового тракту, як описазначають в резонансних одиницях (RU) та зобрано в підрозділі III жають в залежності від часу вздовж осі Y сенсограми Н Розлади серцевої системи Антитіла винаходу або їх частини можна викоДля проведення іммобілізації бютинільованого ристовувати для лікування різноманітних кардіолоrhTNFa на бюсенсорному матриксі стрептавідин гічних розладів, включаючи ішемію серця (див , ковалентно зв'язують через ВІЛЬНІ аміногрупи з наприклад, публікацію заявки на Європейський декстрановим матриксом, спершу активуючи карпатент № ЕР 453 898) та серцеву недостатність боксильні групи на матриксі за допомогою ЮОмМ (слабкість серцевих м'язів) (див , наприклад, ПубN-пдроксисукциніміду (NHS) та 400мМ пдрохлорилікацію РСТ № WO 94/20139) ду ^етил-^-(3-диетиламшопропил)карбодиміду (EDC) Надалі, стрептавідин пропускають крізь І Інші розлади 46 45 57726 аісгивований матрикс Тридцять п'ять мікролітрів ванням 0,05% (BIAcore) сурфактанта Р20 (Pharстрептавідину (25мкг/мл), розведеного в ацетаті macia BR-1000-54, Pharmacia Biosensor, Piscataнатрію, рН 4,5, пропускають крізь активований way, NJ) Для визначення здатності rhTNFaбюсенсор та ВІЛЬНІ аміни білка зв'язуються прямо специфічних антитіл зв'язувати іммобілізований з активованими карбоксильнимим групами EDCrhTNFa проводили дослід по зв'язуванню так, як ефіри матрикса, які не прореагували, дезактивуописано нижче Аліквоти бютинильованого rhTNFa вали 1 М етаноламіном Бюсенсорні чіпи з стреп(25нМ, аліквоти по Юмкл) наносили на стрептавітавідином комерційне доступні (Pharmacia BRдин-зв'язаний декстрановий матрикс при швидко1000-16, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) сті току 5мкл/хв Перед нанесенням та одразу ж після нанесення через кожний проточний осередок Бютинільований rhTNFa синтезували при розпропускали PBS Різницю в сигналі між базовою чиненні 5,0мг біотину (N-пдроксисукцинімідний ЛІНІЄЮ та приблизно ЗОсек після завершення нанеефір D-бютиніл-є-амшокапроновоі кислоти, Воесення бютинільованого rhTNFa брали за критерій hnnger Mannheim Cat No 1008 960) в 500мкл дизв'язуючого об'єму (приблизно 500 RU) Вимірюметилсульфоксиду для одержання розчину 10 вали пряме зв'язування rhTNFa-специфічних антимг/мл Десять мкл біотину на мл rhTNFa (в концентіл до іммобілізованого бютинільованого rhTNFa трації 2,65мг/мл) додавали до молярного співвідАнтитіла (20мкг/мл) розводили в буфері PBS для ношення 2 1 біотину до rhTNFa Реакційну суміш нанесення та наносили аліквоти по 25мкл на матакуратно перемішували та проводили реакцію рикси з імобілізованим білком при швидкості току протягом двох годин при кімнатній температурі в 5мкл/хв До нанесення антитіл та одразу ж після темряві Колонку PD-10 з Сефадексом G-25M PBS буфер пропускали через кожний осередок (Pharmacia Catalog No 17-0851-01) врівноважуваРізницю МІЖ базовою ЛІНІЄЮ та сигналом після зали 25мл холодного PBS (забуференого фізіологічвершення нанесення антитіл брали як критерій ного розчину) та завантажували 2мл rhTNFa-бюти зв'язуючого об'єму кожної проби Бюсенсорні матну на колонку Колонку елюювали 1 0 x 1 мл холорикси регенерували, використовуючи ЮОмМ НСІ дного PBS Фракції збирали та прочитували при перед нанесенням слідуючої проби Для досліоптичній густині OD280 (1,0 OD = 1,25мг/мл) ВІДдження константи спаду швидкості (КсП), підвиПОВІДНІ фракції об'єднували та зберігали при -80°С щення швидкості (Кп), константи асоціації (Ка) та до використання Бютинільований rhTNFa є також константи дисоціації (Кд) використовували програкомерційне доступним (R & D Systems Catalog No му BIAcore kinetic evaluation software (версія 2 1) FTAOO, Minneapolis, MN) Бютинильований rhTNFa, що планують іммобілізувати на матриксі через стрептавідин, розводили в робочому PBS буфері (Gibco Cat No 14190-144, Gibco BRL, Grand Island, NY) з дода Показові результати