Поліморфізм людського гена nbs1 657del5, що використовується для діагностики успадкованої схильності до раку простати чи інвазивного раку молочної залози долькового підтипу
Номер патенту: 93344
Опубліковано: 10.02.2011
Автори: Горскі Богдан, Сікорскі Анджей, Цибулскі Цезар, Гліневіч Бартломей, Лубінскі Ян
Формула / Реферат
1. Полінуклеотид, пов'язаний з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати чи інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, що кодує молекулярний варіант поліпептиду NBS1, де зазначений полінуклеотид містить делецію п'яти нуклеотидів, що відповідає позиції 18155, 18156, 18157, 18158 або 18159 гена NBS1 (657del5) (реєстраційний номер у Genbank: AB013139).
2. Полінуклеотид за п. 1, який відрізняється тим, що результатом нуклеотидної делеції є змінена експресія варіанта гена NBS1 у порівнянні з відповідним геном дикого типу.
3. Вектор, що містить полінуклеотид за п. 1 або 2.
4. Вектор за п. 3, який відрізняється тим, що полінуклеотид функціональним чином зв'язаний з регуляторними послідовностями експресії, що дають можливість експресії в прокаріотних або еукаріотних клітинах.
5. Клітина-хазяїн, одержана генно-інженерним шляхом, що містить полінуклеотид за п. 1 або 2 або вектор за п. 3 або 4.
6. Спосіб одержання молекулярного варіанта білка NBS1 або його фрагмента, пов'язаного з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати чи інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, при якому (а) культивують клітини-хазяїни за п. 5 і (б) виділяють зазначений білок чи фрагмент із культури.
7. Спосіб одержання клітин, здатних до експресії молекулярного варіанта гена NBS1, пов'язаного з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, що включає одержання генно-інженерним шляхом клітин, що містять полінуклеотид за п. 1 або 2 або вектор за п. 3 або 4.
8. Білок NBS1 або його фрагмент, пов'язаний з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, що кодується полінуклеотидом за п. 1 або 2 або одержаний способом за п. 6 або з клітин, одержаних способом за п. 7.
9. Антитіло, що специфічно зв'язується з білком за п. 8.
10. Антитіло за п. 9, що специфічно розпізнає епітоп, що містить амінокислотні заміни, як вони визначені в п. 1 або 2.
11. Молекула нуклеїнової кислоти, комплементарна полінуклеотиду за п. 1 або 2.
12. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна до специфічного розпізнавання і розщеплення полінуклеотиду за п. 1 або 2.
13. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п. 11 або 12.
14. Трансгенна тварина, яка не відноситься до людини, що містить щонайменше один полінуклеотид за п. 1 або 2 або вектор за п. 3 або 4.
15. Трансгенна тварина, яка не відноситься до людини, за п. 14, що додатково містить щонайменше одину інактивованну алель дикого типу гена NBS1.
16. Трансгенна тварина, яка не відноситься до людини, за п. 14 або 15, що являє собою мишу чи пацюка.
17. Олігонуклеотид для генотипування індивідуальних алелей гена NBS1, який містить делецію п'яти нуклеотидів, що відповідає позиції 18155, 18156, 18157, 18158 або 18159.
18. Спосіб виявлення схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у суб'єкта, що включає (а) виявлення в біологічному зразку, взятому від суб'єкта, успадковані зміни 657del5 в послідовності гена NBS1, який відрізняється тим, що зазначена зміна спричиняє втрату значення гена NBS1; і (б) пов’язування даної зміни з показником схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у суб’єкта, в результаті чого виявлено дану схильність.
19. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що суб'єкт являє собою людину.
20. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що людина має слов'янське походження.
21. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що зміну виявляють за допомогою ПЛР з алель-специфічними олігонуклеотидами (ASO-ПЛР), аналізів на виявлення поліморфізму однониткової конформації (SSCP), прямого секвенування, алель-специфічної ампліфікації (ASA), мікрочіпів або ПЛР із використанням поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (RFLP-ПЛР).
22. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що біологічний зразок являє собою зразок тканини.
23. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що зразок тканини являє собою кров.
24. Спосіб за п. 18, який відрізняється тим, що біологічний зразок містить лейкоцити.
25. Застосування успадкованої зміни 657del5 в послідовності гена NBS1 для виявлення успадкованої схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у суб'єкта.
26. Застосування за п. 25, яке відрізняється тим, що суб'єкт являє собою людину.
27. Застосування за п. 25, яке відрізняється тим, що людина має слов'янське походження.
28. Застосування за кожним із пп. 25-27, який відрізняється тим, що наявність успадкованої зміни виявляють з використанням щонайменше одного з методів, вибраних з ASO-ПЛР, SSCP, мікрочипів, прямого секвенування, ASA або RFLP-ПЛР.
29. Діагностичний набір для ідентифікації схильності до інвазивного раку молочної залози долькового підтипу або до раку простати у суб'єкта, що включає пакувальний матеріал і щонайменше два різних полінуклеотиди, що дозволяють ампліфікувати щонайменше частину гена, що містить мутацію 657del5NBS1, вибраний з групи Nbsex6f (SEQ ID NO:6), Nbsex6r (SEQ ID NO:7) і Nbsdel5 (SEQ ID NO:8).
Текст
1. Полінуклеотид, пов'язаний з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати чи інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, що кодує молекулярний варіант поліпептиду NBS1, де зазначений полінуклеотид містить делецію п'яти нуклеотидів, що відповідає позиції 18155, 18156, 18157, 18158 або 18159 гена NBS1 (657del5) (реєстраційний номер у Genbank: AB013139). 2. Полінуклеотид за п.1, який відрізняється тим, що результатом нуклеотидної делеції є змінена експресія варіанта гена NBS1 у порівнянні з відповідним геном дикого типу. 3. Вектор, що містить полінуклеотид за п.1 або 2. 4. Вектор за п.3, який відрізняється тим, що полінуклеотид функціональним чином зв'язаний з регуляторними послідовностями експресії, що дають можливість експресії в прокаріотних або еукаріотних клітинах. 5. Клітина-хазяїн, одержана генно-інженерним шляхом, що містить полінуклеотид за п.1 або 2 або вектор за п.3 або 4. 6. Спосіб одержання молекулярного варіанта білка NBS1 або його фрагмента, пов'язаного з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати чи інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, при якому (а) культивують клітини-хазяїни за UA (21) a200600302 (22) 14.06.2004 (24) 10.02.2011 (86) PCT/PL2004/000044, 14.06.2004 (31) P-360642 (32) 13.06.2003 (33) PL (46) 10.02.2011, Бюл.№ 3, 2011 р. (72) ЦИБУЛСКІ ЦЕЗАР, PL, ЛУБІНСКІ ЯН, PL, ГОРСКІ БОГДАН, PL, ГЛІНЕВІЧ БАРТЛОМЕЙ, PL, СІКОРСКІ АНДЖЕЙ, PL (73) ПОМОРСКА АКАДЕМІЯ МЕДИЧНА, PL, ЦИБУЛСКІ ЦЕЗАР, PL, ЛУБІНСКІ ЯН, PL, ГОРСКІ БОГДАН, PL, ГЛІНЕВІЧ БАРТЛОМЕЙ, PL, СІКОРСКІ АНДЖЕЙ, PL (56) WO A 9955716, 04.11.1999 GORSKI BOHDAN ET AL: "GERMLINE 657DEL5 MUTATION IN THE NBS1 GENE IN BREAST CANCER PATIENTS" INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 106, no. 3, 16 May 2003 (2003-0516), pages 379-381 VARON R ET AL: "NIBRIN, A NOVEL DNA DOUBLESTRAND BREAK REPAIR PROTEIN, IS MUTATED IN NIJMEGEN BREAKAGE SYNDROME" CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, NA, US, vol. 93, 1 May 1998 (1998-05-01), pages 467-476 MASER RICHARD S ET AL: "An alternative mode of translation permits production of a variant NBS1 protein from the common Nijmegen breakage syndrome allele" NATURE GENETICS, vol. 27, no. 4, April 2001 (2001-04), pages 417-421 PLISIECKA-HALASA J ET AL: "Nijmegen breakage syndrome gene (NBS1) alterations and its protein (nibrin) expression in human ovarian tumours." ANNALS OF HUMAN GENETICS, vol. 66, no. 5-6, November 2002 (2002-11), pages 353-359 VARON R ET AL: "Mutations in the Nijmegen Breakage Syndrome gene (NBS1) in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL)." CANCER RESEARCH. 1 MAY 2001, vol. 61, no. 9, 1 May 2001 (2001-05-01), pages 3570-3572 RESNICK IGOR B ET AL: "657del5 mutation in the gene for Nijmegen breakage syndrome (NBS1) in a cohort of Russian children with lymphoid tissue malignancies and controls." AMERICAN JOURNAL 2 (19) 1 3 93344 4 п.5 і (б) виділяють зазначений білок чи фрагмент із культури. 7. Спосіб одержання клітин, здатних до експресії молекулярного варіанта гена NBS1, пов'язаного з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, що включає одержання генноінженерним шляхом клітин, що містять полінуклеотид за п.1 або 2 або вектор за п.3 або 4. 8. Білок NBS1 або його фрагмент, пов'язаний з підвищеною успадкованою схильністю до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, що кодується полінуклеотидом за п.1 або 2 або одержаний способом за п.6 або з клітин, одержаних способом за п.7. 9. Антитіло, що специфічно зв'язується з білком за п.8. 10. Антитіло за п.9, що специфічно розпізнає епітоп, що містить амінокислотні заміни, як вони визначені в п.1 або 2. 11. Молекула нуклеїнової кислоти, комплементарна полінуклеотиду за п.1 або 2. 12. Молекула нуклеїнової кислоти, здатна до специфічного розпізнавання і розщеплення полінуклеотиду за п.1 або 2. 13. Вектор, що містить молекулу нуклеїнової кислоти за п.11 або 12. 14. Трансгенна тварина, яка не відноситься до людини, що містить щонайменше один полінуклеотид за п.1 або 2 або вектор за п.3 або 4. 15. Трансгенна тварина, яка не відноситься до людини, за п.14, що додатково містить щонайменше одину інактивованну алель дикого типу гена NBS1. 16. Трансгенна тварина, яка не відноситься до людини, за п.14 або 15, що являє собою мишу чи пацюка. 17. Олігонуклеотид для генотипування індивідуальних алелей гена NBS1, який містить делецію п'яти нуклеотидів, що відповідає позиції 18155, 18156, 18157, 18158 або 18159. 18. Спосіб виявлення схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у суб'єкта, що включає (а) виявлення в біологічному зразку, взятому від суб'єкта, успадковані зміни 657del5 в послідовності гена NBS1, який відрізняється тим, що зазначена зміна спричиняє втрату значення гена NBS1; і (б) пов’язування даної зміни з показником схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у суб’єкта, в результаті чого виявлено дану схильність. 19. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що суб'єкт являє собою людину. 20. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що людина має слов'янське походження. 21. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що зміну виявляють за допомогою ПЛР з алельспецифічними олігонуклеотидами (ASO-ПЛР), аналізів на виявлення поліморфізму однониткової конформації (SSCP), прямого секвенування, алель-специфічної ампліфікації (ASA), мікрочіпів або ПЛР із використанням поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (RFLP-ПЛР). 22. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що біологічний зразок являє собою зразок тканини. 23. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що зразок тканини являє собою кров. 24. Спосіб за п.18, який відрізняється тим, що біологічний зразок містить лейкоцити. 25. Застосування успадкованої зміни 657del5 в послідовності гена NBS1 для виявлення успадкованої схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у суб'єкта. 26. Застосування за п.25, яке відрізняється тим, що суб'єкт являє собою людину. 27. Застосування за п.25, яке відрізняється тим, що людина має слов'янське походження. 28. Застосування за кожним із пп.25-27, який відрізняється тим, що наявність успадкованої зміни виявляють з використанням щонайменше одного з методів, вибраних з ASO-ПЛР, SSCP, мікрочипів, прямого секвенування, ASA або RFLP-ПЛР. 29. Діагностичний набір для ідентифікації схильності до інвазивного раку молочної залози долькового підтипу або до раку простати у суб'єкта, що включає пакувальний матеріал і щонайменше два різних полінуклеотиди, що дозволяють ампліфікувати щонайменше частину гена, що містить мутацію 657del5NBS1, вибраний з групи Nbsex6f (SEQ ID NO:6), Nbsex6r (SEQ ID NO:7) і Nbsdel5 (SEQ ID NO:8). Даний винахід відноситься, загалом, до засобів і способів діагностики та лікування ууспадковананої схильності до захворювань на рак, зокрема, до раку простати і/або дольковому інвазивному раку молочної залози, а також до використання успадкованих змін у гені NBS1 для діагностики цієї схильності. Зокрема, об'єкти винаходу дозволяють синтезувати фрагменти ДНК й ідентифікувати геномні аномалії, які пов'язані з підвищеною схильністю до згаданих видів раку. Також, даний винахід відноситься до полінуклеотидів молекулярних варіантів гену NBS1, які пов'язані зі успадкованою схильністю до захворювань на рак простати і/або дольковий інвазивний рак молочної залози, а також до векторів, що міс тять такі варіанти (полінуклеотиди). Окрім того, цей винахід відноситься також до клітингосподарів, які містять такі варіанти або вектори, і до їх використання для продукування варіантів білку NBS1. Також, цей винахід відноситься і до варіантів білку NBS1 і до антитіл, які специфічно розпізнають такий білок. Винахід також стосується трансгенних тварин, які не є людиною, які містять вищенаведені варіанти, або вектори. Крім того, даний винахід відноситься до способів знаходження і виробництва ліків для терапії видів раку, які пов'язані з порушеннями функції гену NBS1. Згідно цього винаходу, крім того, запропоновано фармацевтичні і діагностичні композиції, які містять вищезазначені варіанти ДНК, вектори, білки, антиті 5 ла та ліки, які можуть бути отримані вищенаведеними способами. Вказані композиції, зокрема, корисні для діагностики і лікування різних захворювань, а саме хвороб раку, ліками, які являють собою субстрати, інгібітори, або модулятори гену NBS1, або його продукту. Деякі документи цитуються протягом всього тексту даного опису. Кожний з документів, згаданих тут (включаючи будь які специфікації фірмвиробників, інструкції і т.