Протипухлинні комбінації, що містять мелфалан і антитіла, які специфічно розпізнають cd38

Реферат: Винахід стосується фармацевтичної комбінації, яка містить антитіло, що специфічно розпізнає CD38, і мелфалан. UA 107069 C2 (12) UA 107069 C2 UA 107069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід належать до комбінацій мелфалану і моноклональних антитіл, спрямованих проти CD38, які мають терапевтичну користь для лікування неопластичних захворювань. CD38 являє собою трансмембранний глікопротеїн II типу в 45 кД із довгим C-кінцевим позаклітинним доменом і коротким N-кінцевим цитоплазматичним доменом. Білок CD38 є + біфункціональним ектоферментом, що може каталізувати перетворення НАД у циклічну АДФрибозу (цАДФ-Р), і також гідролізувати цАДФ-Р в АДФ-рибозу. CD38 має позитивну регуляцію і залучений до багатьох гематопоетичних злоякісних патологій. Моноклональні антитіла 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39, які специфічно розпізнають CD38, описані в заявці PCT WO 2008/047242. Зазначені анти-CD38 антитіла здатні + знищувати клітини CD38 за допомогою трьох різних цитотоксичних механізмів: шляхом індукції апоптозу, антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЗКЦ) і комплементзалежної цитотоксичності (КЗЦ). Додатково, зазначені антитіла здатні самі по собі викликати апоптоз + клітин CD38 , навіть за відсутності стромальних клітин або цитокінів стромального походження. Мелфалан являє собою алкілуючу речовину, що застосовується в хіміотерапії. Проте, ще існує потреба в нових і ефективних ліках для лікування раку. Останнім часом і в даному винаході виявлено, що можна значно поліпшити ефективність гуманізованих анти-CD38 антитіл, якщо їх вводити в комбінації щонайменше з однією речовиною, яка є терапевтично корисною для протиракового лікування і має механізм, що ідентичний або відрізняється від механізму гуманізованих анти-CD38 антитіл, і яка в даному винаході обмежена мелфаланом. Термін "антитіло" застосовується в даному винаході в самому широкому розумінні і конкретно стосується моноклональних антитіл (що включають у себе повнорозмірні моноклональні антитіла) будь-якого ізотипу, такі як IgG, IgМ, IgА, IgD і IgЕ, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла, химерні антитіла і фрагменти антитіл. Звичайне антитіло IgG складається з двох ідентичних важких ланцюгів і двох ідентичних легких ланцюгів, які з'єднані дисульфідними зв'язками. Кожен важкий і легкий ланцюг містить постійну область і варіабельну область. Кожна варіабельна область містить три сегменти, які називаються "області, що визначають комплементарність" (CDR), або "гіперваріабельні області", що насамперед відповідають за зв'язування антигенної детермінанти антигену. Звичайно вони називаються CDR1, CDR2 і CDR3 і нумеруються послідовно від N-кінця. Більш консервативні ділянки варіабельних областей поза CDR називають "каркасними областями". Використовувані в даному винаході терміни "VH" або "VH" належать до варіабельної області імуноглобулінового важкого ланцюга антитіла, включаючи в себе важкий ланцюг фрагментів Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' або F(ab')2. Терміни "VL" або "VL", що згадуються, належать до варіабельної області імуноглобулінового легкого ланцюга антитіла, включаючи в себе легкий ланцюг фрагментів Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' або F(ab') 2. Антитіло 38SB13 містить щонайменше один важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 50, і щонайменше один легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 38, і зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області CDR з амінокислотними послідовностями, які складаються з SEQ ID NO: 1, 2 і 3, і зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 4, 5 і 6. Антитіло 38SB18 містить щонайменше один важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 52, і щонайменше один легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 40, і зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 7, 8 і 9, і зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 10, 11 і 12. Антитіло 38SB19 містить щонайменше один важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 54, і щонайменше один легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 42, і зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 13, 81 і 15, і зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 16, 17 і 18. Антитіло 38SB30 містить щонайменше один важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 44, і зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 19, 20 і 21, і зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 22, 23 і 24. 