зв'язування D2E7 (lgG4 цільноланцюгові) з біотинільованим rhTNFa, порівняно з мишачим мАТ МАК 195 (F(ab')2) показані в таблиці 1 Таблиця 1 Зв'язування D2E7 lgG4 або МАК 195 з біотинільованим rhJNFa Антитіла [AT], нМ rhTNFcc, зв'яз, RU Антитіла, зв'яз, RU rhTNFa/A T Ксп, с-1 (Avg) D2E7 267 133 67 33 17 8 4 2 373 420 434 450 460 486 489 470 1215 1569 1633 1532 1296 936 536 244 1,14 1,30 1,31 1,19 0,98 0,67 0,38 0,18 8,45x10' 5,42x10' 4,75x10' 4,46x10' 3,47x10' 2,63x10' 2,17x10' 3,68x10' (4,38x10') МАК 195 400 200 100 50 25 13 6 375 400 419 427 446 464 474 881 1080 1141 1106 957 708 433 1,20 1,38 1,39 1,32 1,09 0,78 0,47 5,38x10' 4,54x10' 3,54x10' 3,67x10' 4,41 х Ю ' 3,66x10' 7,37x10' 47 48 57726 3 451 В другій серії експериментів молекулярну кінетику реакцій між цільно-ланцюговою формою lgG1 D2E7 та бютинільованим rhTNFa аналізували КІЛЬ 231 0,26 6,95x10' (4,94x10') КІСНО, використовуючи технологій ВІАсоге, як описано вище, а одержані кінетичні константи швидкості зведені в таблицях 2, 3 та 4 Таблиця 2 Уявні константи швидкості дисоціації реакції між D2E7T3 бютинільованим rhTNF Експеримент 1 2 3 Середня Кд (С ') L 9,58x1 0' 9,26x10' 7,60x10' 8,81±1,06x10' Таблиця З Уявні константи швидкості асоціації реакції між D2E7T3 бютинільованим rhTNF Експеримент 1 2 3 Середня К а (М ' С ') 1,33x10' 1,05x10' 3,36x10' 1,91+1,26x10' Таблиця 4 Уявні кінетичні константи швидкості та афінності D2E7T3 біотинільованого rhTNF Експеримент 1 2 3 Середня К а (М ' С ') 1,33x10' 1,05x10' 3,36x10' 1,91+1,26x10' Константи швидкості дисоціації та асоціації підраховували, аналізуючи райони дисоціації та асоціації сенсограм за допомогою програми ВІА analysis Для реакції між D2E7 та молекулою бютинільваного rhTNF приймали традиційну кінетику реакції нульовий порядок дисоціації та перший порядок асоціації Для аналізу брали до уваги взаємодію тільки між однією гілкою бівалентних антитіл D2E7 та однією одиницею тривимірного бютинільваного rhTNF для вибору молекулярної моделі для аналізу кінетичних даних Проводили три незалежні експерименти, а результати аналізували незалежно Середня уявна константа швидкості дисоціації (kd) взаємодії D2E7 та бютинільваним rhTNF дорівнювала 8,81 ±1,06 х 10 5 с \ а середня уявна константа швидкості асоціації (к а ) була 1,91±1,26 х 10 5 М 1 с Істинну уявну константу дисоціації розраховували за формулою Кд=кс]/ка Так, значуща К д D2E7 для rhTNF, що походить від кінетичних параметрів, була 6,09±3,42 х 10 1 0 М Мінорні розбіжності в кінетичних величинах для форми lgG1 D2E7 (представлені в Табл 2, 3 та 4) та форми lgG4 D2E7 (представлені в Таблиці 1 та Прикладах 2 та 3) не можна вважати істинними розбіжностями, що виникають від присутності константних районів або lgG1 або lgG4, але скоріше можна віднести до більш чіткого визначення концентрації антитіл, що використовували для кінети Кд(С ') 9,58x10' 9,26x10' 7,60x1 0' 8,81±1,06x10' Кд(М) 7 , 2 0 x 1 0 Іи 8 , 8 2 x 1 0 Іи 2 , 2 6 x 1 0 Іи 6,09±3,42хЮ Іи чних аналізів з lgG3 ВІДПОВІДНО, можна вважати, що кінетичні величини для форми lgG1 D2E7, наведені тут, є більш чіткими кінетичними параметрами для антитіл D2E7 ПРИКЛАД 2 Скануючий мутагенез по аланіну домена CDR3 D2E7 Серію одиничних мутацій по аланіну проводили стандартним способом в домені CDR3 D2E7 VL та D2E7 VH районах Мутації легкого ланцюгу представлені на Фіг 1В (LD2E7*A1, LD2E7* A3, LD2E7*A4, LD2E7* А5, LD2E7* А7 і LD2E7* А8, в яких мутації по аланіну знаходяться в положеннях 1, 3, 4, 5, 7 або 8, ВІДПОВІДНО, В домені CDR3 D2E7 VL) Мутації у важкому ланцюгу представлені на Фіг 2В (HD2E7*A1, HD2E7* А2, HD2E7*A3, HD2E7*A4, HD2E7*A5, HD2E7* A6, HD2E7*A7, HD2E7* A8 та HD2E7* A9, що мають мутації по аланіну в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 або 1 1 , ВІДПОВІДНО, в CDR3 D2E7 VH) Кінетика взаємодії rhTNFa з антитілами, складеними