і.), було включено у даний опис винаходу шляхом посилань, проте, не допускається, щоб будь який згаданий документ дійсно являв собою попередній рівень техніки у відношенні даного винаходу. Біохімічний шлях передачі сигналу ушкодження ДНК відіграє критичну роль у підтриманні цілісності геному у відповідь на пошкодження ДНК і залучення у патогенез раку. Індивідууми із рідкісними успадкованими рецесивними клінічними синдромами, такими як Ніймегенський синдром (NBS, Nijmegen breakage syndrome), синдром Блума, анемія Фанконі й атаксія-телеангіектазія (що характеризуються спонтанною хромосомною нестабільністю, імунодефіцитом і схильністю до раку), несуть мутацію в одному з генів біохімічного шляху передачі сигналу ушкодження ДНК (1, 2). Ген Ніймегенського синдрому локалізований на хромосомі 8q21 (3, див. також US6458534). Продукт гену NBS1 (нібрін, який також називається р95) являє собою компонент нуклеазного комплексу hMRE11/hRAD50/NBS1 (4). Цей комплекс є частиною BRCA1-асоційованого комплексу контролю геному (BASC, BRCА1-associated genome surveillance complex), який відповідає за репарацію пошкоджень ДНК (2). Делеція п'яти пар нуклеотидів у екзоні 6 NBS1 (657de15) є присутньою у більшості пацієнтів з NBS зі Східної Європи (5). Слід підкреслити, що вище згадані пацієнти є гомозиготними носіями мутації засновника Ніймегенського синдрому (алелі 657de15). Гетерозиготні носії мутацій NBS1 розповсюджені у Східній Європі (0,6% всього населення). Не дивлячись на давні зусилля дослідників, що спрямовані на розробку способу діагностики підвищеної схильності до раку різної локалізації, потреба у таких діагностичних способах все ще залишається. Відповідно, засоби і способи діагностики і, можливо, лікування підвищеної успадкованості до раку є все ще дуже бажаними. Таким чином, технічним завданням даного винаходу є задоволення потреб, описаних вище. Це технічне завдання вирішується пропонуванням об'єктів, які було охарактеризовано у формулі винаходу. Даний винахід заснований на відкритті нової, до цих пір невідомої кореляції між однією з форм гену NBS1 і підвищеною успадкованою схильністю до деяких видів раку. Несподівано, згідно винаходу, що визначений у формулі винаходу, з'ясовано, що ген NBS1 може відігравати роль у патогенезі раку простати (9) або інвазивної карциноми молочної залози долькового підтипу. Несподівано було встановлено, що гете 93344 6 розиготні носії мутації засновника Ніймегенського синдрому (аллель 657de15) можуть бути присутніми при підвищеному ризику раку, особливо раку простати і раку молочної залози. На основі відкриття цього явища розроблено діагностичні тести і реагенти таких тестів для специфічного виявлення і генотипування алелей NBS1 у людей. Визначення аллельного стану гену NBS1 у людей з використанням таких тестів може бути корисним для упередження або терапії різних захворювань, особливо раку, ліками, які являють собою субстрати, інгібітори або модулятори продукту гену NBS1. Згідно першого перевтілення, у винаході запропоновані полінуклеотиди молекулярних варіантів гену NBS1, які корелюють із ууспадковананою схильністю до раку, зокрема, до раку простати або дольковому інвазивному раку молочної залози, і тих, що відносяться до них втілення винаходу, такі як вектори, клітини-господарі, варіанти білків NBS1 і способи їх отримання. Згідно ще одного втілення винаходу, запропоновані способи ідентифікації і отримання ліківкандидатів і модуляторів, таких як інгібітори NBS1, для терапії або попередження раку, а також способи діагностики стану таких розладів/схильності. Згідно наступного втілення винаходу, запропоновані фармацевтичні і діагностичні композиції, які містять вищеописані полінуклеотиди, які містять їх вектори, білки, антитіла до них, а також ліки й інгібітори, які можуть бути отримані вищезгаданими методами. Фармацевтичні і діагностичні композиції, способи і застосування винаходу корисні для діагностики і лікування/попередження ууспадковананої схильності до раку. Виявлення варіацій у гені NBS1, які корелюють із ууспадковананою схильністю до раку, зокрема, до раку простати або дольковому інвазивному раку молочної залози, і діагностичні тести для розпізнавання різних алелей NBS1 у людських індивідуумів дають ефективний інструмент для удосконалення терапії і/або попередження раку. Відповідно, винахід відноситься до полінуклеотиду, який пов'язаний з підвищеною успадкованою схильністю до раку, зокрема, до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу, до того ж цей полінуклеотид відібрано з групи, яка складається із: (а) полінуклеотиду, який має нуклеїново-кислотну послідовність будь-який з SEQ ID NO:, або (б) полінуклеотид, який кодує поліпептид, що має амінокислотну послідовність будь-який з SEQ ID:, або (в) полінуклеотид, що кодує молекулярний варіант поліпептиду NBS1, де вказаний полінуклеотид, який містить заміну нуклеотиду, делецію нуклеотиду, допоміжний нуклеотид або допоміжний нуклеотид і заміну нуклеотиду у положенні, що відповідає позиції 18155, 18156, 18157, 18158 або 18159 топу NBS1 (Genbank, реєстраційний номер: АВ013139); (г) полінуклеотид, що кодує молекулярний варіант поліпептиду NBS1, де вказаний полінуклеотид містить делецію нуклеотиду в положенні, що відповідає позиції 18155, 18156, 18157, 18158 або 18159 гену NBS1 (Genbank, реєстраційний номер: АВ013139); (д) 7 полінуклеотид, який кодує молекулярний варіант пептиду NBS1, де вказаний поліпептид містить делецію амінокислоти в положенні від 234 до 754 поліпептиду NBS1 (SEQ ID №: 2) і, можливо, як найменше, одну заміну відібрану із заміни Lys на Asn у позиції 219, Gin на Leu у позиції 220, llе на Gin у позиції 221, Phe на Arg у позиції 222, Lys на Glu у позиції 223, Gly на Asn у позиції 224, Lys на llе у позиції 225, Thr на Туr у позиції 226, Phe на llе у позиції 227, llе на Phe у позиції 228, Phe на Glu у позиції 229, Leu на Cys у позиції 230, Asn на Gin у позиції 231, Ala на Thr у позиції 232, Lys на Ala у позиції 233 поліпептиду NBS1 (SEQ ID NO:2) і (e) полінуклеотид, який кодує молекулярний варіант поліпептиду NBS1, і має амінокислотну послідовність SEQ ID NO:4. У контексті даного винаходу термін «молекулярний варіант» гену або білку NBS1, як його використовують тут, означав, що вказаний ген або білок NBS1 відрізняється від гену або білку NBS1 дикого типу (геномні послідовності гену NBS1, описані, наприклад, під реєстраційним номером АВ013139) нуклеотидною(ними) заміною(ами), інсерцією(ями) і/або делецією(ями). Переважно результатом вказаної заміни нуклеотиду є присутність іншої амінокислоти в амінокислотній послідовності білку NBS1, передбаченим результатом якого є порушення функції цього білку. Термін «відповідний», як його використовують тут, означає, що позиція визначається не тільки числом попередників нуклеотидів і амінокислот відповідно. Позиція нуклеотиду або амінокислоти, які можуть бути відсутніми, бути замінені або містити один чи більше ніж один додатковий нуклеотид, у відповідності з даним винаходом, може бути різною за рахунок делецій або додаткових нуклеотидів або амінокислот деінде в іншому місці гену або поліпептиду. Отже, під «відповідною позицією» згідно винаходу слід розуміти те, що нуклеотиди або амінокислоти можуть розрізнятися за вказаним номером, але можуть при цьому мати такі ж сусідні нуклеотиди або амінокислоти. Зазначені нуклеотиди або амінокислоти, які можуть бути замінені, бути відсутні або містити додаткові нуклеотиди або амінокислоти, також включені у термін «відповідні позиції». Такі нуклеотиди або амінокислоти можуть, наприклад, разом з їхніми сусідами утворювати послідовності, які можуть бути залучені у регуляцію експресії гену, стабільність відповідної РНК або сплайсингу РНК, а також кодувати функціональні домени або мотиви білку за винаходом. У відповідності з даним винаходом генетичний варіант гену NBS1 досліджено шляхом аналізу послідовностей релевантних районів гену NBS1 людини. Добре відомим фактом є те, що геномна ДНК індивідуумів, які несуть індивідуальну генетичну структуру всіх генів, включаючи NBS, може бути легко виділена з індивідуальних зразків крові. Потім ці індивідуальні зразки ДНК використовують для аналізу послідовності алелей гену NBS1, які є у індивідуума, що надав зразок крові. Аналіз послідовності можна проводити за допомогою ПЛРампліфікації релевантних районів гену NBS1, наступною очисткою продуктів ПЛР з наступним ав 93344 8 томатичним секвенуванням традиційними методами (циклічне секвенування з барвником на термінатор АВ1). Одним із важливих параметрів, які слід враховувати під час спроби визначення індивідуального генотипу NBS1 (і, можливо, ідентифікувати нові варіанти гену NBS1), є той факт, що кожна людина несе (за досить незначними аномальними виключеннями) дві копії гену NBS1 - два алелі NBS1 (діплоідія), один ууспадковананий від матері, а другий - від батька. У зв'язку з цим деякі індивідууми несуть мутацію тільки в одній копії (алелі) гену (гетерозиготні носії мутацій). Ці пацієнти здорові і не мають аномального фенотипу. Рідкісні індивідууми мають, навпаки, мутації в обох алелях (гомозиготні носії мутації NBS1). Вони уражені синдромом NBS, який характеризується фенотипічними аномаліями. Імунодефіцитом, а також схильністю до раку, передусім злоякісних пухлин лімфатичної системи. Слід зазначити, що даний винахід фокусується на виявленні схильності до раку серед гетерозиготних носіїв мутації NBS1. Прикладом мутації у гені NBS1, ідентифікованої як корелююча із ууспадковананою схильністю до раку, зокрема, раку простати або дольковому інвазивному раку молочної залози, відповідно з даним винаходом, є 657de15. Аналізи на мутації здійснюються з використанням стандартних методик і докладно описані в прикладах. Генетичне тестування варіабельності популяції відносно генетичних маркерів успадкованої схильності до раку пропонується як інструмент корисний для ідентифікації і відбору пацієнтів, які можуть мати таку схильність. Ця ідентифікація/відбір можуть ґрунтуватися на молекулярній діагностиці генетичного поліморфізму шляхом генотипування ДНК, яка виділена, наприклад, з лейкоцитів крові пацієнта, і визначення характеристики можливої схильності. Для фундаторів охорони здоров'я, таких як організації охорони здоров'я США і урядові служби охорони здоров'я багатьох європейський країн. Цей фармакогенетичний підхід може бути як засобом удосконалення охорони здоров'я, так і шляхом, який дозволяє зменшити витрати, оскільки терапія раку досить дорого коштує. Результатом мутацій у варіантах генів NBS1 є амінокислотна(ні) делеція(її), інерція(її) і, зокрема, заміна(и) або відокремлено, або в сполученні. Звісно, можливо також створення таких мутацій генно-інженерним шляхом у генах дикого типу або в інших мутантних формах. Способи введення таких мутацій у послідовність ДНК гену NBS1 добре відомі спеціалістам у даній галузі, див., наприклад, Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. У найкращому перетворенні винаходу вищеописаний полінуклеотид кодує варіант білку NBS1 або його фермент, наприклад, такий що містить один або більше ніж один епітоп амінокислотної послідовності, яка кодується SEQ ID NO: 4. Для дослідження природи змін в амінокислотній послідовності білку NBS1 можна використовувати комп'ютерні програми, такі як BRASMOL, які можна взяти в Інтернеті. Крім того, моделі збірки і комп'ютерну реконструкцію структурних мотивів 9 можна здійснити, використовуючи інші комп'ютерні програми які підходять (Olszewski, Proteins 25 (1996)@ 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). Комп'ютери можна використовувати для конформаційного й енергетичного аналізу детальних білкових моделей (Monge, J. Моl. Віоl. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45. Ці аналізи можна використовувати для ідентифікації впливу конкретної мутації на зв'язування і/або взаємодію з іншими складовими нуклеазного комплексу hMRE11l/hRAD50/NBS1. Зазвичай вказана амінокислотна делеція, вставка або заміна в амінокислотній послідовності білку, який кодується полінуклеотидом, за винаходом, є наслідком однієї чи більше нуклеотидних замін, інерцій, або делецій, чи будь-яких їх сполучень. Найкращим результатом вказаної нуклеотидної делеції, вставки або заміни є делеція амінокислоти у позиції від 234 до 754 поліпептиду NBS1 (SEQ ID NO:2) і, можливо, в крайньому разі, одна заміна амінокислоти, яка відібрана серед заміни Lys на Asn у позиції 219, Gin на Leu у позиції 220, llе на Gin у позиції 221, Phe на Arg у позиції 222, Lys на Glu у позиції 223, Gly на Asn у позиції 224, Lys на llе у позиції 225, Thr на Туr у позиції 226, Phe на llе у позиції 227, llе на Phe у позиції 228, Phe на Glu у позиції 229, Leu на Cys у позиції 230, Asn на Gin у позиції 231, Ala на Thr у позиції 232, Lys на Ala у позиції 233 поліпептиду NBS1 (SEQ ID NO:2). Полінуклеотид, згідно з винаходом, може додатково містити одну, іншу ніж було вказано вище, нуклеотидну і, можливо, амінокислотну делецію, вставку і/або заміну, наприклад, делеції, вставки і заміни, що описані і відомі з рівня техніки. Втілення даного винаходу дає можливість дослідження сінергетичних ефектів мутацій гену NBS1 у відношенні ууспадковананої схильності до захворювання на рак у пацієнтів, які не мають такі мутантні форми гену або подібні мутантні форми, які можна імітувати вище описаними білками. Очікують, що аналіз вказаних синергетичних ефектів забезпечить більш глибоке розуміння механізму виникнення успадкованої схильності до раку. На основі вказаного більш глибокого розуміння механізму виникнення успадкованої схильності до раку. На основі вказаного більш глибокого розуміння розробка діагностичних і фармацевтичних композицій, які відносяться до хвороб раку, значно виграє. Ще більше варто уваги те, що при NBSзалежних видах раку відсутня функціональна копія гену (див. приклад 3: LOH). Таким чином, в раковій клітині залишається тільки мутантна копія. Тому, наприклад, інгібування мутантного алеля може привести до повної втрати білку NBS1 з клітини. Це повинно викликати загибель ракової клітини. Це є одним з можливих втілень терапевтичної мети даного винаходу. Таким чином, перевага втілення даного винаходу відноситься до полінуклеотидів молекулярних варіантів гену NBS1, де результатом нуклеотидної делеції, вставки і/або заміни є видозміна експресії варіанту гену NBS1 порівняно із відповідним геном дикого типу. 93344 10 Згідно даного винаходу, полінуклеотид може бути, наприклад, ДНК, кДНК, геномну ДНК, РНК чи отриману синтетичним шляхом ДНК або РНК, чи химерну молекулу нуклеїнової кислоти, яка продукується рекомбінантним шляхом, і містить будь який з цих полінуклеотидів, чи то один, чи то у сполученні. Переважно вказаний полінуклеотид, є часткою вектору, зокрема, тою, що традиційно використовують у генетичній інженерії плазмід, космід, вірусів і бактеріофагів, які містять полінуклеотид згідно даного винаходу. Такі вектори можуть містити додаткові гени, наприклад, маркерні гени, які дають можливість селекції вказаного вектору у відній клітині-господаря і відповідних умовах. В наступному переважному перевтіленні вектору, за даним винаходом, полінуклеотид функціональним чином пов'язаний з регуляторними послідовностями експресії які дають можливість експресії у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах. Експресія вказаного полінуклеотиду включає транскрипцію цього полінуклеотиду, переважно у мРНК, яка транслюється. Регуляторні елементи, які забезпечують експресію в еукаріотичних клітинах, переважно у клітинах ссавців, добре відомі спеціалістам даної галузі. Вони, зазвичай, містять регуляторні послідовності, які забезпечують ініціацію транскрипції і, можливо, полі-Α сигнали, що забезпечують термінацію транскрипції і стабілізації транскрипту. Додаткові регуляторні елементи можуть включати як транскрипційні так і трансляційні енхансери. Можливі регуляторні елементи, які забезпечують експресію у прокаріотичних клітинах-господарях, включають, наприклад, lac, trp або tac промотор в Е. coli, а прикладами регуляторних елементів, які забезпечують експресію в еукаріотичних господарях є промотор АОХ1 або GAL1 у дріжджах чи CMV-, SV40-, RSV-промотор (вірусу саркоми Рауса), cMV-енхансер, SV40-енхансер, чи то глобіновий інтрон у клітинах ссавців й інших тварин. Окрім елементів, які відповідальні за ініціацію транскрипції, такі регуляторні елементи можуть також включати сигнали термінації транскрипції, такі як полі-Α сайт SV40 чи полі-Α сайт tk, "вниз за течією" від полінуклеотиду. Відповідні, у даному контексті, експресивні вектори відомі у цій галузі, вони являють собою, наприклад, експресивний вектор кДНК Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogen), pSPORTl (GIBCO BRL). Переважно вказаний вектор являє собою експресивний вектор і/або вектор переносу чи направляючий вектор. Експресивні вектори отримані з вірусів, таких як ретровіруси, вірус вісповакцини, аденоасоційований вірус, віруси герпесу або вірус бичачої папіломи, можна використовувати для доставки полінуклеотидів або вектору, за винаходом, у популяцію клітин-мішеней. Для конструювання рекомбінантних вірусних векторів можна використовувати способи, добре відомі спеціалістам у даній галузі, див. наприклад, методики, описані у Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y., і у Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and 11 Wiley Interscience, N. Y. (1994). Або ж, полінуклеотиди і вектори, за винаходом, можна помістити у ліпосоми для доставки в клітини-мішені. Даний винахід, крім того, відноситься до клітин-господарів, які трансформовані полінуклеотидом або вектором за винаходом. Така клітинагосподар може являти собою прокаріотичну або еукаріотичну клітину, див. вище. Полінуклеотид чи вектор, за винаходом, який знаходиться у такій клітині-господарі, може бути чи інтегрованим у геном цієї клітини-господаря, чи може підтримуватися екстрахромосомно. У цьому відношенні також повинно бути зрозумілим, що рекомбінантну молекулу ДНК, за винаходом, можна використовувати для "направлення гену" і/або "заміщення гену", для відновлення мутантного гену чи для створення мутантного гену шляхом гомологічної рекомбінації, див., наприклад, Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press. Клітина-господар являє собою прокаріотичну чи еукаріотичну клітину, таку ж як клітина бактерій, комах, грибів, рослин, тварин чи людини. Перевагою клітин грибів є, наприклад, клітини грибів роду Saccharomyces, зокрема, виду S. cerevisiae. Термін "прокаріотичний" означає той, який включає в себе всі бактерії, які можна трансформувати чи трансфіціювати полінуклеотидом для експресії варіанту білку NBS1 або його ферменту. Прокаріотичні господарі можуть включати в себе як грамнегативні, так і грампозитивні бактерії, такі як, наприклад, Е. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Полінуклеотид, який кодує мутантну форму варіантів білків NBS1, можна використовувати для трансформації чи трансфекції господаря за допомогою будь-якої з методик, загально відомих звичайним спеціалістам у даній галузі. Способи отримання злитих, функціональним чином пов'язаних генів і їх експресії в бактеріальних або тваринних клітинах добре відомих у даній галузі знань (Sambrook, див. вище). Генетичні конструкції і способи, і\або були тут описані, можуть бути використані для здійснення експресії білківваріантів NBS1, наприклад, у прокаріотичних господарів. В цілому, експресивні вектори, які вміщують промоторні послідовності, що сприяють ефективній транскрипції полінуклеотиду вставки, використовують разом із господарем. Експресивний вектор, зазвичай, містить точку початку реплікації, промотор і термінатор, а також специфічні гени, які здатні забезпечувати фенотипічну селекцію трансформованих клітин. Трансформованих прокаріотичних господарів можна вирощувати у ферментерах і культивувати за методиками, відомими у даній галузі для досягнення оптимального клітинного росту. Потім білки, за даним винаходом, можна виділити із середовища для росту, із клітинних лізатів або клітинних мембранних фракцій. Виділення і очистку поліпептидів за винаходом, які експресуються у мікробах або в інших організмах, можна здійснювати будь-якими традиційними способами, такими як, наприклад, розділення препаративною хроматографією, в яку залучено використання моноклональних чи поліклональних антитіл. 93344 12 Таким чином, до наступного втілення винаходу відноситься спосіб отримання варіантів білків NBS1 і їхніх фрагментів, при цьому культивують клітину-господаря, як визначено вище, в умовах, які дають можливість експресії білку, і виділяють білок, який продукується, або його фрагменти з культури. До іншого втілення винаходу відноситься спосіб отримання клітин, які здатні до експресії варіанту гену NBS1, що включає створення генноінженерними методами клітин, які включають в себе полінуклеотид або с вектор за винаходом. Клітини, які були отримані за допомогою способу за даним винаходом, можна використовувати, наприклад, для тестування ліків способами, які описано D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand, Cells, a Lab manual, CSH Press 1998. Крім того, ці клітини можна використовувати для дослідження відомих ліків і їх невідомих похідних на їх здатність до комплементації розладів, викликаних мутаціями у гені NBS1 (наприклад, схильність до злоякісних утворювань). Для цих втілень у клітинахгосподарях переважно відсутній алель дикого типу, обидва алелі гену NBS1 і/або у меншості один і них такий, що пройшов мутації. Або ж сильну надекспресію алелю, що пройшов мутацію по відношенню до нормального алелю і порівняно з рекомбінантною експресуючою клітинною лінією, яка експресує нормальний алель на подібному рівні, можна використовувати в якості системи скринінгу і аналізу. Клітини, які можуть бути отримані вищенаведеними способом, можна також використовувати для скринінгу способами, які описано нижче. Крім того, винахід відноситься до варіанту білку NBS1 або його фрагментам, які кодуються поліпептидом за винаходом, чи отриманим вищеописаними способами, чи таким, що отримують з клітин, сконструйованих вищеописаним способом. У даному контексті також зрозуміло, що варіанти білків NBS1 згідно даного винаходу можна додатково модифікувати традиційними способами, які відомі у цій галузі. Із використанням варіантів білків NBS1 по цьому винаходу можна також визначити ділянки, релевантні за їх біологічною активністю або її інгібуванню, а саме за їх участю в утворенні правильного нуклеазного комплексу hMRE11/hRAD50/NBS1. Даний винахід, в подальшому відноситься до антитіл, які специфічно розпізнають варіант білку NBS1 за винаходом. Переважно, це антитіло специфічно розпізнає епітоп, який містить одну або більше ніж одну амінокислотну заміну, як було описано вище. Антитіла проти варіанту білку NBS1 за винаходом чи його (синтезованого) фрагменту як антигену. Моноклональні антитіла можуть бути отримані, наприклад, за допомогою методик, які вперше були описані у Kohler and Milstein, Nature 256 (1975)7 495, і Galfr6, Meth. Enzymol. 73 (1981)9 3 і включають злиття клітин мієломи миші з клітинами селезінки, які було виділено з імунізованих тварин. Антитіла можуть представляти собою моноклональні антитіла, поліклональні антитіла або синтезовані антитіла, а також фрагменти антитіл, такі як Fab, Fv чи scFv фрагменти і т.