Спосіб регулювання специфічності сигналізації тканинного фактора у ссавця, який цього потребує, спосіб ідентифікації агента, що специфічно інгібує сигналізацію тканинного фактора

1. Спосіб інгібування або пригнічення сигналізації тканинного фактора/фактора VІІa (TF/VІІа) через протеазоактивований рецептор 2 (PAR2) у ссавця, який цього потребує, згідно з яким ссавцеві вводять інгібітор сигналізації тканинного фактора, що не впливає на гемостаз ссавця. 2. Спосіб за п. 1, у якому ссавець хворіє на пов'язане з ангіогенезом захворювання, новоутворення або запалення. 3. Спосіб за п. 1, у якому інгібітор не заважає активуванню коагуляції. 4. Спосіб за п. 1, у якому сигналізація TF/VІІа залежить від протеїндисульфідізомерази (PDI). 2 (19) 1 3 94922 4 17. Спосіб за п. 15, у якому сполука являє собою моноклональне антитіло 10Н10, що його виробляє гібридома з номером доступу АТСС НВ9383. 18. Спосіб ідентифікації агента, який інгібує сигналізацію TF/VІІа через протеазоактивований рецептор 2 (PAR2), але не впливає на коагуляцію, згідно з яким вимірюють у присутності або відсутності дослідної сполуки зв'язування між (і) антитілом або молекулою, що зв'язує антиген, і має специфічність зв'язування моноклонального антитіла 10Н10, що його виробляє гібридома з номером доступу АТСС НВ9383, та (іі) поліпептидом тканинного фактора, й визначають інгібування такого зв'язування у присутності дослідної сполуки у порівнянні із зв'язуванням у відсутності дослідної сполуки, ідентифікуючи таким чином агент, який інгібує сигналізацію TF/VІІа, але не впливає на коагуляцію. 19. Спосіб за п. 18, у якому антитіло або молекула, що зв'язує антиген, являє собою моноклональне антитіло 10Н10, що його виробляє гібридома з номером доступу АТСС НВ93 83. 20. Спосіб за п. 18, у якому дослідною сполукою є мала молекула органічної сполуки. 21. Спосіб за п. 18, у якому виявляють інгібувальну дію виявленого агента на сигналізацію тканинного фактора. 22. Спосіб за п. 18, у якому виявляють відсутність інгібувальної дії виявленого агента на медійовану тканинним фактором коагуляцію. 23. Спосіб за п. 18, у якому (і) контактують у присутності або відсутності виявленого агента поліпептид тканинного фактора з моноклональним антитілом 5G9, що його виробляє гібридома з номером доступу АТСС НВ9382, та (іі) виявляють відсутність інгібувальної дії виявленого агента на зав’язування тканинного фактора моноклональним антитілом 5G9, що його виробляє гібридома з номером доступу АТСС НВ9382. Предмет цього винаходу користується пріоритетом тимчасової заявки США № 60/734,149 від 2005. Опис пріоритетної заявки повністю включений сюди шляхом посилання для будь-яких цілей. Цей винахід створений завдяки урядовій підтримці за грантами №№ HL60472, HL31950 та HL16411 Національного інституту захворювань серця, легенів та крові. Уряд має певні права на цей винахід. Винахід стосується сполук та способів лікування хвороб, залежних від сигналінгу тканинного фактору/фактору VІla (TF/VIIa) у ссавців. Спосіб полягає у введенні до організму ссавця інгібітору сигналінгу тканинного фактору. Інгібітор ефективно послаблює або виключає прояви хвороби або запобігає її появі чи рецидиву, не порушуючи систему гемостазу ссавця. Комплекс ферментів поверхневого рецептора клітини тканинного фактору (TF) разом з фактором VІla серинової протеїнази активує фізіологічний гемостаз та коагуляцію й водночас переключає активований протеазою рецепторний сигналінг в стані запалення, поширення пухлини та ангіогенезу (Mackman, Arterioscler. Thromb. Vase. Вiol. 24: 1015-1022, 2004; Riewald and Ruf, CHt. Care 7:123129, 2003; Belting et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 25: 1545-1550, 2005). Те, яким чином вищерозташованний сигналінг скерований TF-VIIa, визначає патологію, не будучи перекритим нижчими згенерованими набагато міцнішими коагуляційними протеазами, залишається фундаментальною невирішеною проблемою судинної біології (Kawabata et al., Br J Pharmacol, 144: 212-219,2005; Namkung, et al., Gastroenterology, 126: 1844-1859, 2004; Fiorucci, et al., Proc Natl Acad Sci USA,98: 13936-13941,2001; Cocks et al., Nature, 