з диких D2E7 VH та VL, порівнювали з кінетикою антитіл, складених з 1) дикого D2E7 VL, що з'єднується з аланінзаміщеним D2E7 VH, 2) дикого D2E7 VH, що з'єднується з аланш-заміщеним D2E7 VL, або аланінзаміщений D2E7 VL з'єднаний з аланін-заміщеним D2E7 VH Всі антитіла аналізували у вигляді цільно-ланцюгової молекули lgG4 Кінетику реакції антитіл з rhTNFa вивчали ре 49 57726 зонансом поверхневого плазмону, як описано в зведені в Таблиці 5 прикладі 1 Константи Ксп для різних пар VH/VL 50 Таблиця 5 Зв'язування мутантів по аланіну D2E7 з біотинільованим rhTNFa VH D2E7 VH HD2E7* HD2E7* HD2E7* HD2E7* HD2E7* HD2E7* HD2E7* HD2E7* HD2E7* D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 VL D2E7 VL D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 D2E7 А1 А2 A3 А4 А5 А6 А7 А8 А9 VH VH VH VH VH VH Kcn(C ') 9,65x10' 1,4x10 4 4,6x10 4 8,15x10 4 1,8x10 4 2,35x10 4 2,9x10 1,0x10 4 3,1 x 1 0 4 8,1 x 1 0 4 LD2E7* LD2E7* LD2E7* LD2E7* LD2E7* LD2E7* HD2E7* A9 4 VL VL VL VL VL VL VL VL VL A1 A3 A4 A5 A7 A8 6,6x10' не досліджується 1,75хЮ 4 1,8x10 4 1,4x10 4 3,65x10 4 1,05x10 4 LD2E7* A1 Ці результати свідчать, що більшість з положень доменів CDR3 D2E7 VH та VL районів можна заміщувати на один залишок цистеїну Заміщення одиничного аланіну в положенні 1, 4, 5 або 7 CDR3 D2E7 VL чи в положенні 2, 5, 6, 8, 9 чи 10 домена CDR3 D2E7 VH не впливає суттєво на швидкість спаду зв'язування hTNFct порівняно з диким батьківськими антитілами D2E7 Заміщення в положенні 8 CDR3 D2E7 VL або в положенні З CDR3 D2E7 VH сприяє 4-кратному підсиленню Ксп, а заміщення аланіну в положеннях 4 або 11 CDR3 D2E7 VH дає 8-кратне підсилення Ксп, що говорить про те, що ці положення є критичними для зв'язування з hTNFoc Однак, одинична заміна аланіну в положенні 1, 4, 5, 7 чи 8 CDR3 D2E7 VL або в положеннях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 або 11 CDR3 D2E7 VH все ж таки призводить до утворення анти-hTNFa антитіл, які мають Ксп 1 х 10-3 або менше ПРИКЛАД 3 Аналіз зв'язування антитіл, що походять від D2E7 Ряд антитіл, що походять від ПОСЛІДОВНОСТІ D2E7, аналізували на зв'язування з rhTNFa, порівняно з D2E7, резонансом поверхневого плазмону так, як описано в Прикладі 1 АМІНОКИСЛОТНІ ПОСЛІ ДОВНОСТІ районів VL, що аналізували, представлені на Фіг 1Ата1В АМІНОКИСЛОТНІ ПОСЛІДОВНОСТІ райо нів VH, що аналізували, представлені на Фіг 2А та 2В Ксп для різних пар VH/VL (в позначеному вигляді, або як цільно-ланцюгові lgG1 або lgG4 антитіла або як scFv) зведені в таблиці 6 Таблиця 6 Зв'язування антитіл, що походять від D2E7, з rhTNFa VH D2E7 VH VH1-D2 VH1-D2 VH1-D2N VH1-D2Y VH1-D2N VH1-D2 VH1-D2 ЗС-Н2 2SD4 VH 2SD4 VH VH1A11 VL D2E7 VL LOE7 LOE7 LOE7T LOE7A LOE7A EPB12 2SD4 VL LOE7 LOE7 2SD4 VL 2SD4 VL Вигляд lgG1/lgG4 lgG1/lgG4 scFv igG4 igG4 igG4 scFv scFv scFv scFv scFv scFv Kcn(c ') 9,65x10' 7,7x10' 4,6 2,1 x 1 0 ' 2,7x10' 3,2x10' 8,0x104 1,94x10' 1,5x10' 6,07x10' 1,37x10' 1,34x10' 51 57726 VH1B12 VH1B11 VH1E4 VH1F6 VH1D8 VH1G1 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4 VH 2SD4VL 2SD4 VL 2SD4 VL ZSD4 VL 2SD4 VL 2SD4 VL EPB12 VL10E4 VL100A9 VL100D2 VL10F4 VLL0E5 VLL0F9 VLLOF10 VLL0G7 VLL0G9 VLL0H1 VLLOH10 VL1B7 VL1C1 VL1C7 VLO 1F4 VL0 1H8 ПОВІЛЬНІ константи спаду швидкості (тобто, К с п < 1 х х 1 0 4 с 1 ) для цільно-ланцюгових антитіл (наприклад, вигляду IgG), які мають VL обрані із D2E7, LOE7 Т та LOE7 А , які мають або треонін або аланін в положенні 9, показують, що положення 9 CDR3 D2E7 VL може займати один з цих залишків без суттєвого впливу на К с п ВІДПОВІДНО, консенсусний мотив CDR3 D2E7 VL включає амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(TVA) (SEQ ID NO 3) Більш ТОГО, ПОВІЛЬНІ константи спа4 1 ду швидкості (тобто, К с п < 1 х х 10 с ) для антитіл, які мають VH, обрані із D2E7, V H 1 - D 2 N та V H 1 D2 Y, що містять або