і. Крім того, антитіла до вищенаведених поліпептидів або їх 13 фрагменти можуть бути отримані способами, які було описано, наприклад, у Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Такі антитіла можна використовувати, наприклад, для імунопреципітації і імунолокалізації варіантів білків NBS1 за винаходом, а також для моніторингу на присутність таких варіантів білків NBS1, наприклад, у рекомбінантних організмах, а також для ідентифікації сполук, які взаємодіють з білками за даним винаходом. Наприклад, поверхневий резонанс плазмонний, який використовують у системі ВІАсоrе, можна використовувати для підсилення ефективності фагових антитіл, які пов'язуються з епітопом білку за даним винаходом (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995) t 713). Крім того, даний винахід відноситься до молекул нуклеїнових кислот, які являють собою або містять комплементарну нитку будь-якого з вищеописаних полінуклеотидів або її частину, таким чином, мають відмінності як мінімум на один нуклеотид порівняно з відповідними нуклеотидними послідовностями гену NBS1 дикого типу, а саме маючи вищеописані нуклеотидні заміни, делеції і вставки. Така молекула може чи являти собою дезоксирибонуклеїнову кислоту, чи рибонуклеїнову кислоту. Такі молекули включають, наприклад, антизмістовну РНК. Ці молекули можуть, крім того, бути зчепленими з послідовностями, які при транскрипції кодують рибосоми, продукуючи, таким чином, рибозим, який специфічно розщеплює транскрипти полінуклеотидів за даним винаходом. Крім того, даний винахід відноситься до вектору, який містить молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом. Приклади таких векторів описано вище. Переважно молекула нуклеїнової кислоти, присутня у векторі, функціональним чином зчеплена з регуляторними елементами, які дають можливість експресії у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах-господарях; див. вище. Даний винахід також стосується способу створення трансгенної тварини, не людини, переважно трансгенної миші, при якому вводять полінуклеотид або вектор за винаходом у зародкову клітину, ембріональну клітину, стволову клітину або яйцеклітину або клітину, яка є похідною від них. Тварина, не людина, може бути використана у способі за винаходом, описаному нижче, і може являти собою не трансгенну здорову тварину, або може мати розлад, переважно розлад, який викликано як мінімум однією мутацією у гені NBS1. Такі трансгенні тварини добре підходять, наприклад, для фармакологічних досліджень ліків у зв'язку з варіантними формами вищеописаних варіантів білків NBS1, оскільки ці білки або в меншому ступені їх функціональні домени є консервативними між видами у вищих еукаріот, зокрема у ссавців. Отримання трансгених ембріонів і їх скринінг можна здійснювати, наприклад, як описано A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. ДНК ембріонів можна аналізувати, проводячи, наприклад, Саузерн-блотiнги з відповідним зондом. 93344 14 Даний винахід також стосується трансгенних тварин, не людини, таких як, наприклад трансгенні миші, щури, хом'яки, собаки, мавпи, кролі, свині, С. elegans і риби, такі як, наприклад, електричні скати, які містять полінуклеотид чи вектор за винаходом, або отримані вищеописаним способом, переважно де вказаний полінуклеотид чи вектор стабільно інтегрований у геном вказаної тварини, не людиною, переважно таким чином, що у присутності вказаного полінуклеотиду чи вектору приводить до експресії варіанту білку MDR за винаходом. Тварина може мати одну або кілька копій цього чи інших нуклеотидів варіанта гену NBS1. Ця тварина може мати різне застосування, включаючи застосування як дослідну модель злоякісного процесу, отже є новою і ціною твариною при розробці шляхів терапії, лікування і т.і. захворювань, які викликані дефіцитом чи недостатністю правильної репарації пошкодженої ДНК у клітині. Відповідно, у даному випадку тварина переважно є лабораторною твариною, такою як миша або щур. Трансгенна тварина, не людина, за винаходом додатково містить як мінімум один активований алель дикого типу гену NBS1. Розуміння цього дає можливість, наприклад, досліджувати взаємодію різних варіантних форм білків NBS1. Можливо, також, бажано інактивувати експресію або функцію гену NBS1 на визначеній стадії розвитку і/або життя цієї транс генної тварини. Це можна здійснити, наприклад, використовуючи тканина специфічні, регульовані розвитком і/або клітиною і/або індуцибельні промотори, що направляють експресію, наприклад, анти смислової РНК або рибосома, направленого проти транс крипту РНК гену NBS1; див. також вище. Підходящою індуцибельною системою є, наприклад, гена експресія, яка регулюється тетрацикліном, як описано, наприклад, Gossen and Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992) 5547-5551 и Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62). Подібним чином експресію варіанту гену NBS1 можна регулювати такими регуляторними елементами. При наявності варіантів полінуклеотидів NBS1, а також білків і векторів за винаходом тепер можливо досліджувати in vivo u in vitro ефективність репарації пошкоджень ДНК у відношенні конкретних мутацій у гені NBS1. Крім того, варіанти білків NBS1 можна використовувати для визначення фармакологічного профілю протипухлинних ліків і для ідентифікації і отримання додаткових ліків, які можуть бути більш ефективними для лікування раку, зокрема, для ослаблення деяких фенотипів, які викликані відповідними мутаціями, таким як описано вище. Наступне втілення винаходу відноситься до способу ідентифікації і отримання модулятору NBS1, який здатний до модулювання активності молекулярного варіанту гену NBS1 або його генного продукту, при якому: (а) приводять у контакт білок за п.8 або клітину, що експресує молекулярний варіант гену NBS1, який містить полінуклеотид за п.1 чи 2., у присутності компонентів, здатних забезпечувати сигнал, який детектується у відповідь на активність білку NBS1, із сполученням, яке підлягає скринінгу, в умовах, які дають можливість 15 проявлення активності білку NBS1, і (б) визначають наявність або відсутність сигналу або зростання сигналу це є показником передбачуваного модулятора. Термін "сполучення" у способі за винаходом включає одну речовину або безліч речовин, які можуть бути однаковими або різними. Вказана(ні) сполука(ки) можуть бути синтезовані хімічним шляхом або продукуватися при ферментації мікроорганізмів, а також може міститися у зразках, наприклад, клітинних екстрактів, рослин, тварин чи мікроорганізмів. Крім того, вказані сполуки можуть бути відомими у даній галузі, але до цих пір не відомими як такі, що є корисними як інгібітори відповідно. Безліч сполук можна, наприклад, додавати у культуральне середовище або ін'єктувати ним клітину або тварину за винаходом, що не являє собою людину. Якщо зразок, який містить (а) сполуку(и) ідентифікований у способі за винаходом, тоді можливо або виділити цю сполуку з вихідного зразка, який ідентифіковано як такий, що містить необхідну сполуку, або можна далі розділити вихідний зразок, наприклад, якщо він складається з багатьох різних сполук, так щоб зменшити число різних сполук на зразок, і повторити цей спосіб з частинами, які отримані розділенням вихідного зразку. Потім можна визначити чи проявляє вказаний зразок або сполука бажані властивості, наприклад, способами, які описані в даному документі або у літературі (Spector et al., Cells manual; див вище). У залежності від складності зразків вищенаведені стадії можна проводити кілька разів, переважно до тих пір, поки зразок, який ідентифіковано способом, за винаходом, не буде містити тільки обмежену кількість речовин або тільки одну речовину. Зазвичай, вказаний зразок містить речовини з подібними хімічними і/або фізичними властивостями, і скоріше, вказані речовини подібні. Способи, за винаходом, можуть бути легко здійсненими і спланованими спеціалістом даної галузі, наприклад, з використанням інших аналізів на клітинній основі, які описано на рівні техніки, або шляхом використання і модифікацій, які описані у даному документі. Крім того, спеціаліст у даній галузі може легко зрозуміти, які додаткові сполуки і/або ферменти можна використовувати для здійснення способів за винаходом, наприклад, ферменти, якщо необхідно, які перетворюють якусь сполуку в його попередника, який, у свою чергу, є субстратом для білку NBS1. Така адаптація способу за винаходом, входить у компетенцію спеціаліста у даній галузі і може бути здійснена без зайвого експериментування. Сполуки, які можна використовувати у відповідності з даним винаходом, включають пептиди, білки, нуклеїнові кислоти, антитіла, невеликі органічні сполуки, ліганди, пептидоміметики, РНК і таке інше. Способи отримання хімічних похідних і аналогів добре відомі спеціалістам у даній галузі і описані, наприклад, у Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 USA, і у Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Крім того, 93344 16 вказані похідні і аналоги можна тестувати на їх ефекти способами, відомими у даній галузі або як описано у даному документі. Крім того, пептидоміметики і/або комп'ютерний дизайн похідних і аналогів відповідних ліків можна використовувати, наприклад, у способах, які описані нижче. Такі аналоги включають молекули, які мають у своїй основі структури відомих MDR-субстратів і/або інгібіторів і/або модуляторів, див. нижче. Відповідні комп'ютерні програми можна використовувати для ідентифікації інтерактивних сайтів модулятора/інгібітора, що передбачений і білку NBS1 по винаходу за допомогою комп'ютерних програм пошуку комплементарних структурних мотивів (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114120). Додаткові комп'ютерні системи, які підходять для комп'ютерного дизайну білків і пептидів описані в ріні техніки, наприклад, у Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994) 7 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987) 2 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987. Результати отримані на основі вище описаного комп'ютерного аналізу, можна використовувати в поєднанні зі способом за даним винаходом, наприклад, для оптимізації відомих модуляторів/інгібіторів. Пептидоміметики які підходять та інші інгібітори можуть також бути ідентифіковані шляхом синтезу комбінаторних бібліотек пептидоміметиків за допомогою послідовної хімічної модифікації і тестування отриманих сполук, наприклад, зазначеними тут способами. Способи отримання та застосування комбінаторних бібліотек пептидоміметиків описані в рівні техніки, наприклад, у Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234, та Domer, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709. Крім того, для дизайну пептидоміметичних ліків можна використовувати трьохмірну і/або кристалографічну структуру інгібіторів і білку NBS1 за винаходом (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558). У стислому викладі цього винаходу запропоновані способи ідентифікації та отримання сполук, які можуть бути використані для лікування/попередження захворювання на рак. В наступному втіленні даний винахід відноситься до способу ідентифікації і отримання модулятора NBS1, який здатен до модулювання активності молекулярного варіанту гену NBS1 або його генного продукту, при якому: (а) приводять до контакту білок за п.8 з першою молекулою, яка відома тим, що зв'язується білком NBS1, з утворенням першого комплексу, який містить зазначений білок та зазначену першу молекулу, (б) приводять у контакт зазначений перший комплекс із сполукою, що піддається скринінгу, і (в) виміряють, чи витискає зазначена сполука зазначену першу молекулу із зазначеного першого комплексу. Переважно, у даному способі зазначена стадія вимірювання включає вимірювання утворення другого комплексу зазначеного білку із зазначеною сполукою - кандидатом у модулятори. Переважно, зазначена стадія вимірювання включає в себе вимірювання кількості зазначеної першої молекули, яка не зв'язалась із зазначеним білком. 17 Крім того, переважно, щоб у способі винаходу, зазначена перша молекула була помічена, наприклад, радіоактивною або флуоресцентною міткою. Ще в одному втіленні даний винахід відноситься до способу діагностики підвищеної успадкованої схильності до захворювань на рак, при якому (а) визначають присутність полінуклеотиду по винаходу у зразку, який взято від суб'єкту, і/або (б) визначають присутність варіантів білку NBS1, наприклад, з антитілом, за винаходом. У відповідності з даним втіленням згідно даного винаходу, спосіб тестування стану успадкованої схильності до захворювання на рак можна здійснювати шляхом використання полінуклеотиду або молекули нуклеїнової кислоти, за винаходом, наприклад, у формі Саузерн або Норзерн-блотiнгу або аналізу in situ. Зазначену послідовність нуклеїнової кислоти можна гібридизувати з кодуючою дільницею будь- якого з генів або з некодуючою дільницею, наприклад, з інтроном. У випадку, коли комплементарну послідовність використовують у способі за винаходом, зазначену молекулу нуклеїнової кислоти можна знову використати у в Норзерн-блотінгах. Крім того, показане тестування можна проводити у зв'язку з даним блокуванням, наприклад, вважається що транскрипція гену має терапевтичну релевантність. Крім того, праймер або олігонуклеотид можна також використовувати для гібридизації з одним з вище згаданих генів NBS1 або відповідних м РНК. Нуклеїнові кислоти, які використовують для гібридизації. Зазвичай можуть бути для зручності мічені шляхом включення або приєднання, наприклад, радіоактивного чи іншого маркеру. Такі маркери добре відомі в цій галузі. Мічення вказаних молекул нуклеїнових кислот можна здійснювати традиційними способами. Крім того, моніторинг наявності або експресії варіантів генів NBS1 можна здійснювати з використанням пари праймерів, які специфічно гібридизуються з будь-якою із відповідних послідовностей нуклеїнової кислоти, і проводячи реакції ПЛР за стандартними методиками. Специфічна гібридизація вищезгаданих зондів або праймерів переважно відбувається у жорстких умовах гібридизації. Термін "жорсткі умови гібридізації" відомий у даній галузі, див., наприклад, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985. Крім того, мРНК, кРНК, кДНК або геномну ДНК, яка отримана від суб'єкту, можна секвенувати для ідентифікації мутацій, які можуть бути характеристичними фінгерпринтами мутацій гену NBS1. Далі, даний винахід включає способи де такий фінгерпринт можна створити з використанням поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів (RFLP) ДНК чи РНК, яка отримана від суб'єкта, можливо, ДНК або РНК можна ампліфікувати перед аналізом добре відомим у даній галузі. Отримати фінгерпринти РНК можна, наприклад, шляхом ферментативного гідролізу зразка РНК, який отримано від суб'єкта, ферментом що підходить для РНК, наприклад, РНКазою 93344 18 Т1, РНКазою Т2 і т.