1 UA 107069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Антитіло 38SB31 містить щонайменше один важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 58, і щонайменше один легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 46, і зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 25, 26 і 27, і зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 28, 29 і 30. Антитіло 38SB39 містить щонайменше один важкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 60, і щонайменше один легкий ланцюг, що має амінокислотну послідовність, яка складається з SEQ ID NO: 48, і зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 31, 32 і 33, і зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області CDR, що мають амінокислотні послідовності, які складаються з SEQ ID NO: 34, 35 і 36. Клітинні лінії гібридоми, що продукують анти-CD38 щурячі антитіла 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39, були депоновані в Американській колекції типових культур (10801 University Bid, Manassas, VA, 201 10-2209, USA), 21 червня 2006 року під депозитними номерами PTA 7667, PTA 7669, PTA 7670, PTA 7666, PTA 7668 і PTA 7671, відповідно (як описано в WO 2008/047242). Термін "гуманізоване антитіло", що використовується в даному винаході, стосується химерного антитіла, яке містить мінімальну послідовність, що походить з нелюдського імуноглобуліну. Метою гуманізації є зниження імуногенності ксеногенного антитіла, наприклад, щурячого антитіла, для введення людині, при збереженні повної антигенної зв’язувальної афінності і специфічності антитіла. Гуманізовані антитіла, або антитіла, адаптовані до відсутності відторгнення іншими ссавцями, можна одержувати за допомогою декількох технологій, таких як CDR-трансплантація і зміна поверхні. Застосовувана в даному винаході технологія зміни поверхні задіює комбінацію молекулярного моделювання, статистичного аналізу і мутагенезу з метою зміни поверхні не-CDR областей варіабельних ділянок антитіла для збирання поверхонь відомих антитіл хазяїна-мішені. Технологія CDR-трансплантації охоплює заміщення областей, що визначають комплементарність, наприклад, мишачого антитіла, у людський каркасний домен, наприклад, див. WO 92/22653. У гуманізованих химерних антитілах, переважно, присутні постійні області і варіабельні області, які відрізняються від областей, що визначають комплементарність (CDR), отриманих значною мірою або винятково від відповідних областей людських антитіл, і CDR, отриманих значною мірою або винятково від ссавців, відмінних від людини. Стратегії і способи зміни поверхні антитіл і інші способи зменшення імуногенності антитіл у різних хазяїнів розкриті в патенті США № 5639641, який повністю з посиланням включений у даний винахід. Антитіла можуть бути гуманізовані за допомогою ряду інших технологій, що включають у себе CDR-трансплантацію (EP 0239400; WO 91/09967; патенти США №№ 5530101; і 5585089), рекомбінацію поверхневих залишків або зміну поверхні (EP 0592106; EP 0519596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; G Studnicka. M. et al., 1994, Protein Engineering, 7 (6): 805-814; Roguska M. A. et al., 1994, PNAS, 91: 969-973), рекомбінацію всього ланцюга (патент США № 5565332) і ідентифікацію гнучких залишків (PCT/US2008/074381). Людські антитіла можна створювати рядом способів, відомих у даній галузі техніки, що включають у себе способи фагових дисплеїв. Див. також патенти США №№ 4444887, 4716111, 5545806 і 5814318; і міжнародні опубліковані патентні заявки WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 і WO 91/10741 (зазначені посилання включені у винахід у всій повноті). Анти-CD38 антитіла фармацевтичної комбінації даного винаходу являють собою + гуманізовані антитіла, які розпізнають клітини CD38 і убивають клітини CD38 шляхом апоптозу, АЗКЦ і КЗЦ. У додатковому варіанті здійснення гуманізовані антитіла за винаходом здатні + знищувати зазначені клітини CD38 шляхом апоптозу навіть за відсутності