тирозин, або аспарагін в положенні 12, показують, що положення 12 CDR3 D2E7 VH можуть займати обидва ці залишки без суттєвого впливу на К с п ВІДПОВІДНО, консенсусний мотив для CDR3 D2E7 VH включає амінокислотну П О С Л І Д О В Н І С Т Ь I D N O V - S - Y - L - S - T - A - S - S - L - D - ( Y / N ) 52 scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv scFv cnFV ScFv scFv scFv scFv scFv ( S E Q 4 ) Результати, які наведені в Табл 6, демонструють, що у формі scFv антитіла, які мають 2SD4 АБО CDR3 VH райони, демонструють більш високі Ксп (тобто, К с п < 1 х х 1 0 3 с 1 ) порівняно з антитілами, що містять D2E7 VL або VH CDR3 райони Всередині VL CDR3 2SD4 відрізняється від D2E7 в положеннях 2, 5 та 9 Як згадувалось раніше, однак, положення 9 може займати Ala (як 2SD4) або Thr (як D2E7) без суттєвого впливу на К с п Так, при порівнянні 2SD4 та D2E7, положення 2 та 5 D2E7 VL CDR3, обидва аргініни, можна охарактеризувати як критичні для асоціації антитіл з hTNFa Ці залишки можуть прямо брати участь як контактні залишки в сайті зв'язування антитіл або вносити критичний вклад до встановлення просторової архітектури молекули антитіла в цьому районі Беручи до уваги важливість положення 2, заміна Arg (в LOE7, якій має такий самий VL CDR3, як і D2E7) на Lys (в ЕР В12) прискорює швидкість спаду на два порядки Беручи до уваги положення 5, заміна Arg (в D2E7) на АІа (в 1,01 x 1 0 ' 9,8x10' 1,59x10' 2,29x10' 9,5x10' 2,14x10' 6,7x10' 9,6x10' 1,33x10' 1,41 x 1 0 ' 1,11 x 1 0 ' 1,16x10' 6,09x10' 1,34x10' 1,56x10' 1,46x10' 1,17x10' 1,12x10' 1,3x10' 1,36x10' 2,0x10' 1,76x10' 1,14x10' LD2E7* А5), як описано в Прикладі 2, також прискорює швидкість спаду на два порядки Далі, без Arg в положенні 2 та 5 (в 2SD4) швидкість спаду вищою на у два порядки Однак слід сказати, що хоча положення 5 є важливим для покращеного зв'язування з hTNFa, зміни в цьому положенні можуть нейтралізуватись змінами в інших положеннях, як видно із VLLOE4, VLLOH1 або VL0 1Н8 Всередині VH CDR3 2SD4 відрізняється від D2E7 в положеннях 1, 7 та 12 Як згадувалось раніше, однак, положення 12 може займати Asn (як 2SD4) або Туг (як D2E7) без суттєвого впливу на Ксп Так, при порівнянні 2SD4 та D2E7, положення 1 та 7 D2E7 VH CDR3, обидва аргініни, можна охарактеризувати як критичні для асоціації антитіл з hTNFa Як сказано вище, ці залишки можуть прямо брати участь як контактні залишки в сайті зв'язування антитіл або вносити критичний вклад до встановлення просторової архітектури молекули антитіла в цьому районі Обидва положення є важливими для зв'язування з hTNFa, оскільки при використанні ЗС-Н2 VH CDR3 (в якому валін заміщують на аланін в положенні 1 відносно D2E7 VH CDR3), scFv має більш швидку в три рази швидкість спаду порівнянно з використанням D2E7 VH CDR3, але ця швидкість спаду є все ж таки у 4 рази ПОВІЛЬНІШОЮ, ніж при використанні 2SD4 VH CDR3 (який несе зміни в обох положеннях 1 та 7 у D2E7 VH CDR3) ПРИКЛАД 4 Функціональна активність D2E7 Для вивчення функціональної активності D2E7 використовували антитіла в кількох дослідах, в яких вимірюють здатність даних антитіл інгібувати активність hTNFa, як in vitro так і in vivo А Нейтралізація цитотоксичності, яка викликана hTNFa, в клітинах L929 Людський рекомбінантний TNFa (rhTNFa) викликає цитотоксичність клітин до мишачих клітин L929 після інкубаційного періоду 18-24 години Людські анти-hTNFa антитіла вивчали в ДОСЛІДІ З 54 53 57726 L929 завдяки кошкубацм антитіл з rhTNFaTa клітипланшет інкубували протягом ночі (18-24 години) о нами, що вказані далі 96-луночний планшет, що при37 Св15%СО2 містив ЮОмкл анти-hTNFoc антитіл, розводили по З кожної лунки відбирали ЮОмкл середовища 1/3 зверху вниз по планшету в двох паралелях, та додавали 50мкл 3(4,4-диметилтіазол-2-іл)2,5використовуючи середовище RPMI, яке містило діфеніл-тетразоліум броміду в