398: 156160, 1999). TF зв'язує та алостерично активує фактор Vlla та бере участь у складанні третинного комплексу запуску коагуляції TF-VIIa-X, який вивільняє продукт Задля продукування тромбіну. (Norledge et al., Proteins 53: 640-648, 2003). Комплекс TF-VIIa-X також прямо розщеплює протеазоактивовний рецептор (PAR)2 (Camerer et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 97: 5255-5260, 2000; Riewald and Ruf, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 7742-7747, 2001). Незважаючи на те, що роль тромбіну, сигналізуючого через PAR2 при гемостазі та запаленні, добре відома, активація PAR альтернативними протеазами in vivo майже не вивчена (Coughlin, J. Thromb. Haemost. 3: 1800-1814, 2005). TF та PAR2 тісно пов'язані, бо фосфорилювання цитоплазматичного домену TF є наслідком сигналізації PAR2, а в мишей з видаленим цитоплазматичним доменом в TF посилюється залежний від PAR2 ангіогенез (Ahamed and Ruf, J. Вiol. Chem. 279: 2303823044,2004; Belting et al., Nature Med. 10: 502-509, 2004). Втім, ще не до кінця зрозуміло, як регулюється сигналізація TF-VIIa і відіграє фізіологічну роль незалежно від сигналів інших нижчерозташованих протеаз. Зараз не існує інгібіторів ангіогенезу, офіційно затверджених для лікування пов'язаних з ангіогенезом хвороб. Існує потреба в умінні регулювання або інгібування сигналінгу TF, пов'язаного з ангіогенезом, зростанням пухлинних клітин, метастазами пухлин або запаленнями, яка не заважали б нормальному функціонуванню шляхів гемостазу. Цей винахід стосується сполук та способів лікування хвороб ссавців, зокрема, пов'язаних з ангіогенезом хвороб, запалень або новоутворень. Сполука є інгібітором сигналінгу тканинного фактору , який не зачіпає гемостазу в організмі ссавця. Спосіб полягає у введенні до організму ссавця інгібітору сигналінгу тканинного фактору. Інгібітор ефективно зменшує прояви пов'язаних з ангіогенезом хвороб, запалень або новоутворень, не підвищуючи ризику послаблення коагуляції або посилення кровотечії в організмі ссавця. Спосіб лікування хвороб, залежних від сигналізації тканинного фактору/фактору Vlla в організмі ссавця, полягає у введенні інгібітору сигналізації 5 тканинного фактору в кількості, достатній щоб послабити або усунути прояви хвороби чи запобігти її появі або рецидиву, причому інгібітор не порушує гемостаз в організмі хворого. Такими хворобами є, але ними не вичерпуються, пов'язані з ангіогенезом хвороби, запалення або новоутворення. Новоутворення та запалення відносяться до, хвороб, пов'язаних з ангіогенезом. В одному сенсі інгібітор являє собою антитіло або невелике хімічне утворення. Точніше, інгібітором є моноклональне антитіло 10Н10 (МАb 10Н 1.0), що його виробляє гібридома за номером Американської колекції типових культур (АТСС) НВ93 83. Згідно із способом розпізнання сполуки, яка регулює сигналізацію тканинного фактору в клітинах, дослідну сполуку вводять у контакт з аналітичною системою на клітинній основі, яка містить експресований клітинами тканинний фактор, здатний до сигналізації, а залежна від тканинного фактору сигналізація регулюється протеїндисульфідізомеразою, яка надає фактор Vlla до аналітичної системи у достатній кількості, щоб активувати залежну від тканинного фактору сигналізацію, потім визначають вплив зазначеної дослідної сполуки на залежну від тканинного фактору сигналізацію у зазначеній аналітичній системі, причому ефективність зазначеної дослідної сполуки у зазначеній аналітичній системі є показником такого регулювання. З одного боку, спосіб включає визначення інгібуючої дії дослідної сполуки на сигналізацію тканинного фактору у зазначеній аналітичній системі. З другого - пересвідчуються, що дослідна речовина не впливає на опосередкований тканинним фактором гемостаз. Клітинами є, серед інших, кератиноцити, меланоми або епітеліальні клітини. Надалі клітинна аналітична система сигналізує свою здатність до відповіді через протеазоактивовний рецептор 2. При цьому дослідна речовина являє собою антитіло або невелике хімічне утворення. Зокрема, ця сполука інгібує зв'язування МАb 10H10 з тканинним фактором. Вона не інгібує зв'язування