і., або рібозимом, і, наприклад, електрофоретичним розділенням і детекцією фрагментів РНК як описано вище. Подальші модифікації вищенаведеного втілення винаходу можуть бути легко зроблені спеціалістом у даній галузі без зайвого експериментування на основі даного опису винаходу; див., наприклад, приклади. Додаткове втілення даного винаходу відноситься до способу, в якому вказане визначення здійснюється з використанням антитіла або його ферменту, за винаходом. Антитіло, яке використовують у способі, за винаходом, може бути міченим мітками які детектуються, такими як, гістидинові "прапорці" або молекули біотину. У кращому втіленні способу по дійсному винаході, вищеописані способи включають ПЛР, лігазну ланцюгову реакцію, рестрикційний ферментативний гідроліз, пряме секвенування, методику ампліфікації нуклеїнових кислот, мікрочіпи, методики гібридизації або імунологічні аналізи (Sambrook et al., loc. cit. CSH cloning, Harlow and Lane loc. cit. CSH antibodies). У кращому втіленні способу по дійсному винаході вказане захворювання на рак являє собою рак простати або інвазивний рак молочної залози долькового підтипу. У кращому втіленні способу по дійсному винаході наступна стадія, даного винаходу, включає введення суб'єкту ліків, які для видалення або зменшення вказаного захворювання на рак. У кращому втіленні способу по дійсному винаході, вказані ліки являють собою хіміотерапевтичний агент, такий як адріаміцин, доксорубіцин, паклитаксол (таксол) та інші MDR-субстрати, Ambudkar SV. et al., Amu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39 (1999) 9 361. У кращому втіленні способу по дійсному винаході, вказаний спосіб додатково включає введення у клітину (і) функціонального і експресуємого гену NBS1 дикого типу або (іі) молекули нуклеїнової кислоти чи то вектора. У даному контексті, а також як використовується по ходу всього винаходу, термін «функціональний» ген NBS1 означає ген, де білок що кодується має частину або всю первинну структурну конформацію білку NBS1 дикого типу, тобто має біологічні властивості участі у нуклеазному комплексі. hMRE11/hRAD50/NBS1 з правильною активністю. Дане втілення винаходу підходить для терапії/попередження раку. Виявлення експресії варіанту гену NBS1 дозволить зробити висновок, що вказана експресія взаємозв'язана зі схильністю або із підтримкою певного фенотипу раку. Відповідно. Ця стадія буде використовуватися для зниження рівня експресії до більш низьких рівнів або для зупинення експресії. Це можна зробити, наприклад, шляхом як мінімум часткової елімінації експресії мутагенного гену біологічними способами, наприклад, використовуючи ферменти, анти смислові молекули нуклеїновиї кислот, внутрішньоклітинні антитіла або вищеописані інгібітори проти варіантних форм цих білків NBS1. Крім того, можна розробити фармацевтичні продукти, які знижують рівень експресії відповідних білків і генів. 19 У наступному втіленні винахід відноситься до способу приготування фармацевтичної композиції, яка включає стадії будь якого з вищеописаних способів і стадій синтезу і/або включення у препарат сполуки, ідентифікованої на стадії (6). Або його похідної або гомолога у фармацевтично принадній формі. Терапевтично корисні сполуки, ідентифіковані згідно способу за винаходом, можна включати у препарат і вводити пацієнту, як обговорюється вище. Застосування та терапевтичні дозування, які визначені спеціалістом у даній галузі, як придатні, див нижче. Далі, даний винахід відноситься до способу приготування фармацевтичної композиції, що включає стадії будь якого із вищеописаних способів і стадії включення у препарат ліків або проліків у формі, яка принадна для терапевтичного застосування і попередження або ослаблення розладів у суб'єкта, якому проводили діагностику способом за винаходом. Ліки або проліки після їх введення in vivo перетерплюють перетворення в ході процесів обміну речовин з метою видалення чи то шляхом виділення, чи то шляхом перетворення в один або більше активних чи не активних метаболітів (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449459). Отже, замість самої сполуки чи інгібітору, ідентифікованого і отриманого способами за даним винаходом, скоріш за все, слід використовувати відповідний препарат у вигляді проліків, який перетворює в його активну форму в організмі пацієнта. Запобіжні заходи, які можуть бути прийняті при застосуванні проліків та ліків, описано у літературі, див. обор у Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329. У кращому втіленні способу по дійсному винаході зазначений винахід або проліки являє собою похідні ліків, як зазначено вище. Ще в одному втіленні дійсний винахід відноситься до інгібітору, який ідентифіковано або отримано способом описаним вище. Переважно цей інгібітор специфічно зв'язується з варіантом білку NBS1 за винаходом. Антитіла, молекули нуклеїнових кислот і інгібітори за динам винаходом переважно мають специфічність, в меншій мірі власне кажучи ідентичної специфічності зв'язування природного ліганду або партнеру зв'язування білку NBS1 за винаходом. Антитіло або інгібітор може володіти зв'язувальною спорідненістю до білку NBS1 в меншій мірі 105М-1, переважно вище за 107М-1 і найбільш переважно аж до 1010М-1 у випадку, коли активність NBS1 повинна бути подавлена. Отже, в переважному втіленні суп ресорне антитіло або інгібітор за винаходом має спорідненість і меншій мірі приблизно 10-7М, бажано в меншій мірі приблизно 10-9Μ і найбільш бажано приблизно 10-11Μ. Крім того, даний винахід відноситься до застосування оліго- або полінуклеотиду для виявлення полінуклеотиду за винаходом і/або для генетипування відповідних індивідуальних алелей NBS1. Бажано вказаний оліго- або полінуклеотид являє собою полінуклеотид або молекулу нуклеїнової кислоти за винаходом, що описано вище. 93344 20 У конкретному переважному втіленні довжина вказаного олігонуклеотиду складає приблизно від 10 до 100, більш бажано від 15 до 90 нуклеотидів, він містить нуклеотидну послідовність, яка входить в одну з SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:512 або послідовність, яка комплементарна будь який з них. Отже, ще в одному із наступних втілень даний винахід відноситься до праймеру або зонду, який складається з олігонуклеотидів, як було визначено вище. У даному контексті термін "який складається з" означає, що нуклеотидна послідовність, що описана вище і яка використовується для праймерів або зондів за винаходом, не має яких-небудь додаткових нуклеотидних послідовностей гену NBS1, які безпосередньо належать до її 5' або 3' кінців. Проте інші угрупування, такі як мітки, наприклад, молекули біотину, гістидинові "прапорці", фрагменти антитіл, колоїдне золото і т.і., а також нуклеотидні послідовності, які не відповідають гену NBS1, можуть бути присутніми, за винаходом, у праймері і зондах. Крім того, також можливо використовувати конкретні вищеописані нуклеотидні послідовності і комбінувати їх з іншими нуклеотидними послідовностями, які отримано з гену NBS1, де ці додаткові нуклеотидні послідовності розподілені між угрупуваннями, що відрізняються від нуклеїнових кислот, або де нуклеїнові кислоти не відповідають нуклеотидним послідовностям гену NBS1. Крім того, даний винахід відноситься до застосування антитіла або речовини, яка здатна до специфічного зв'язування з генним продуктом гену NBS1, для виявлення варіанту білку NBS1 за винаходом, експресії молекулярного варіанту гена NBS1, який містить полінуклеотид за винаходом. Також, даний винахід відноситься до композиції, переважно фармацевтичної композиції, що містить антитіло, молекулу нуклеїнової кислоти, вектор або інгібітор за даним винаходом й, можливо, фармацевтично прийнятний носій. Ці фармацевтичні композиції, що містять, наприклад, інгібітор або його фармацевтично прийнятні солі, можна зручно вводити кожним зі шляхів, загальноприйнято використовуваних для введення ліків, наприклад, перорально, місцево, парентерально або шляхом інгаляції. Прийнятні солі включають ацетат, метиловий ефір, гідрохлорид, сульфат, хлорид тощо. Сполуки можна вводити в традиційних лікарських формах, виготовлених шляхом об'єднання ліків зі стандартними фармацевтичними носіями відповідно до традиційних методик. Ці методики можуть включати змішування, гранулювання й пресування або розчинення інгредієнтів, як придатно, з одержанням бажаного препарату. Повинно бути зрозуміло, що форма й характер фармацевтично прийнятного носія або розріджувача продиктовані кількістю активного інгредієнта, з яким його поєднують, а також із введенням й інших добре відомих змінних. Носій(ї) повинен(ні) бути «прийнятним»(и) у значенні сумісності з іншими інгредієнтами препарату й нешкідливості для реципієнта. Фармацевтичний носій, що застосується, може бути, наприклад, твердим або рідким. Прикладами твердих носіїв є лактоза, магнезія, сахароза, тальк, желатин, агар, пектин, 21 аравійська камедь, стеарат магнію, стеаринова кислота й т.п.Прикладами рідких носіїв є забуферений фосфатом фізіологічний розчин, сироп, масло, таке як арахісове масло й оливкове масло, вода, емульсії, різні типи зволожуючих агентів, стерильні розчини тощо. Подібним чином, носій або розріджувач може включати матеріал, що сповільнює вивільнення, добре відомий у даній області, наприклад глицерилмоностеарат або глицерилдистеарат, один або в комбінації з воском. Режим дозування ліків будуть визначатися лікарем й іншими клінічними факторами; переважно, відповідно до кожного з вищеописаних способів. Як добре відомо в медицині, дозування для будьякого пацієнта залежать від багатьох факторів, включаючи розмір пацієнта, площу поверхні тіла, вік, конкретну сполуку, яку потрібно вводити, стать, час і шлях введення, загальний стан здоров'я й інші лікі, які вводять одночасно. Моніторинг прогресу проводять шляхом періодичного обстеження. Крім того, застосування фармацевтичних композицій, що містять антизмістові олігонуклеотиди, що специфічно гібридизуються із РНК, які кодуються варіантами мутованого гена NBS1 за винаходом, що містять антитіла, що специфічно розпізнають білок NBS1, який мутується але не розпізнають, або власне кажучи не розпізнають функціональну форму дикого типу, можливо у випадках, у яких концентрація мутованої форми в клітинах повинна бути знижена. Крім того, даний винахід відноситься до діагностичної композиції або до набору, що містить кожну з вищезгаданих полінуклеотидів, векторів, клітин-хазяїв, варіантів білків NBS1, антитіл, інгібіторів, молекул нуклеїнових кислот або відповідних векторів за винаходом й, можливо, підходящі засоби для виявлення. Набір за винаходом може містити додаткові інгредієнти, такі як селективні маркери й компоненти для селективних середовищ, придатні для одержання трансгенних клітин і тварин. Набір за винаходом переважно можна використати для здійснення способу за винаходом, а також можна, серед іншого, використати його для різного застосування, наприклад, в області діагностики або як дослідницький інструмент. Частини набору за винаходом можуть бути упаковані індивідуально у флаконах або в комбінації в контейнерах або пристроях з множини контейнерів. Виробництво цього набору переважно здійснюють за стандартними методиками, які відомі фахівцям у даній області. Набір або діагностичні композиції можна використати в способах виявлення експресії мутантної форми гена NBS1 й у кожному з вищеописаних способів за винаходом, застосовуючи, наприклад, методики імунологічного аналізу, такі як радіоімунологічний аналіз або ферментативний імунологічний аналіз, або, переважно, гібридизацію нуклеїнових кислот й/або методики ампліфікації, такі як описані вище й у прикладах, або методики на основі мікрочипів. Деякі генетичні зміни приводять до зміненого конформаційного стану білка. Відновлення нормальної або регульованої конформації мутованих 93344 22 білків являє собою найбільш витончений і специфічний шлях виправлення цих молекулярних дефектів, хоча він і важкий. Фармакологічні маніпуляції, таким чином, можуть мати на меті відновлення конформації білка дикого типу. Таким чином, полінуклеотиди й білки, що кодуються за