концентрації 5мг/мл 10% фетальну бичачу сироватку (FBS) П'ятдесят (МІГ, доступний у Sigma Chemical Co , St Louis, мікролітрів rhTNFa додавали для кінцевої конценМО) в PBS Планшети інкубували протягом 4 годин трації 500пг/мл в кожній лунці Планшети шкубувапри 37°С Потім додавали по п'ятдесят мікролітрів ли протягом ЗО хвилин при кімнатній температурі 20% д од еци л сульфату натрію (SDS) до кожної Далі, 50мкл чутливих до TNFa мишачих фіброблалунки та інкубували планшети при 37°С протягом стів L929 додавали до кінцевої концентрації 5 х ночі Вимірювали оптичну густину при 570/630нм, 104 клітин на лунку, включаючи 1мг/мл АКТІНОМІкриві були побудовані для кожної проби та станцину-D Контролі включали середовище плюс клідартними способами досліджували ICso тини та rhTNFa плюс клітини Ці контролі та станПоказові результати для людських антитіл, які дартну криву TNFa, що сягає від 2нг/мл до мають різні пари VL та VH, порівняно з мишачими 8,2пг/мл, використовували для визначення якості мАТ МАК 195, показано на фіг 3 та в табл 7 ниждосліду та забезпечення вікна нейтралізації Потім че Таблиця 7 Нейтралізація цитотоксичності, яка викликана hTNFa в клітинах L929 VH D2E7 D2E7 2SD4 2SD4 VH1-D2 VH1-D2 VH1-D2Y VH1-D2N VH1-D2Y VH1-D2N МАК 195 МАК 195 VL D2E7 D2E7 2SD4 LOE7 2SD4 LOE7 LOE7T LOE7T LOE7A LOE7A МАК 195 МАК 195 Результати на фіг 3 та табл 7 показують, що людські анти-hTNFa антитіла D2E7 та різні ПОХІДНІ ВІД D2E7 антитіла нейтралізують викликану TNFcc цитотоксичність L929 з продуктивністю, приблизно рівною продуктивності мишачих анти-hTNFa мАТ МАК 195 Структура scFv IQG4 scFv/lgG1/lgG4 scFv scFv scFv/lgG1/lgG4 igG4 lgG4 igG4 igG4 scFv F(ab")2 IC50, M 1,1 x10 IU 4,7x10 " 3,0x10' 4,3x10" 1,0x10" 3,4x10 IU 8,1 x10 " 1,3x10 IU 2,8x10 " 6,2x10 " 1,9x10" 6,2x10 " В ІНШІЙ серії експериментів здатність lgG1 форми D2E7 нейтралізувати викликану TNFa цитотоксичність L929 вивчали так, як описано вище Результати трьох незалежних ДОСЛІДІВ та їх середня величина зведені в таблиці 8 Таблиця 8 Нейтралізація викликаної TNFa цитотоксичності L929 lgG1 D2E7 Експеримент 1 2 3 середня величина Ця серія експериментів підтвердила, що D2E7 в повноланцюговій формі lgG1 нейтралізує викликану TNFa цитотоксичність L929 з середнім значенням ІС 50 [М] 1,25±0,01 х Ю 1 0 В Інгібування зв'язування TNFa з рецептором TNFa на клітинах U-937 Здатність людських анти-hTNFa антитіл інгібувати зв'язування hTNFa з рецептором hTNFa на поверхні клітин вивчали, використовуючи клітинну ЛІНІЮ U-937 (АТСС No CRL 1593), ЛІНІЮ ГІСТІОЦИТІВ людини, яка експресуе рецептори hTNFa LI-937 вирощували на середовищі PRM1 1640 з додаван ІС50 [М] 1,26x10 Іи 1,33x10 Іи 1,15x10 Іи 1,25±0,01 х Ю Іи ням 10% фетальної бичачої сироватки (Нусіопе А1111, Нусіопе Laboratories, Logan, LIT), L-глютамш (4нМ), розчин буфера HEPES (ЮмМ), пеніцилін (100мкг/мл) та стрептоміцин (100мкг/мл) Для вивчення активності цільноланцюгових антитіл IgG клітини U-937 пред інкубували з PBS з 1мг/мл людських антитіл IgG (Sigma I-4506, Sigma Chemical Co , St Louis, MO) протягом 45 хвилин на льоду та потім клітини промивали тричі буфером для зв'язування Для ДОСЛІДІВ по зв'язуванню рецептора клітини U-937 (5 х 106 клітин/лунка) інкубували в буфері для зв'язування (PBS з 0,2% бичачим си 56 55 57726 роваточним альбуміном) в 96-луночному планшеті з рбО або р80 рецептором TNFa, тоді як водна для мікротитрування (Costar 3799, Costar Corp , фаза над масляною сумішшю містить надлишок 125 125 Cambridge, MA) разом з І-міченим rhTNFa (3 x вільного І-міченого rhTNFa Всі осади клітин 10 10 M, 25мкКю/мл, одержано у NEN Research збирали в пробірку для вимірювання (Falcon 2052, Products, Wilmington, DE), з або без анти-hTNFa Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ) та раантитіл в загальному об'ємі 0,2мл Планшети інкухували на сцинциляційному