стромальних клітин або цитокінів стромального походження. Переважний варіант здійснення такого гуманізованого антитіла являє собою гуманізоване антитіло 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 або 38SB39, або його епітопзв’язувальний фрагмент. Області CDR антитіл 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39 ідентифікують шляхом моделювання, і їхні молекулярні структури є заданими. Таким чином, в одному варіанті здійснення даного винаходу одержують гуманізовані антитіла або їхні епітопзв’язувальні фрагменти, які містять одну або більше областей CDR з амінокислотними послідовностями, вибираними з групи, що складається з SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 і 81. У переважному 2 UA 107069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 варіанті здійснення представлена гуманізована версія 38SB13, яка містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, при цьому зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, які представлені в SEQ ID NO: 1, 2 і 3, і при цьому зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області, що визначають комплементарність, які мають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 4, 5 і 6. В іншому переважному варіанті здійснення представлена гуманізована версія 38SB18, яка містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, при цьому зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області, які визначають комплементарність, що мають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 7, 8 і 9, і при цьому зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в SEQ ID NO: 10, 11 і 12. В іншому переважному варіанті здійснення представлена гуманізована версія 38SB19, яка містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, при цьому зазначений важкий ланцюг містить три послідовних області, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в SEQ ID NO: 13, 81 і 15, і при цьому зазначений легкий ланцюг містить три послідовних області, які визначають комплементарність, що мають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 16, 17 і 18. В іншому переважному варіанті здійснення представлена гуманізована версія 38SB30, яка містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, при цьому зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в SEQ ID NO: 19, 20 і 21, і при цьому зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області, які визначають комплементарність, що мають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 22, 23 і 24. В іншому переважному варіанті здійснення представлена гуманізована версія 38SB31, яка містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, при цьому зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області, які визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в SEQ ID NO: 25, 26 і 27, і при цьому зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області, які визначають комплементарність, що мають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 28, 29 і 30. В іншому переважному варіанті здійснення представлена гуманізована версія 38SB39, що містить щонайменше один важкий ланцюг і щонайменше один легкий ланцюг, при цьому зазначений важкий ланцюг містить три послідовні області, що визначають комплементарність, з амінокислотними послідовностями, представленими в SEQ ID NO: 31, 32 і 33, і при цьому зазначений легкий ланцюг містить три послідовні області, які визначають комплементарність, що мають амінокислотні послідовності, представлені в SEQ ID NO: 34, 35 і 36. В одному варіанті здійснення даний винахід належать до гуманізованих антитіл або їхніх фрагментів, що містять VH з амінокислотною послідовністю, що вибирається з групи SEQ ID NO: 66 і 72. У переважному варіанті здійснення представлене гуманізоване антитіло 38SB19, що містить VH з амінокислотною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 66. В іншому переважному варіанті здійснення представлене гуманізоване антитіло 38SB31, що містить V H з амінокислотною послідовністю, представленою в SEQ ID NO: 72. В іншому варіанті здійснення даний винахід належать до гуманізованих антитіл або їхніх фрагментів, що містять VL з амінокислотною послідовністю, що вибирається з групи SEQ ID NO: 62, 64, 68 і 70. У переважному варіанті здійснення представлене гуманізоване