моноклонального антитіла 5G9 (МАb 5G9), що його виробляє гібридома під номером НВ9382, з тканинним фактором. Згідно із способом лікування ангіогенезу у ссавців піддослідному вводять терапевтично ефективну кількість сполуки, яка регулює сигналізацію у клітинах через шлях тканинного фактору/фактору Vlla, де зазначена сполука є антагоністом сигналізації тканинного фактору/фактору Vlla у клітинній аналітичній системі, та зазначена сполука послаблює або усуває ангіогенез або попереджає його появу або рецидив у ссавця. При цьому сполука не впливає на гемостаз ссавця. З одного боку сигналізація тканинного фактору/фактору Vlla залежить від протеїндисульфідізомерази. З другого, - відбувається через протеазо-активовний рецептор 2. При цьому дослідна речовина являє собою антитіло або невелике хімічне утворення. Зокрема, ця сполука інгібує зв'язування МАb 10Н10 з тканинним фактором. Вона не інгібує зв'язування МАb 5G9 з тканинним фактором. Згідно із способом лікування новоутворень у ссавців хворому вводять терапевтично ефективну кількість сполуки, яка регулює сигналізацію у клі 94922 6 тинах через шлях тканинного фактору-фактору Vlla, де зазначена сполука є антагоністом сигналізації тканинного фактору-фактору Vlla у клітинній аналітичній системі й послаблює або усуває новоутворення або попереджає його появу або рецидив у ссавця. При цьому сполука не впливає на гемостаз ссавця. Сигналізація тканинного фактору-фактору Vlla залежить від протеїндисульфідізомерази, а відбувається через протеазоактивовний рецептор 2. При цьому дослідна речовина являє собою антитіло або невелике хімічне утворення. Зокрема, ця сполука інгібує зв'язування MAb 10Н10 з тканинним фактором. Вона не інгібує зв'язування MAb 5G9 з тканинним фактором. Згідно із способом лікування запалень у ссавців хворому вводять терапевтично ефективну кількість сполуки, яка регулює сигналізацію у клітинах через шлях тканинного фактору-фактору Vlla, де зазначена сполука є антагоністом сигналізації тканинного фактору-фактору Vlla у клітинній аналітичній системі й послаблює або усуває захворювання або попереджає його появу або рецидив у ссавця. При цьому сполука не впливає на гемостаз ссавця. Сигналізація тканинного факторуфактору Vlla у цьому способі залежить від протеїндисульфідізомерази, а відбувається через активований протеазо-активовний 2. При цьому дослідна речовина являє собою антитіло або невелике хімічне утворення. Зокрема, ця сполука інгібує зв'язування MAB 10Н10 з тканинним фактором. Вона не інгібує зв'язування MAb 5G9 з тканинним фактором. Згідно із способом визначення наявності або схильності до пов'язаного з ангіогенезом хворобливого стану у ссавців беруть пробу; вводять до проби антитіло, яке специфічно зв'язується із тканинним фактором, й визначають наявність або кількість антитіла, зв'язаного з тканинним фактором у пробі, причому наявність антитіла, зв'язаного з тканинним фактором, свідчить про наявність або схильність до пов'язаного з ангіогенезом хворобливого стану у ссавця, при цьому антитіло інгібує сигналізацію тканинного фактора й не впливає на гемостаз ссавця. У цьому методі підвищений рівень антитіла, зв'язаного з тканинним фактором, свідчить про наявність або схильність до пов'язаного з ангіогенезом хворобливого стану. В даному випадку антитілом є MAb 10Н10. Пов'язаним з ангіогенезом захворювання може бути викликаним новоутворенням або запаленням. Згідно із способом визначення наявності або схильності до пов'язаного з новоутворенням хворобливого стану у ссавців беруть пробу у ссавця; вводять до проби антитіло, яке специфічно зв'язується із тканинним фактором у пробі, й визначають наявність або кількість антитіла, зв'язаного з тканинним фактором у пробі, причому наявність антитіла, зв'язаного з тканинним фактором, свідчить про наявність або схильність до пов'язаного з новоутворенням хворобливого стану у ссавця, при цьому антитіло інгібує сигналізацію тканинного фактора й не впливає на гемостаз ссавця. У цьому способі підвищений рівень антитіла, зв'язаного з тканинним фактором, свідчить про наявність або схильність до пов'язаного з новоутворенням хво 7 робливого стану. Антитілом