лічильнику бували на льоду протягом 1,5 години Потім 75мкл Показові результати представлені на Фіг 4 кожної проби переносили у 1,0мл пробірки (SarВеличина ІС50 для інгібування D2E7 зв'язування stedt 72 700, Sarstedt Corp , Princeton, NJ), які місhTNFa з рецептором hTNFa на клітинах U-937 є 1 тили дибутилфталат (Sigma I-4506, Sigma Chemiприблизно 3x10 М в цих експериментах Ці реcal Co, St Louis, МО) та дшонилфталат (ICN зультати показують, що людські анти-hTNFa анти210733, ICN, Irvine, CA) Пробірки з 300 мкл дибутіла D2E7 інгібують зв'язування hTNFa з рецептотилфталату та дінонилфталату в об'ємному співром rhTNFa на клітинах U-937 в концентрації, відношенні 2 1 , ВІДПОВІДНО Вільний (тобто, не приблизно рівній концентрації мишачих анти125 зв'язаний) І-мічений rhTNFa видаляли центриhTNFa мАТ МАК 195 фугуванням протягом 5 хвилин Потім, кінець кожВ ІНШІЙ серії експериментів здатність lgG1 фоної пробірки, що містив осад, зрізали за допоморми D2E7 інгібувати зв'язування rhTNFa з рецепгою спеціальних ножиць для пробірок (Bel-Art тором hTNFa на клітинах U-937 вивчали так, як 210180001, Bel-Art Products, Pequannock, NJ) описано вище Результати трьох незалежних ДО125 Осад клітин містить І-мічений rhTNFa, зв'язаний СЛІДІВ та їх середня величина зведені в таблиці 9 Таблиця 9 Інгібування зв'язування hTNFa на клітинах U-937 lgG1 D2E7 Експеримент 1 2 3 середня величина ІС50 [М] 1,70x10 Іи 1,49x10 Іи 1,50x10 Іи 1,56±0,12хЮ Ця серія експериментів підтвердила, що D2E7 в повноланцюговій формі lgG1 інгібує зв'язування рецептора TNFa на клітинах U-937 з середнім значенням ІС 50 [М] 1,56±0,12хЮ 1 0 Для вивчення інгібуючого потенціалу D2E7 при зв'язуванні 125l-rhTNFa індивідуально з рецепторами р55 та р75 використовували твердофазний Іи радюімунний аналіз Для вимірювання величини ІС50 D2E7 для окремих рецепторів TNF різні концентрації антитіл шкубували з концентрацією 3 х 10 10 125l-rhTNFa Цю суміш потім аналізували на окремих планшетах, що містили або р55 або р75 рецептор в доза-залежному способі Результати зведені втабл 10 Таблиця 10 Інгібування зв'язування TNF рецептора з р55та р75 TNFR lgG1 D2E7 Реагент D2E7 rhTNF р55 TNFR 1,47хЮ У 2,31 х Ю У Інгібування зв'язування l-rhTNF з р55 та р75 TNF рецепторами на клітинах U937 D2E7 проходило по сигма-кривій, показуючи подібні значення ІС50 для кожного з рецепторів В твердофазному радюімуноаналізі (RIA) з рекомбінантними TNF рецепторами величина ICso зв'язування 125l-rhTNF з р55 та р75 рецепторами D2E7 була 1,47 х 10 9 та 1,26 х 10 9 М, ВІДПОВІДНО Спад величини ICso в твердій фазі відбувався, вірогідно, внаслідок більшої ЩІЛЬНОСТІ рецепторів при RIA, оскільки немічений rhTNF також інгібується з подібними значеннями ІС50 Значення ICso для інгібування зв'язування 125l-rhTNF з р55 та р75 рецепторами неміченим rhTNF було 2,31 х 10 та 2,70 х 10 9 М, ВІДПОВІДНО С Інгібування експресії ELAM-1 на HUVEC Людські ендотеліальні клітини з пупкової вени ІС50 [М] р75 TNFR 1,26хЮ У 2,70x10 у (HUVEC) можна індукувати експресувати ендотеліальні молекули клітин адгезії лейкоцитів 1 (ЕLAM-1) на їх поверхні шляхом обробки rhTNFa, що можна спостерігати по реакції HUVEC, оброблених rhTNFa, з мишачими анти-людськими антитілами ELAM-1 Здатність людських анти-hTNFa антитіл інгібувати таку експресію ELAM-1, індуковану TNFa, на HUVEC вивчали наступним чином HUVEC (АТСС No CRL 1730) поміщали в 96луночний планшет ( 5 x 1 0 клітин/лунка) та шкубували протягом ночі при 37°С Наступного дня готували серію розведень людських анти-hTNFa антитіл (1 10) в планшеті для мікротитрування, починаючи від 20-100мкг/мл антитіл Вихідний розчин rhTNFa готували в концентрації 4,5 нг/мл, додавали аліквоти rhTNFa до кожної лунки з антитілами та ретельно перемішували Контролі вклю 58 57 57726 чали тільки середовище, середовище плюс антиантитіл Планшети шкубували