даним винаходом можна також використати для дизайну й/або ідентифікації молекул, які здатні активувати функцію гена або білка NBS1 дикого типу. В іншому втіленні даний винахід відноситься до застосування ліків або проліків для виготовлення фармацевтичної композиції для лікування або попередження розладу, способом, що діагностується, що описаний вище. Крім того, даний винахід відноситься до застосування ефективної дози послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує функціональний й експресований білок NBS1 дикого типу, для готування фармацевтичної композиції для лікування, попередження й/або вповільнення розладу, способом, що діагностується за винаходом. Ген, що кодує функціональний й експресований білок NBS1, можна вводити в клітини, які, у свою чергу, продукують необхідний білок. Генотерапія, що заснована на введенні терапевтичних генів у клітини за допомогою ex-vivo або in-vivo методик, є одним з найбільш важливих застосувань переносу генів. Вектори й способи, придатні для in-vitro або in-vivo генотерапії, описані в літературі й відомі фахівцям у даній області; див., наприклад, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957 або Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996) 3 635-640, а також джерела, що приводять у даному документі. Ген може бути призначений для прямого введення або введення за допомогою ліпосом або вірусних векторів (наприклад, аденовірусних, ретровірусних) у клітину. Переважно, зазначена клітина являє собою зародкову клітину, ембріональну клітину або яйцеклітину або її похідну, найбільш переважно зазначена клітина являє собою стовбурну клітину. Як зрозуміло з вищеописаного, переважно, щоб при застосуванні відповідно до винаходу послідовність нуклеїнової кислоти була функціональним чином зчеплена з регуляторними елементами, що дають можливість експресії й/або напрямку білка NBS1 до конкретних клітин. Придатні системи доставки генів, які можна використати відповідно до винаходу, можуть включати ліпосоми, рецептор-опосередковані системи доставки, голу ДНК і вірусні вектори, такі як, серед іншого, віруси герпеса, ретровіруси, аденовіруси й аденоасоційовані віруси. Для гемотерапії доставку нуклеїнових кислот у конкретний сайт в організмі можна також здійснювати з використанням біолістичної системи доставки, такої як описана Williams (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Стандартні способи трансфекції клітин рекомбінантними ДНК добре відомі фахівцям в області молекулярної біології, наприклад, вони описані в WO 94/29469, 23 див. також вище. Генотерапію можна здійснювати шляхом безпосереднього введення молекули рекомбінантної ДНК або вектора за винаходом пацієнтові або шляхом трансфекції клітин полінуклеотидом або вектором за винаходом ex vivo й інфузії цих трансфікованих клітин пацієнтові. У кращому втіленні застосування й способів відповідно за винаходом розлад являє собою рак, як згадано вище. Інші шляхи застосування поліморфізмів, описаних у зв'язку з даним винаходом, а також засобів і способів, які можна використати відповідно до вищеописаних втілень, можна знайти в рівні техніки, наприклад, вони розкриті в US-A-5856104, де засоби й способи, застосовувані в судовій медицині, для тестування батьківства, кореляції поліморфізмів з фенотипічними ознаками, генетичного картування фенотипічних ознак і т.д. можна рівною мірою втілювати відповідно до даного винаходу. Крім того, у даному винаході запропонований спосіб виявлення схильності до раку простати у суб'єкта, що включає виявлення в біологічному зразку від суб'єкта зміни в послідовності гена NBS1, де це зміна є показником схильності до раку простати. Суб'єкт може являти собою людину, наприклад, слов'янського походження. Крім того, у даному винаході запропонований спосіб виявлення схильності до раку молочної залози у суб'єкта, що включає виявлення в біологічному зразку від суб'єкта зміни в послідовності гена NBS1, де ця зміна є показником схильності до раку молочної залози. У деяких втіленнях винаходу рак молочної залози являє собою інвазійний рак молочної залози долькового підтипу. Суб'єкт може являти собою людину, наприклад, слов'янського походження. У деяких втіленнях винаходу зміна являє собою спадкову зміну, наприклад, 657de15. Ця зміна може бути присутньою у послідовності одного алеля гену NBS1, або ця зміна може бути присутньою у послідовності двох алелей гена NBS1. Зміна може являти собою мутацію в гені NBS1, наприклад, мутацію, викликану інсерцією у гені, делецією гену або заміною нуклеотида(ів) у гені. У деяких втіленнях зміна в гені впливає, на продукування білку, геном NBS1, що кодується, наприклад, інгібує його. Результатом цієї зміни може бути продукування білку, що відрізняється, наприклад укороченого, в порівнянні з білком, що повинен продукуватися геном NBS1. Такий білок може не мати функціональні властивості, якими володіє білок, що кодується геном NBS1. У деяких втіленнях зміна може бути виявлена за допомогою ПЦР із алель-специфічними олігонуклеотидами (ASO, allele-specific oligonucleotide), аналізи на виявлення поліморфізму однониткової конформації (SSCP, single-stranded conformation polymorphism), прямого секвенування, мікрочипів, прямого секвенування, алель-специфичної ампліфікації (ASA, allele-specific amplification) або RFLPПЦР. Схильність може являти собою успадковану схильність. У деяких втіленнях біологічний зразок може являти собою зразок тканини, такий як кров, і біологічний зразок може включати лейкоцити. У деяких втіленнях винаходу рак молочної залози 93344 24 являє собою інвазивний рак молочної залози долькового підтипу. Далі, даним винаходом запропонований діагностичний набір для ідентифікації схильності до раку молочної залози або до раку простати у суб'єкта, що включає пакувальний матеріал і щонайменше два різних полінуклеотида, здатних ампліфікувати щонайменше район гена NBS1. У деяких втіленнях винаходу ампліфікований район включає мутацію 657de15. У деяких втіленнях винаходу набір може містити полінуклеотиди Nbsex6f, Nbsex6r й Nbsde15. Набір може також містити інструкції, наприклад, інструкції з використання набору для ідентифікації схильності до раку молочної залози або до раку простати у суб'єкта. Способи й набори, запропоновані тут, корисні для виявлення схильності до раків, таких як рак простати й дольковий інвазивний рак молочної залози, і вони можуть бути також корисні для діагностики раків, таких як раки простати й молочної залози на самих ранніх клінічних стадіях. Зміна в гені NBS1, наприклад, зміна 657de15, може бути виявлена за допомогою будь-якого аналізу, доступного фахівцеві в даній області, що здатний здійснити виявлення зміни, наприклад, за допомогою аналізу елонгації нуклеотидів, аналізів послідовності, гібридизаційних аналізів й/або ампліфікаційних аналізів. Зміну можна виявити шляхом проведення аналізів на будь-якій формі ДНК або РНК, отриманої від суб'єкта. Наприклад, фахівець у даній області може ідентифікувати зміну, використовуючи ПЦР із алель-специфічними олігонуклеотидами, аналізи на виявлення поліморфізму однониткової конформації (SSCP, singlestranded conformation polymorphism), прямого секвенування, алель-специфічної ампліфікації, алельспецифічної гібридизації й/або поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів після ПЦР ампліфікації (RFLP-ПЦР). Гібридизацію можна проводити в різних умовах, підібраних фахівцем у даній області. Деякі приклади описані тут нижче. «Жорсткі умови гібридизації» й «жорсткі умови гібридизаційного відмивання» у контексті експериментів по гібридизації полінуклеотида, таких як Саузерн- і Норзерн-блот-гібридизації, залежать від послідовності й розрізняються різними параметрами навколишнього середовища. Більш довгі послідовності специфічно гібридизуються при більш високих температурах. «Тm» означає температуру (при певній іонній силі й рН), при якій 50% послідовності-мішені гібридизуються з високо відповідним зондом. Специфічність типово є функцією відмивань після гібридизації, причому критичними факторами є іонна сила й температура кінцевого розчину, що відмився. Для ДНК-ДНК гібридів Тm можна апроксимувати на підставі рівняння Meinkoth й Wahl, Anal. Biochem., 138: 267 (1984); Tm 81,5 С+16,6 (log Μ)+0,41 (%GC) 0,61 (% form) 500/L; де Μ - молярність одновалентних катіонів, %GC - відсоток нуклеотидів гуанозину й цитозину в ДНК, %form - відсоток формаміда в гібридизійному розчині й L - довжина гібрида в парах основ. Тm знижують приблизно на 1°С на кожен 1% неспарювання; таким чином, Тm, умови гібридизації й/або відмивання можна відрегулювати 25 для гібридизації послідовностей бажаної ідентичності. Наприклад, якщо припускають послідовності з ідентичністю >90%, Тm може бути знижена на 10°С. Як правило, жорсткі умови вибирають такими, щоб температура була приблизно на 5°С нижче точки плавлення (Тm) для конкретної послідовності і її комплементу при певній іонній силі й рН. Однак при дуже жорстких умовах можна проводити гібридизацію й/або відмивання при температурі на 1, 2, 3 або 4°С нижче точки плавлення (Тm); при помірковано жорстких умовах можна проводити гібридизацію й/або відмивання при температурі на 6, 7, 8, 9 або 10°С нижче точки плавлення (Тm); при умовах слабкої жорсткості можна здійснювати гібридизацію й/або відмивання при температурі на 11, 12, 13, 14, 15 або 20°С нижче точки плавлення (Тm). При використанні вищенаведеного рівняння, сполук для гібридизації й відмивання й бажаної Т, звичайний фахівець у даній області буде розуміти, що варіації жорсткості гібридизації й/або розчинів, що відмиваються, природно, описані в літературі. Якщо бажаний ступінь неспарювання приводить у результаті до Τ менш 45°С (водяний розчин) або 32°С (формамідний розчин), переважно збільшити концентрацію SSC так, щоб використати більш високу температуру. Великий посібник з гібридизації полінуклеотидів можна знайти в Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of polynucleotide probe assays" Elsevier, New York (1993). Як правило, жорсткі умови вибирають так, щоб температура була приблизно на 5°С нижче точки плавлення (Тm) для даної послідовності при заданій іонній силі й рН. Прикладом умов відмивання високої жорсткості є 0,15Μ NaCI при 72°С протягом приблизно 15 хвилин. Прикладом жорстких умов відмивання є відмивання 0,2Х SSC при 65°С протягом 15 хвилин (див. опис буфера SSC в Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Sambrook et al., 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)). Часто відмиванню високої жорсткості передує відмивання низької жорсткості для видалення фонового сигналу зонда. Прикладом відмивання середньої жорсткості для дуплекса, наприклад, більш ніж 100 нуклеотидів є 1Х SSC при 45°С протягом 15 хвилин. Прикладом відмивання слабкої жорсткості для дуплекса, наприклад, більш ніж 100 нуклеотидів є 4-6Х SSC при 40°С протягом 15 хвилин. Для коротких зондів (наприклад, від приблизно 10 до 50 нуклеотидів) жорсткі умови типово включають концентрації солі менш, ніж приблизно 1,5М, більш переважно від приблизно 0,01 до 1,0М, концентрація іона натрію (або інших солей) при рН від 7,0 до 8,3, а температура типово становить щонайменше 30°С і щонайменше приблизно 60°С для довгих зондів (наприклад, >50 нуклеотидів). Жорсткі умови можуть бути також досягнуті додаванням дестабілізуючих агентів, таких як формамід. Як правило, відношення сигналу до шумового фону 2Х (або вище) сигнали, що спостерігається для невідповідного зонда в конкретному гібридизаційному аналізі, показує виявлення специфічної гібридизації. Полінуклеотиди, які не гібридизуються 93344 26 один з одним у жорстких умовах, все-таки є по суті ідентичними, коли білки, які вони кодують, є по суті ідентичними. Це відбувається, наприклад, коли копія полінуклеотида створена з максимальною вироджуваністю кодонів, що допускається генетичним кодом. Дуже жорсткі умови гібридизації вибирають як рівні Тm для конкретного зонда. Прикладом жорстких умов гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, які має більш ніж 100 комплементарних залишків, на фільтрі в Саузерн- або Норзернблотiнзі є 50% формамід, наприклад, гібридизацію проводять в 50% формаміді, 1Μ NaCI, 1% ДСН при 37°С і відмивання проводять в 0,1Х SSC при температурі від 60 до 65°С. Приблизні умови слабкої жорсткості включають гібридизацію з буферним розчином від 30 до 35% формаміда, 1Μ NaCI, 1% ДСН (додецилсульфат натрію) при 37°С і відмивання - в 1Х-2Х SSC (20X SSC=3,0Μ NaCL/0,3Μ тринатрію цитрат) при температурі від 50 до 55°С. Приблизні умови помірної жорсткості включають гібридизацію в 40-45% формаміді, 1,0Μ NaCI, 1% ДСН при 37°С і відмивання в 0,5Х-1Х SSC при температурі від 55 до 60°С. Тут описані деякі полінуклеотиди, які корисні для виявлення змін, і фахівець у даній області зможе сконструювати інші полінуклеотиди, які будуть корисні при виявленні зміни. Таким чином, у даному винаході також запропоновані полінуклеотиди, що містять будь-яку з SEQ ID NO 6-12, що складаються по суті із цих послідовностей або складаються із цих послідовностей. Пухлини в людини часто пов'язані з геномною нестабільністю, і біохімічний шлях передачі сигналу про ушкодження ДНК відіграє критичну роль у підтримці цілісності геному у відповідь на фактори, що ушкоджують ДНК. Цей біохімічний шлях може відігравати важливу роль у патогенезі раку простати. Передача сигналу про ушкодження ДНК переривається мутаціями, що викликають синдроми розриву хромосом у людини, такі як Ниймегенський синдром (NBS), синдром Блума, анемія Фанкони й атаксія-телеангіектазія (AT), які характеризуються «спонтанною» хромосомною нестабільністю, імунодефіцитом і схильністю до раку (Digweed, 1993; і Futaki et al, 2001). Ген Ниймегенського синдрому NBS1 картирован на хромосомі 8q21 і клонований (див. Varon et al., 1998; Патент США №6458534; і Genbank, реєстраційний номер АВ013139). Продукт гена NBSJ, нибрин (так званий р95) являє собою інтегральний компонент нуклеазного комплексу hMRE11/hRAD50/NBS1, що є частиною BRCA1-асоційованого комплексу контролю генома (BASC), відповідального за репарацію ушкоджень ДНК (Futaki et al., 2001). Делеція, що укорочує 5 п.