антитіло 38SB19, що містить VL з амінокислотною послідовністю, що вибирається з групи SEQ ID NO: 62 і 64. В іншому переважному варіанті здійснення представлене гуманізоване антитіло 38SB31, що містить VL з амінокислотною послідовністю, що вибирається з групи SEQ ID NO: 68 і 70. Виявлено, що кожна з гуманізованих версій антитіла 38SB13, 38SB18, 38SB19, 38SB30, 38SB31 і 38SB39 має особливі переваги як протираковий агент. Їхнє виготовлення, фізичні властивості і корисні фармакологічні властивості описані в патенті WO 2008/047242, що включений повністю з посиланням у даний винахід. Загалом, застосовувані для лікування людей дози, що залежать від факторів, які відрізняються в суб'єктів, які піддаються лікуванню, знаходяться в діапазоні від 1 до 150 мг/кг, що вводять перорально, або від 1 до 150 мг/кг, що вводять внутрішньовенно. Мелфалан (фірмовий знак Alkeran™) являє собою хіміотерапевтичний препарат, що належить до класу алкілуючих агентів азотистих іпритів. L-фенілаланін мустард або L-PAM, або інакше мелфалан, є фенілаланіновим похідним мехлоретаміну і являє собою біфункціональний алкілуючий агент. Утворення проміжних продуктів вуглецю від кожної з двох груп біс-2хлоретилу дозволяє здійснювати алкілування за допомогою ковалентного зв'язування з 7азотом гуаніну на ДНК, зшивання двох ланцюжків ДНК і, таким чином, запобігати клітинній 3 UA 107069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 реплікації. Мелфалан застосовують у першу чергу для лікування множинної мієломи і раку яєчників, і іноді злоякісної меланоми. Звичайно його вводять перорально або внутрішньовенно. Одним аспектом даного винаходу є фармацевтична композиція, що містить анти-CD38 антитіло в комбінації щонайменше з мелфаланом. Оскільки активність продуктів залежить від застосовуваних доз, стає можливим використовувати нижчі дози і підвищувати активність при зменшенні феномену токсичності. Поліпшену ефективність комбінації відповідно до винаходу можна продемонструвати за допомогою визначення терапевтичного синергізму. Комбінація виявляє терапевтичний синергізм, якщо в терапевтичному плані вона перевершує найкращу речовину в дослідженні, яку застосовують єдиною у її максимальній допустимій дозі або в її найвищій тестованій дозі, за відсутності можливості досягнення токсичності у цих видів тварин. Зазначену ефективність можна кількісно підрахувати, наприклад, за допомогою log 10 знищення клітин, що визначають відповідно до наступної формули: log10 знищення клітин = Л-К (дні)/3,32 × Td, у якій Л-К виражає затримку пухлинного росту, що являє собою середній час у днях для пухлин групи лікування (Л) і пухлин контрольної групи (К), необхідний для досягнення заданого значення (наприклад, 1 г), і Td позначає час у днях, необхідний для збільшення об’єму пухлини в два рази у контрольних тварин [Corbett T. H. et al., Cancer, 40: 2660-2680 (1977); Schabel F. M. et al., Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17: 3-51, New York, Academic Press Inc. (1979)]. Продукт вважається активним, якщо log10 знищення клітин був більшим або дорівнював 0,7. Продукт вважається дуже активним, якщо log10 знищення клітин перевищував 2,8. Комбінація буде виявляти терапевтичний синергізм, якщо значення log 10 знищення клітин у комбінації буде перевищувати значення log10 знищення клітин у її кращого компонента при його введенні єдиним і застосуванні в його максимальній переносимій дозі або в його найвищій тестованій дозі. Ефективність комбінацій для солідних пухлин можна експериментально визначати наступним чином. Експериментальним тваринам, звичайно мишам, в обидва боки підшкірно трансплантували фрагмент пухлини вагою від 30 до 60 мг у день 0. Перед проведенням різних видів лікування і контролю тварин з пухлинами рандомізовано розділяли на основі розміру пухлини. Хіміотерапію починали при досягненні заданого розміру пухлини після трансплантації, залежно від типу пухлини, і спостереження за тваринами проводили щодня. Тварин з різних груп зважували щодня під час лікування до досягнення максимальної втрати ваги і до наступного повного відновлення ваги. Після цього зважування в групах проводили один раз або два рази на тиждень до кінця дослідження. Пухлини вимірювали від 1 до 5 разів на тиждень, залежно від часу подвоєння пухлини, поки пухлина не досягала ваги