протягом однієї гоhTNFa антитіла та середовище плюс rhTNFa дини при кімнатній температурі, а потім кожну лунПланшети з HUVEC виймали після нічної інкубації ку промивали тричі RPMI 190мкл 5% SDS додапри 37°С та обережно відсмоктували середовище вали до кожної лунки для лізису клітин Клітинний з кожної лунки ДВІСТІ МКЛ суміші антитіла-rhTNFa лізат з кожної лунки переносили в пробірку та переносили до кожної лунки планшетів з HUVEC проміряли в сцинціляційному лічильнику Планшети з HUVEC надалі шкубували при 37°С Показові результати показані на Фіг 5 Велипротягом 4 годин Далі, ВИХІДНІ мишачі анти-ELAMчина ІС50 для інгібування D2E7 експресії ELAM-1 1 I антитіла розбавляли 1 1000 в RPMI Середовище індукованої TNFa, на HUVEC є приблизно 6 х 10 з кожної лунки планшета з HUVEC обережно відМ в цих експериментах Ці результати показують, смоктували, додавали 50мкг/мл розчину антищо D2E7 анти-hTNFa антитіла інгібують експресію ELAM-1 антитіл та планшети з HUVEC шкубували ELAM-1, індуковану TNFa, на HUVEC в концентрапротягом 60 хвилин при кімнатній температурі ції, приблизно рівній таковій для мишачих анти125 Готували розчин І-мічених анти-мишачих IgG hTNFa мАТ МАК 195 антитіл, приготованих в RPMI (приблизно 50 000 В ІНШІЙ серії експериментів здібність lgG1 фочаст на млн в 50мкл) Середовище з кожної лунки рми D2E7 інгібувати експресію ELAM-1, індуковану планшета з HUVEC обережно відсмоктували, лунTNFa, на HUVEC вивчали так, як описано вище ки промивали ДВІЧІ RPMI та до кожної лунки додаРезультати трьох незалежних ДОСЛІДІВ та їх сере125 вали 50мкл розчину І-мічених анти-мишачих IgG дня величина зведені в таблиці 11 Таблиця 11 Інгібування експресії ELAM-1, індукованої TNFa, рецептором lgG1 D2E7 Експеримент 1 2 3 середня величина ІС50 [М] 1,95x10 Іи 1,69x10 Іи 1,90x10 Іи 1,85±0,14хЮ Ці серії експериментів підтверджують, що D2E7, повноланцюгова форма lgG1, інгібує експресію ELAM-1, індуковану TNFa, на HUVEC з середнім значенням ІС5о [М] 1,85±0,14 х 10 10 Здатність нейтралізації D2E7 lgG1 вивчали також для експресії двох інших молекул адгезії, ІСАМ-1 та VCAM-1, індукованої rhTNF Оскільки крива титрацм rhTNF для експресії ІСАМ-1 була дуже схожою до кривої для експресії VCAM-1, для експериментів по нейтралізації антитіл використовували ту ж саму концентрацію rhTNF HUVEC шкубували з rhTNF в присутності різних концентрацій D2E7 при 37°С в ССЬ-шкубаторі протягом 16 годин, та вимірювали експресію ІСАМ-1 за допо Іи могою мишачих анти-ІСАМ-1 антитіл з подальшим використанням 125І-мічених анти-мишачих антитіл барана Проводили два незалежних експерименту та обчислювали величину ICso Неродинні людські антитіла lgG1 не інгібували експресію ІСАМ-1 Проведення експерименту по тестуванню інгібування експресії VCAM-1 було таким самим, як і для ELAM-1, за винятком того, що замість антиЕІАМ-1 мАТ використовували анти-VCAM-l мАТ Проводили три незалежних експерименти і обчислювали ІС50 Неродинні людські антитіла lgG1 не інгібували експресію VCAM-1 Результати зведені в таблиці 12 Таблиця 12 Інгібування експресії ІСАМ-1 та VCAM-1 bvlgGI D2E7 інгібування ІСАМ-1 експеримент ІС50 [М] 1 1,84x10 Іи 2 2,49x10 Іи Середня величина 2,17±0,46хЮ Іи Ці експерименти свідчать, що обробка первинних ендотеліальних клітин пупкової вени rtiTNF призводить до оптимальної експресії молекул адгезії ELAM-1 та VCAM-1 через 4 години, а максимальна експресія, що позитивно регулюється, ІСАМ-1 - через 16 годин D2E7 здатен інгібувати експресію цих трьох молекул адгезії дозазалежним чином Величини ІС50 Для інгібування ELAM-1, ІСАМ-1 та VCAM-1 були, ВІДПОВІДНО, 1,85 експеримент 1 2 3 Середня величина ІС50 [М] ІС50 [М] 1,03x10 Іи 9,26x10 " 1,06x10 Іи 1,01 ±0,01 х Ю Іи х 10 10 , 2,17x10 10 та 1,01 х Ю 1 0 Дані величини є дуже схожими, що говорить про подібні дози rhTNF сигналу активації для індукції