о. в екзоні 6 гена NBS1 була виявлена в переважної більшості пацієнтів з NBS. Більшість пацієнтів з NBS, про які повідомляли, слов'янського походження й мають мутаціюзасновник 657de15. Ця мутація присутня з несподівано високою частотою зустрічальності в Польщі, Україні й Чеській Республіці (Varon et al., 2000). Роль гена NBS1 у розвитку раку простати й долькового інвазійного раку молочної залози ще не досліджена. 27 Як описано в даному документі, виявилося, що NBS1 діє як класичний ген пухлинного супресора, оскільки біалельну інактивацію NBS1 спостерігають при більшості пухлин. Однак не виключений деякий ступінь гаплоїдної недостатності й можливого домінантно-негативного ефекту мутацій NBS1, оскільки не встановлено, що гетерозиготні по NBS1 клітини мають порушену здатність до репарації ДНК. Було передбачено, що алельзасновник NBS1 приводить у результаті до укороченого білка з 219-754 амінокислот (р26). У р26 відсутній критичний домен, необхідний для взаємодії MRE11. Невідомо, чи володіє цей мутантний білок якою-небудь залишковою активністю або проявляє домінантно-негативний ефект. Однак алель 657de15 також створює аберантний сайт ініціації трансляції, що створює частково функціональний варіант білка NBS1 (р70). Білок р70 містить зв'язуючий MRE11 домен, але не забезпечує повну функцію усередині комплексу MRE11. У світлі цього представляється можливим, що р70 може робити домінантно-негативний ефект. Крім того, даний винахід відноситься до використання успадкованої зміни в послідовності гена NBS1 для ідентифікації успадкованої схильності до раку простати або інвазивного раку молочної залози долькового підтипу у людини. Переважно зазначена успадкована зміна являє собою мутацію 657de15, а досліджуваний суб'єкт людина являє собою особу слов'янського походження. Наявність цієї успадкованої зміни може бути виявлена щонайменше одним способом, обраним з ASO ПЦР, SSCP, мікрочипів, прямого секвенування, ASA, RFLP ПЦР. Крім того, даний винахід відноситься до діагностичного набору для ідентифікації успадкованої схильності до раку простати або інвазивному раку молочної залози долькового підтипу способом, заснованим на ПЦР, що включає щонайменше два різних олігонуклеотида, що дають можливість ампліфікації району, що включає успадковану зміну в послідовності гена NBS1, де можливо цей ампліфікований район включає мутацію 657de15. Переважно зазначений набір містить праймери Nbsex6f, Nbsex6r й Nbsde15. Даний винахід також відноситься до протоколу для раннього виявлення раку молочної залози, відмінному від регулярних стандартів на підставі повторюваності успадкованої мутації NBS1. Ці й інші втілення описані або очевидні з опису й прикладів винаходи й охоплені ними. Додаткову літературу, що стосується кожного зі способів, застосувань і сполук для використання відповідно до даного винаходу, можна знайти в публічних бібліотеках, використовуючи, наприклад, електронні пристрої й бази даних, доступні в Інтернеті. Фармацевтичні й діагностичні композиції, шляхи застосування, способи по винаходу можна використати для діагностики й лікування всіх видів захворювань, дотепер невідомих, стосовних до варіантів генів NBS1 або залежних від них. Композиції, способи й застосування даного винаходу можна й бажано застосовувати для людей, хоча лікування тварин також охоплено способами й застосуваннями, описаними тут. 93344 28 На Фіг.1 зображений LOH аналіз отриманих шляхом мікрургії зрізів тканин PC від пробанда сім'ї 8 (доріжки 1-5) і пробанда сім'ї 9 (доріжки 1b5b) з використанням маркерів, що фланкирують ген NBS1 (доріжки 1-3 й 1b-3b) і з використанням екзон-специфічної ПЦР (доріжки 4-5, 4b-5b). Втрата алеля дикого типу в раковій тканині показана стрілками. Точки вказують на алель із мутацієюзасновником NBS1. На Фіг.2 зображене потомство сімей з мутацією NBS1. Сегрегація мутації NBS1 з раком простати показана в сім'ях 8, 9, 11, 12. Вік індивідуума показаний із правої сторони кожного випадку рака. Точка (·) в нижньому правом куту показує, що аналізували зразок крові. Плюс (+) в верхньому правому куту символу вказує на наявність мутаціїзасновника NBS1, а мінус (-) вказує на родичів, негативних по цій мутації. Стрілками вказані пробанди. Повністю чорні символи означають пацієнтів з раком, патологічні результати яких доступні; на % чорні символи вказують на пацієнтів з раком, для яких гістопатологія була недоступна. Тип раку вказаний під кожним символом. Додаткова сім'я А, що діагностується в Центрі Ракової Спадкоємності в Щецині, не належить до групи успадкованих випадків PC. На Фіг.3 зображений фрагмент геномної послідовності гена NBS1, що включає екзон 6. Послідовність екзону 6 показана жирним шрифтом, а мутація 657de15 показана курсивом (див. також Genbank, реєстраційний номер АВ013139; Matsura et al., 1998). Далі винахід буде описаний біологічними прикладами, які є винятково ілюстрованими й не призначеними для обмеження об'єму даного винаходу. Приклад 1. Установлення кореляції між успадкованою зміною в послідовності гена NBS1 і успадкованою схильністю до раку простати або раку молочної залози на прикладі аналізу мутаціїзасновника 657de15 у гені NBS1. Зв'язок між 657de15 і раком простати Пацієнти Пацієнтів, підозрілих на рак простати, госпіталізують у Клініку Урології в Щецині. Критеріями підозри на рак простати є: підвищений рівень PSA - вище 4,0нг/мл або виявлення аномалій у дослідженні лежачи. Рак простати діагностують у клініці на підставі біопсії DRECUT при УЗД-контролі, проведеному в підозрілих випадках. Тканини біопсії, пофарбовані з використанням стандартних методик, оцінювали патологи на Кафедрі Генетики й Патології в Щецині. Остаточний діагноз був підтверджений одним патологом - професором Яном Лубінскі (Jan Lubinski). Всі 359 чоловіків, у яких діагностований рак простати в Університетській лікарні в Щецині, Польща, між 1999 й 2002, були запрошені для участі в даному дослідженні. З них 340 (95%) дали згоду на участь. Всіх пацієнтів рекрутували для участі в дослідженні протягом шести місяців від дати діагнозу. Сімейні історії випадків рака одержували від кожного суб'єкта. Тридцять п'ять пацієнтів (10,3%) мали одного або більше родичів першого або другого ступеня споріднення з раком простати (сімейні випадки). 29 93344 Автори винаходу також включили другу групу з 21 сімейного випадку раку простати від чоловіків, які були відправлені на дослідження в Центр Ракової Спадковості сімейними лікарями або урологами у зв'язку з об'єднанням сімейних випадків раків простати. Усього було 56 сімейних випадків й 305 несімейних випадків. Випадково відібрані сімейні випадки містили в середньому 2,1 випадок раку простати (середній вік виникнення 67,3 роки) і сімейні випадки, відібрані Спадкоємним Раковим Центром, містили 2,6 випадків раку простати (середній вік виникнення 63,3 роки). Число неуражених контролів становило 1500. Одна тисяча контролів була відібрана випадковим образом з комп'ютерного списку пацієнтів трьох сімейних практик у Щецині (508 жінок й 492 чоловіка; віковий інтервал від 26 до 89 років). Додатково включили другу контрольну групу з 500 не відібраних немовлят із Щецина, для яких були доступні зразки крові з пупочної нитки. На Фіг.2 зображене потомство сімей з мутацією NBS1. Зв'язок між 657de15 і раком молочної залози долькового підтипу Пацієнти Досліджувана група включала 2012 жінок з раком молочної залози, відібраних без урахування природи раку. Випадки раку молочної залози рекрутували з 8 лікарень із усією Польщі (таблиця 1). Пацієнти кілька разів підтверджувалися патологічними відділеннями лікувальних установ. Включали тільки первинний інвазивний рак молочної залози (випадки DCIS й LCIS виключали). Пацієнтів збирали в період з 2002 по 2003p.p.. Дві тисячі контролів із загальної популяції використали для дослідження зв'язку між алелем-засновником NBS1 (1000 не відібраних дорослих із Щецина й 1000 немовлят дітей в 2003 р. із шести лікарень із усією Польщі (Щецин, Белосток, Горзов, Катовице й Вроцлав). Метою контрольної групи була оцінка частоти NBS1 657de15 у загальній популяції. Таблиця 1 Частота мутантного алеля-засновника МВS1 серед пацієнтів з раком молочної залози у восьми районах Польщі Місто Щецин Бельско-Бяла Ополе Познань Краків Кошалин Люблін Бидгощ Усього Число суб'єктів 5І1 172 480 258 251 ПО 179 51 2012 NBS1 657de15 5 2 5 1 2 1 1 0 17 Приклад 2. Виявлення мутації 657de15 у гені NBS1 Автори винаходу використали ASO-ПЦР і секвенування для виявлення мутації-засновника NBS1 у ДНК, виділеної з лейкоцитів периферичної крові. 30 Одержували 5мл периферичної крові й змішували з 100мкл 1Μ ЕДТА, потім центрифугували в 50мл поліпропіленових пробірках протягом 10 хвилин при 3000g при 4°С. Сироватку у верхній фазі видаляли, і осад, що містить клітини, змішували з 45мл буфера 2Х (0,1Μ NH4C1, 0,25Μ KНСО3, 1мМ ЕДТА) і залишали на 15 хвилин при 4°С. Потім суміш центрифугували при 3000g протягом 10 хвилин при 4°С. Супернатант видаляли після центрифугування. Осад, що залишився, з лейкоцитами суспендували в 2Х буфері й центрифугували протягом 10 хвилин при 3000g при 4°С. Це очищення лейкоцитів в 2Х буфері й центрифугування повторювали три рази до одержання чистого осаду лейкоцитів. Ці лейкоцити змішували з 3мл буфера для перевару (50мМ NaCl, 25мМ MgCl2, 1мМ ЕДТА; рН8,0) з 200 мкл 10% ДСН й 500мкг протеінази К. Перевар проводили протягом 24год. при 37°С. ДНК очищали, використовуючи фенол/хлороформ. Коротко, продукти перевару змішували з 3мл фенола, забуференного 0,5Μ Трис НСl (рН8,4), а потім з 3мл суміші хлороформу й ізоамілового спирту (у співвідношенні 1:25 об/об). Суміш струшували протягом приблизно 1 хвилини й центрифугували протягом 10 хвилин при 8000g при 20°С. Після центрифугування верхню фазу переносили в нову пробірку й змішували з рівним об'ємом хлороформу, а потім центрифугували протягом 10 хвилин при 8000g. Вищеописане очищення хлороформом повторювали 3 рази до зникнення білкового кільця в інтерфазі. Очищену водну фазу, що містить ДНК, змішували з 5Μ NaCl у співвідношенні 10:1 (об/об) і 96% етанолом відносно водної фази з NaCl до етанолу 1:10 (об/об). Суміш залишали на ніч при 20°С. Отриманий у результаті осад ДНК поміщали в нову пробірку й очищали 70% етанолом, центрифугували при 3000g протягом 5 хвилин, і етанол зливали. Потім очищений осад ДНК сушили у відкритій пробірці протягом 30 хвилин при 37°С. ДНК, ресуспендовану в 400 мкл ТЕ буфера (25мМ Трис НСl, 1мМ ЕДТА; рН8,4), зберігали при 4°С до використання. Алель-спеціфична ПЦР (ASO-ПЦР) Реакцію ASO-ПЦР проводили в апараті DNA ThermalCycler 9600 (Perkin Elmer) в об'ємі 25мкл, що включає: 1мкл (50нг) геномної ДНК, 4пмоль праймера Nbsex6f, 6 пмоль праймера Nbsex6r, 10пмоль праймера Nbsde15, 2,5мкл ПЦР буфера (100мМ Трис-НСІ, 500мМ KСl, 15мМ MgCl2, 1мг/мл желатину; рН8,6), 200мкм кожного dATP, dCTP, dGTP й dTTP й 1од. Taq ДНК полімерази. У кожній реакції використали 2 позитивних контролі (контролі із ДНК від гетерозиготи NBS1 і гомозиготи NBS1) і 2 негативних контролі (контрольна ДНК від пацієнта, негативного по мутації NBS1, і контроль без ДНК). Умови ASO-ПЦР: а) Вихідна денатурація - 95°С, 5 хвилин б) 11 циклів, кожний з: денатурації - 94°С 30сек. отжигу праймерів - від 62 до 56°С 30сек* елонгації праймерів - 72°С 30сек. в) 30 циклів, кожний з: 31 денатурації - 94°С 30сек. отжигу праймерів -56°С 30сек. елонгації праймерів - 72°С 30сек. * - протягом перших 11 циклів температуру отжигу праймерів знижували на 0,6°С у кожному циклі, починаючи з 62°С у першому циклі й закінчуючи 56°С в 11-м циклі (докладно: 1-й цикл 