близько 2 г, або до настання смерті тварини (якщо це відбувалося до досягнення ваги пухлини в 2 г). Розтин тварин проводили відразу після евтаназії або смерті. Протипухлинна активність визначалася відповідно до отриманого ряду параметрів. Нижче як приклади наведені результати, отримані з комбінаціями hu38SB19 і мелфалану, що застосовувалися в їхніх оптимальних дозах. Таким чином, даний винахід також належать до фармацевтичних композицій, що містять комбінації відповідно до винаходу. Компоненти, що складають комбінацію, для досягнення максимальної ефективності комбінації можна вводити одночасно, наполовину одночасно або роздільно з проміжками в часі; для кожного введення можливі варіанти за тривалістю від швидкого введення до постійного вливання. Таким чином, для цілей даного винаходу згадані комбінації не обмежені винятково комбінаціями, що отримані шляхом фізичного зв'язку компонентів, але також існують комбінації, що дозволяють здійснювати роздільне введення, яке може бути одночасним або з проміжками в часі. Композиції відповідно до винаходу, переважно, є композиціями, які можна вводити парентерально. Разом з тим, згадані композиції можна вводити перорально, підшкірно або внутрішньоочеревинно, у випадку проведення локальної регіонарної терапії. Композиції для парентерального введення звичайно являють собою фармацевтично прийнятні стерильні розчини або суспензії, які необов'язково можна готувати в міру необхідності перед застосуванням. Для приготування неводних розчинів або суспензій можна використовувати рослинні олії природного походження, такі як маслинова олія, кунжутна олія або рідкий вазелін, або органічні складні ефіри для ін'єкцій, наприклад, етилолеат. Стерильні водні розчини можуть складатися з розчину продукту у воді. Водні розчини придатні для 4 UA 107069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 внутрішньовенного введення при відповідному відрегульованому рівні pН і ізотонічному стані приготовленого розчину, наприклад, з достатньою кількістю натрію або хлориду глюкози. Стерилізацію можна здійснювати шляхом нагрівання або будь-яким іншим способом, який не має несприятливого впливу на композицію. Комбінації також можуть бути у вигляді ліпосом або у вигляді асоціації з носіями, напри,з циклодекстринами або поліетиленгліколями. Композиції для перорального, підшкірного або внутрішньоочеревинного введення, переважно, являють собою водні суспензії або розчини. Для комбінацій відповідно до винаходу з застосуванням компонентів, яке може бути одночасним, роздільним або з проміжками в часі, особливо переважним є така кількість гуманізованого анти-CD38 антитіла, що становить від 10 до 90% ваги комбінації, при цьому зазначений вміст може варіювати відповідно до природи асоційованої речовини, необхідної ефективності і природи ракового захворювання, яке необхідно лікувати. Комбінації відповідно до винаходу особливо корисні при лікуванні декількох типів ракових захворювань, що включають у себе (але без обмежень) наступне: карциноми й аденокарциноми, що включають у себе зазначені пухлини сечового міхура, молочної залози, товстої кишки, пухлини голови і шиї, передміхурової залози, нирки, печінки, легені, яєчника, підшлункової залози, шлунка, шийки матки, щитовидної залози і шкіри, і включають у себе плоскоклітинну карциному; гематопоетичні пухлини лімфоїдного походження, що включають у себе множинну мієлому, лейкоз, гострий і хронічний лімфоцитарний (або лімфоїдний) лейкоз, гострий і хронічний лімфобластний лейкоз, B-клітинну лімфому, Т-клітинну лімфому, неходжкінську лімфому (наприклад, лімфому Беркітта); гематопоетичні пухлини мієлоїдного походження, що включають у себе гострий і хронічний мієлогенний лейкоз (мієлоїдний або мієлоцитарний) і промієлоцитарний лейкоз; пухлини мезенхімального походження, що включають у себе фібросаркому, остеосаркому і рабдоміосаркому; пухлини центральної і периферичної нервової системи, що включають у себе астроцитому, нейробластому, гліому і шваноми; і інші пухлини, що включають у себе меланому, тератокарциному, пігментну ксеродерму, кератоксантому і семіному, і інші ракові захворювання, для яких існує необхідність у визначенні експресії CD38. В основному згадані комбінації корисні для лікування лейкозу, лімфоми і ракових захворювань, стійких до широкозастосовних