експресії ELAM-1, ІСАМ-1 та VCAM-1 Цікаво, що D2E7 був однаково ефективним в більш довгому ДОСЛІДІ по інгібуванню експресії ІСАМ-1 Дослід по інгібуванню ІСАМ-1 продовжувався 16 годин ко-шкубацм rhTNF та D2E7 з HUVEC, на відміну від 4 годин, що було потрібно для ДОСЛІДІВ по інгібуванню 60 59 57726 ELAM-1 та VCAM-1 Оскільки D2E7 має низьку ність у цих мишей швидкість спаду для rhTNF, суттєво, що протягом Показові результати, зображені у вигляді сто16 годин ко-шкубаційного періоду не було значної впчиків - % тих, що вижили залежно від концентконкуренції рецепторів TNF на HUVEC рації антитіл, показані на Фіг 6 Чорні стовпчики D Нейтралізація hTNFoc in vivo зображають D2E7, заштриховані стовпчики зобраДля того, щоб показати, що D2E7 ефективно жають МАК 195 Ін'єкція 2 5-25мкг антитіл D2E7 на інгібують активність hTNFa in vivo, використовувамишу захищала тварин від викликаної TNFot летали три різні системи in vivo льності Величина ED50 є приблизно 12,5мкг/мишу Позитивний контроль - антитіла МАК І Інгібування викликаної TNF летальності у D195, був схожим по своїй протективній здатності галактозамш-чутливих мишей Ін'єкція D2E7 у відсутності rhTNFa не мала поганоІн'єкція рекомбінантного людського TNFa го ефекту на мишей Ін'єкція неспецифічних люд(rhTNFa) D-галактозамш-чутливим мишам виклиських антитіл lgG1 не викликала ніякої протективкала смерть через 24 години Було показано, що ності від викликаної TNFa летальності агенти, які нейтралізують TNFa запобігають смерті в цій моделі Для вивчення здатності людських В другому експерименті 45 мишей ділили на 7 анти- hTNFa антитіл нейтралізувати hTNFa in vivo рівних груп Кожна група одержувала різні дози в цій моделі мишам С57В1/6 робили ІН'ЄКЦІЮ різD2E7 за ЗО хвилин до уведення LD80 дози суміші ними концентраціями D2E7-lgG1, або контрольним rhTNFa / D-галактозамш (1,0мкг rhTNFa та 20мг Dбілком, в PBS штраперітонеально (і р) Мишам галактозамшу на мишу) Контрольна група 7 одеруводили через ЗО хвилин 1мкг rhTNFa та 20мг Dжувала нормальні людські антитіла lgG1 каппа по галактозам і ну в PBS і р та обстежували через 24 25мкг на мишу Мишей обстежували через 24 гогодини Дана КІЛЬКІСТЬ rhTNFa та D-галактозамшу дини Процент виживання підсумований в табл 13 по попереднім даним викликала 80-90% летальвнизу Таблиця 13 Виживання через 24 години після уведення D2E7 1 група 2 виживання (живі/загальна КІЛЬКІСТЬ) 0/7 1/7 5/7 6/7 1 (без антитіл) 2 (1мкг) 3 (2,6мкг) 4 (5,2мкг) 1 5 (26 м кг) 6(26мкг, без rhTNF) 7 (25мкг людських lgG1) 3 виживання (%) 0 14 71 86 Продовження таблиці 13 2 6/7 7/7 1/7 II Інгібування викликаної TNF пірексії кролів Вивчали ефективність D2E7 в інгібуванні викликаної rhTNF пірексії кролів Групам по 3 кролясамки NZW вагою приблизно 2,5 кг кожен уводили внутрішньовенне D2E7, rhTNF та імунний комплекс D2E7 та rhTNF Вимірювали ректальну температуру на температурному рекодері Кауе кожної хвилини протягом приблизно 1 години Ін"єкцм рекомбінантного людського TNF в фізіологічному розчині по 5мкг/кг викликали підвищення темпера 3 86 100 14 тури на більш ніж 0,4°С через приблизно 45 хвилин після ін'єкції Препарат антитіл як таких в фізіологічному розчині в дозі 138мкг/кг не викликав підвищення температури у кролів протягом 140 хвилин після уведення В усіх подальших експериментах D2E7 або контрольні реагенти (людський lgG1 або фізрозчин) уводили ІН'ЄКЦІЄЮ І V кролям через 15 хвилин після ін'єкції rhTNF в фізрозчині по 5мкг/кг і v Показові результаті кількох ДОСЛІДІВ представлені в табл 14 Таблиця 14 Інгібування викликаної rhTNF пірексії кролів з D2E7 Молярне співвідношення Підвищення темпер ,* С Доза О2Е7(мкг/кг) 14 24 48 137 792 rhTNF rhTNF+ D2E7 % інгібування** D2E7 rhTNF 0,53 0,43 0,53 0,53 0,80 0,25 0,13 0,03 0,00 0,00 53 70 94 100 100 1 1,6 3,3 9,5 55 Пікова температура хвилини після rhTNF 60 40 50 60 60