62°С, 2-й цикл - 61,4°С, 3-й цикл - 60,8°С, 4-й цикл - 60,2°С, 5-й цикл - 59,6°С, 6-й цикл - 59°С, 7-й цикл - 58,4°С, 8-й цикл - 57,8°С, 9-й цикл - 57,2°С, 10-й цикл-56,6°С, 11-й цикл-56°С). Послідовність праймерів, використаних в ASOПЦР: Nbsex6f, 5' CACCTCTTGATGAACCATCT (SEQ ID NO:6) Nbsex6r, 5' CGTTAACAACTACTGATAAGAG (SEQ ID NO:7) Nbsde15, 5' GGACGGCAGGAAAGAAATCTT (специфічний праймер для 657de15) (SEQ ID NO:8) 5мкл продуктів ПЦР змішували з 10мкл буфера завантаження й піддавали електрофорезу в агарозном гелі (1,5% агарозний гель (SeaKem FMC), 1Х буфер ТВЕ, 25пг/мол бромистого етидія) при 6В/см протягом 30 хвилин. Розділені продукти візуалізовані в Уф-світлі. Всі випадки, у яких спостерігали додатковий більш короткий продукт ПЦР, секвенували з метою підтвердження наявності мутації-засновника NBS1. Секвенування Матрична ПЦР Екзон 6 гена NBS1 ампліфіцировали із праймерами Nbsex6f й Nbsex6r у таких умовах, як описано для ASO-PCR, з тією єдиною відмінністю, що в матричній ПЦР праймер Nbsde5 не використовували. Очищення продуктів ПЦР Продукти ампліфікації екзона 6 переносили піпеткою в резервуар для зразків Місгосоп-100 (Amicon), поміщений у флакон, і додавали в резервуар 400мкл dH2O і центрифугували при 1850g протягом 15 хвилин. Після центрифугування резервуар для зразків поміщали в новий флакон, наповнений 400мкл dH2O, і центрифугували при 1850g протягом 15 хвилин. Останню стадію повторювали 3 рази. Резервуар для зразків поміщали нагору дном у новий флакон, а потім центрифугували протягом 3 хвилин при 9000g. Усі центрифугування проводили при 25°С. У флаконі було видно приблизно 5мкл очищеного продукту ПЦР, і його розводили в 20мкл dН2О. ПЦР, що секвенує Асиметричну ПЦР, що секвенує, проводили в термоциклері Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer) в об'ємі 20мкл, що містить: 1 пмоль праймера Nbsex16f, 4мкл очищені продукти ПЦР, 8мкл BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). Крім того, реакцію, що секвенує із праймером Nbsde16r, проводили для підтвердження результатів із прямим праймером. Умови секвенування: Вихідна денатурація - 96°С 30сек. 30 циклів, кожний з: денатурації - 94°С 30сек. отжигу праймерів - 56°С 30сек. 93344 32 елонгації праймерів - 72°С 30сек. 20мкл продукту секвенування поміщали в 0,5мл пробірку Еппендорф, додавали 60мкл 96% етанолу й 2мкл 3Μ цитрату натрію (рН4,6). Проби центрифугували протягом 20 хвилин при 3000g при 25°С. Потім супернатант видаляли й додавали 200мкл 70% етанолу для очищення осаду. Після 5 хвилин центрифугування при 3000g при 25°С супернатант видаляли. Осад висушували в Eppendorf Concentrator 5301 протягом 20-30хв., а потім ресуспендували в 4мкл буфера нанесення (150мкл деіонізованого формаміда, 50мкл 50мМ ЕДТА, 0,05% Dextran Blue). Зразки денатурували протягом 4 хвилин при 94°С, поміщали на лід і наносили на денатурований поліакриламідний гель (4% 19:1 поліакриламідний гель, 1Х ТВЕ, 6Μ сечовина). Електрофорез проводили в АВІ PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Збір й аналіз даних здійснювали, використовуючи програмне забезпечення АВІ PRISM 377 Collection Software й Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems). Приклад 3. Аналіз втрати гетерозиготності (LOH) при раку простати й молочної залози Мікровисічення й виділення ДНК Щоб проаналізувати, чи загублений алель NBS1 дикого типу при раку простати й раку молочної залози, автори винаходу провели LOH-аналіз у пухлинах після мікровисічення носіїв мутації NBS1 - в 9 випадках раку простати й 5 випадках рака молочної залози. LOH проводили, використовуючи маркери, що фланкують ген NBS1 - D8S88, D8S1811 і мічені флуоресцентною міткою праймери, специфічні до екзону 6 NBS1 (9). Готували зрізи з п'яти мікронів, фіксованих у формаліні й ув'язнених у парафін тканин і розміщали їх на скельцях. Для кожного пацієнта тканини різали для 6 скельців. Одне скло фарбували гематоксиліном/еозином. Інші скельця використовували для мікровисічення. Зрізи звільняли від парафіну у двох змінах ксилолу протягом 5 хвилин. Зрізи гідратували з використанням серії градуйованих спиртів (в 96% етанолі (2 рази), 70% етанол й dН2О, у кожному по 5 хвилин). Скельця фарбували гематоксиліном. Використовуючи світловий мікроскоп, вибирали однорідні поля ракових кліток у ГЕ-пофарбованих зрізах. Ці поля обережно піддавали мікровисіченню, використовуючи голку, зі скельців, пофарбованих тільки гематоксиліном, під світловим мікроскопом, уникаючи забруднення доброякісними клітинами. Зрізи, отримані шляхом мікровисічення, поміщали в пробірки Еппендорф на 1,5мл. Паралельно нормальні тканини вирізали з тих же скельців і поміщали в інші окремі пробірки. Потім тканини, піддані мікровисіченню, поміщали в 1мл буфери для ферментативного гідролізу (50мМ Трис-НСІ, 1мМ СаСl2, рН8,0) з 20мкл 10% ДСН й 500мкг протеїнази К. У кожній серії використовували негативні контролі без тканини. Ферментативний гідроліз проводили при 55°С протягом 2 тижнів. На 3-ю й 6-у добу гідролізу додавали додатково 100мкг протеїнази К. Після гідролізу протеїназу інактивували нагріванням при 96°С протягом 10 хвилин. 500мкл продукту фермента 33 тивного гідролізу очищали в пробірках Місrосоn100 (Amicon) відповідно до вищеописаної методики. Після очищення приблизно 5мкл розчину, що містить ДНК, розводили в 50мкл dН2О. LOH-аналіз LOH-аналіз проводили в 3 реакціях ПЦР із флуоресцентними праймерами: 1) ПЦР1 із праймерами D8S88f - 5' TCCAGCAGAGAAAGGGTTAT (SEQ ID NO:9); D8S88r - 57 GGCAAAGAGAACTCATCAGA (SEQ ID NO:10), 2) ПЦР2 із праймерами D8S1811f - 5' CCCACCCCCAAAATGC (SEQ ID NO:11); D8S1811r - 5' GGGTTTAGGGAAGTGCAGAA (SEQ ID NO:12), 3) ПЦР3 із праймерами Nbsex6f й Nbsex6r, що фланкують екзон 6 NBS1, що містить 657de15. Реакцію ПЦР проводили в DNA ThermalCycler 9600 (Perkin Elmer) в об'ємі 25мкл, що включав: 4мкл ДНК, виділеної із тканин, 2,5мкл ПЦР буфера (100мМ Трис-НСІ, 500мМ KСl, 15мМ MgCl2, 1мг/мл желатини; рН8,6), 200пМ кожного dATP, dCTP, dGTP й dTTP, 1од. Taq ДНК полімерази й 10мкг бичачого сироваткового альбуміну (БСА Fermentas). Суміш ПЦР1 включала додатково 5пмоль праймерів D8S88f й D8S88r, ПЦР2 5пмоль праймерів D8S1811f й D8S1811r, ПЦР3 5пмоль праймерів Nbsex6f й Nbsex6r. У кожній реакції ПЦР використовували позитивні й негативні контролі. Умови ПЦР: в) Вихідна денатурація - 95°С 5 хвилин г) 42 циклу, кожний з: денатурації - 94°С 30сек. отжигу праймерів - 56°С 30сек. елонгації праймерів - 72°С 30сек. Один мкл продукту ПЦР розводили в 10мкл буфера нанесення (150мкл формаміда, 50мкл 50мМ ЕДТА, 0,05% Dextran Blue). Після денатурації протягом 4 хвилин при 94°С зразки поміщали в лід і наносили на поліакриламідний гель, що денатурує (4% 19:1 поліакриламідний гель, 1Х ТВЕ, 6Μ сечовина). Електрофорез проводили в АВІ PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Збір й аналіз даних здійснювали, використовуючи про 93344 34 грамне забезпечення АВІ PRISM 377 Collection Software й GenScan Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems). Зниження сигналу в одному алелі щонайменше на 70% приймали за поріг розпізнавання для LOH. Статистичний аналіз проводили, використовуючи критерій Хі-квадрат. Мутація NBS1 була присутня в дев'ятьох з 340 випадково відібраних випадків раку простати (2,6%) у порівнянні тільки з дев'ятьма з 1500 (0,6%) контрольних індивідуумів із загальної популяції (відношення odds 4,5; 95% СІ 1,7 до 11,5; p=0,002). Успадкована мутація 657de15 була присутня в п'ятьох з 56 (9%) сімейних випадків (відношення odds =16; 95% СІ=5,2 до 50; p
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюPolymorphism of human gene nbs1 657del5, used for diagnostics of inherited disposition to prostate gland cancer or invasive breast cancer of lobular subtype
Автори англійськоюCYBULSKI, Cezary, LUBINSKI, Jan, GORSKI, Bohdan, GLINIEWICZ, Bartlomiej, SIKORSKI, Andrzej
Назва патенту російськоюПолиморфизм человеческого гена nbs1 657del5, который используется для диагностики унаследованной склонности k раку простаты или инвазивного раку молочной железы долькового подтипа
Автори російськоюЦибулски Цезар, Лубински Ян, Горски Богдан, Глиневич Бартломей, Сикорски Анджей
МПК / Мітки
МПК: G01N 33/574, C12Q 1/68
Мітки: використовується, долькового, простати, підтипу, гена, інвазивного, успадкованої, діагностики, схильності, залози, 657del5, раку, поліморфізм, людського, молочної
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/41-93344-polimorfizm-lyudskogo-gena-nbs1-657del5-shho-vikoristovuehtsya-dlya-diagnostiki-uspadkovano-skhilnosti-do-raku-prostati-chi-invazivnogo-raku-molochno-zalozi-dolkovogo-pidtipu.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Поліморфізм людського гена nbs1 657del5, що використовується для діагностики успадкованої схильності до раку простати чи інвазивного раку молочної залози долькового підтипу</a>
Спосіб прогнозування інвазивного та метастатичного потенціалу раку молочної залози
Номер патенту: 92957
Опубліковано: 27.12.2010
Автор: Микитенко Дмитро Олександрович
МПК: A61B 10/00, G01N 33/48
Мітки: раку, потенціалу, інвазивного, прогнозування, метастатичного, молочної, спосіб, залози
Формула / Реферат:
Спосіб прогнозування інвазивної та метастатичної активності раку молочної залози, що включає забір досліджуваного матеріалу, виявлення експресії ключового молекулярного маркеру - білка Е-кадгерину та оцінювання інвазивного та метастатичного потенціалу пухлини, який відрізняється тим, що як досліджуваний матеріал використовують плазму крові, в якій визначають рівень гомоцистеїну, після чого встановлюють діапазон рівня експресії Е-кадгеринів за...
Спосіб прогнозування інвазивного та метастатичного потенціалу раку молочної залози
Номер патенту: 41048
Опубліковано: 27.04.2009
Автор: Микитенко Дмитро Олександрович
МПК: A61B 10/00, G01N 33/48
Мітки: інвазивного, молочної, спосіб, метастатичного, прогнозування, раку, потенціалу, залози
Формула / Реферат:
Спосіб прогнозування інвазивної та метастатичної активності раку молочної залози, що включає забір досліджуваного матеріалу, виявлення експресії ключового молекулярного маркера - білка Е-кадгерину, та оцінювання інвазивного та метастатичного потенціалу пухлини, який відрізняється тим, що як досліджуваний матеріал використовують плазму крові, в якій визначають рівень гомоцистеїну, після чого встановлюють діапазон рівня експресії Е-кадгеринів...
Спосіб диференційної діагностики доброякісної гіперплазії простати та раку передміхурової залози за допомогою лазерної поляриметрії
Номер патенту: 15760
Опубліковано: 17.07.2006
Автори: Владиченко Костянтин Анатольєвич, Федорук Олександр Степанович, Єрмоленко Сергій Борисович
МПК: A61B 1/00
Мітки: передміхурової, простати, гіперплазії, диференційної, діагностики, спосіб, лазерної, допомогою, раку, залози, поляриметрії, доброякісної
Формула / Реферат:
Спосіб диференційної діагностики доброякісної гіперплазії простати та раку передміхурової залози шляхом дослідження гістологічної структури препарату, який відрізняється тим, що дослідження гістологічної структури препарату проводять за допомогою лазерної поляриметрії з подальшою математичною обробкою даних.
Спосіб діагностики раку молочної залози
Номер патенту: 51771
Опубліковано: 26.07.2010
Автори: Скочиляс Тетяна Леонідівна, Помінчук Денис Володимирович, Сєдаков Ігор Євгенович
МПК: G01N 33/48
Мітки: діагностики, залози, спосіб, молочної, раку
Формула / Реферат:
Спосіб діагностики раку молочної залози, що включає імуноцитохімічне дослідження пухлини шляхом тонкоголкової аспіраційної біопсії (ТАБ) під контролем УЗД, який відрізняється тим, що забір біоптату здійснюють з декількох точок пухлинного вузла, але з одного проколу шкіри молочної залози, для чого спочатку здійснюють прокол шкіри молочної залози над пухлинним вузлом, а потім голку направляють спочатку у центр пухлинного вузла і здійснюють...
Спосіб діагностики мутації 657del5 гена nbsl
Номер патенту: 19773
Опубліковано: 15.12.2006
Автори: Кашин Олексій Ігорович, Акопян Гаяне Рубенівна, Заставна Данута Володимирівна
МПК: A61B 8/00, G01N 33/50
Мітки: діагностики, 657del5, мутації, спосіб, гена
Формула / Реферат:
Спосіб діагностики мутації 657del5 гена nbsl, що включає виділення ДНК, отримання та ампліфікацію фрагментів екзону 6 гена nbsl, електрофоретичне розділення продуктів ампліфікації, фарбування та візуалізацію розділених фрагментів, який відрізняється тим, що після ампліфікації фрагментів екзону 6 гена nbsl проводять реакції формування гетеродуплексних фрагментів між досліджуваними ампліконами та фрагментами, що несуть та не несуть мутацію...
Попередній патент: Система для вдавлювання паль
Наступний патент: Спосіб з’єднання двох деталей, з яких щонайменше одна виконана з композитного матеріалу, та вставка для здійснення цього способу
Випадковий патент: Оздоровчий фітозбір для бронхолегеневої системи "маслов-чай"