протиракових агентів, оскільки анти-CD38 антитіла за винаходом мають унікальний механізм дії. Таким чином, даний винахід також охоплює використання вищезгаданих комбінацій для виготовлення ліків для лікування раку. Приклад: У цьому прикладі показана ефективність in vivo для інгібування пухлинного росту за допомогою комбінації анти-CD38 антитіла/мелфалану за винаходом. Перша вибрана модель пухлини була трансплантованою людською лінією клітин множинної мієломи, RPMI-8226, яку імплантували мишам SCID. 2+ 2+ Рецептуру hu38SB19 виготовляли у фосфатно-буферному розчині без Са і Mg , з рівнем pН 7,4. Hu38SB19 уводили внутрішньовенно в дні 16, 19, 22 і 25 після імплантації пухлини. Рецептуру мелфалану виготовляли у водному розчині 5% етанолу, 5% полісорбату 80, 90% натрію хлориду 0,9%. Мелфалан уводили внутрішньовенно одночасно з Нu38SB19 у дні 16, 19, 22, 25 після імплантації пухлини (за винятком найвищої дози комбінації, після якої лікування було зупинено на 19 день при досягненні токсичності). Результати експерименту показані в таблиці 1. Час подвоєння пухлини = 3,2 дні. Використовували наступні кінцеві точки: - Токсичність визначали при дозах, що викликають ≥20% втрату маси тіла або ≥10% смерть від препарату. - Протипухлинну ефективність визначали шляхом обчислення log 10 знищення клітин = (ЛК)/[3,32 × (час подвоєння пухлини в днях)] (Л позначає середній час досягнення 1000 мг у мишей, яких лікують, і К позначає середній час (25,3 днів) у контрольних мишей, за який досягався такий же розмір; дані мишей без пухлини, що вижили, виключені з цих обчислень і зведені в таблицю окремо). Відсутність протипухлинної активності була виявлена при log10 знищення клітин через 100 днів після останнього лікування). 5 UA 107069 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - Терапевтичний синергізм: комбінація має терапевтичний синергізм, якщо вона більш ефективна, ніж кращий агент дослідження, що вводиться єдиним (щонайменше 1 log знищення клітин). Токсичність для мелфалану при його введенні єдиним виявлена в дозі 16,1 мг/кг/на ін'єкцію, при 3 випадках смерті, пов'язаних із препаратом, з 5 мишей, тобто, вище ніж 10% поріг. Найвища нетоксична доза (HNTD) для мелфалану становила 10 мг/кг/ін'єкцію (загальна доза ін'єкції = 40 мг/кг). Виявлено, що активність знищення клітин log у дозі 10 мг/кг/ін'єкцію складала 1,9. Що стосується hu38SB19, переносимість продукту була хорошою в дозі 40 мг/кг/ін'єкцію. Не виявлено якої-небудь токсичності, яку можна пояснити відсутністю крос-реактивності антитіла зі щурячим CD38. Знищення клітин 0,5 log вказувало, що при цих умовах hu38DB19 не був ефективним. Комбінація мелфалану в дозі 16,1 мг/кг/ін'єкцію і hu38SB19 у дозі 40 мг/кг/ін'єкцію була токсичною, при 5 з 5 випадках смерті, пов'язаних із препаратом, тобто, дуже подібною з тим, що спостерігалося з мелфаланом єдиним у тій же дозі. Передбачається, що мелфалан у дозі 10 мг/кг/ін'єкцію з hu38SB19 у дозі 40 мг/кг/ін'єкцію є дозою HNTD. Знищення клітин 2,2 log у цій дозі вказувало на те, що комбінація мала таку ж ефективність, як найкращий агент, а саме мелфалан. Інший експеримент проводили на моделі людської множинної мієломи LP1, що має високу чутливість до мелфалану в порівнянні з RPMI-8226. Модель імплантували мишам SCID. Рецептуру hu38SB19 виготовляли в розчині 5% глюкози у воді. Hu38SB19 уводили внутрішньовенно в дні 12, 15, 18 і 21 після імплантації пухлини. Рецептуру мелфалану виготовляли у водному розчині 5% етанолу, 5% полісорбату 80, 90% натрію хлориду 0,9%. Мелфалан уводили внутрішньовенно одночасно з hu38SB19 у дні 12, 15, 18 і 21 після імплантації пухлини. Результати експерименту показані в таблиці 2. Час подвоєння пухлини = 1,5 дня. Використовували наступні кінцеві точки: - Токсичність визначали при дозах, що викликають ≥20% втрату маси тіла або ≥10% смерть від препарату. - Протипухлинну ефективність визначали шляхом обчислення log 10 знищення клітин = (ЛК)/[3,32 × (час подвоєння пухлини в днях)] (Л позначає середній час досягнення 1000 мг у мишей, яких лікували, і К позначає середній час (16,8 днів) у контрольних мишей, за який досягався такий же розмір; дані мишей без пухлини, що вижили, виключені з цих обчислень і зведені в таблицю окремо). Відсутність протипухлинної активності була виявлена при log 10 знищення клітин