є MAb 10Н10. Пов'язаним з новоутворенням станом може бути солідна пухлина, доброякісний або злоякісний рак грудей, меланома, гліома, астроцитома, гематологічне злоякісне утворення, лейкемія, рак легенів, рак прямої кишки, рак матки, лейоміома матки, рак яєчників, рак ендометрія, синдром полікістозу яєчників, внутрішньоматкові поліпи, рак простати, гіпертрофія простати, рак жовчного міхура, аденоміоз, залозистий рак, менінгіома, рак кісток, множинна мієлома або рак ЦНС. Згідно зі способом визначення наявності або схильності до пов'язаного з запаленням хворобливого стану у ссавців беруть пробу у ссавця; вводять до проби антитіло, яке специфічно зв'язується із тканинним фактором, й визначають наявність або кількість антитіла, зв'язаного з тканинним фактором у пробі, причому наявність антитіла, зв'язаного з тканинним фактором, свідчить про наявність або схильність до пов'язаного з запаленням хворобливого стану у ссавця, при цьому антитіло інгібує сигналізацію тканинного фактора й не впливає на гемостаз ссавця. У цьому способі підвищений рівень антитіла, зв'язаного з тканинним фактором, свідчить про наявність або схильність до пов'язаного з запаленням хворобливого стану. Антитілом є MAb 10H10. Фіг.1 показує специфічне інгібування сигналінгового тканинного фактору. Фіг.2 показує регулювання сигнального тканинного фактору протеїн-дисульфідизомеразою. Фіг.3 показує сигналізацію відновленого тканинного фактору. Фіг.4 показує, як сигналізація TF-VIIa сприяє зростанню пухлини. Фіг.5 показує призначення епітопу для MAb10Н10. Фіг.6 показує, що інактивація коагуляційної активності TF залежить від оксиду азоту. Фіг.7 показує, що утворення комплексу TFPAR2 є необхідне для сигналінгу TF-VIIa. Цей винахід пропонує сполуки та способи лікування аномального сигналінгу тканинного фактору/фактору Vlla (TF/VIIa) (наприклад, у осіб з надлишковим TF/VIIa сигналінгом) та лікування осіб, які потерпають від захворювань або станів, що залежать, медіюються або пов'язані з TF/VIIa сигналінгом. Аномальною сигналізацією TF/VIIa вважається надлишкова або недостатня активність шляху сигналізації тканинного фактору/фактору Vlla (TF/VIIa) у порівнянні із здоровими особами. До хвороб, які залежать від сигналізації TF/VIIa, належать усі розлади або стани, поява або розвиток яких медіюються або пов'язані з аномальною сигналізацією TF/VIIa шляху. Це, наприклад, запалення, новоутворення та ангіогенезо-залежні хвороби. До останніх відносяться хвороби з надлишковим ангіогенезом (серед них рак, діабетична сліпота, вікова дегенерація жовтої плями, ревматоїдний артрит та псоріаз) або недостатнім ангіогенезом (коронарна хвороба, інсульт, повільне загоєння ран). Як правило, сполуки у винаході містять інгібітор сигналізації на шляху TF/VIIa, який не впливає на медійований TF гемос 94922 8 таз (наприклад, коагуляцію). Згідно із способом за винаходом ссавцям для лікування вводять ефективну кількість такого інгібітору. Інгібітор ефективний у зменшені появ або проявів запалення або новоутворення, не збільшуючи ризик кровотечії у піддослідної особи. Комплекс ферментів поверхневого рецептора клітини тканинного фактору (TF) разом з сериновою протеїназою фактором Vlla активує фізіологічний гемостаз та коагуляцію й водночас переключає активований протеазою рецепторний сигналінг, в стані запалення, поширення пухлини та ангіогенезу (Mackman, Arterioscler. Thromb. Vase. Вiol. 24: 1015-1022, 2004; Riewald and Ruf, Crit. Care 7: 123-129, 2003; Belting et al., Arterioscler. Thromb. Vase. Вiol. 25: 1545-1550, 2005). Яким чином вищерозташованний сигналінг скерований TFVIIa визначає патологію, не будучи перекритим нижчими згенерованими набагато міцнішими коагуляційними протеазами, залишається фундаментальною невирішеною проблемою судинної біології. Як пояснюється далі у прикладах, цей винахід демонструє, що позаклітинна протеїндисульфідізомераза (PDI) зв'язується з TF, регулюючи коагуляцію при збереженні клітинної сигналізації. Розщеплюючи зовнішньоклітинний TF по 186 209 дисульфідному зв'язку Cys -Cys , імітує функціональні властивості регульованого PDI сигналінгу TF. Отже, шляхи обміну дисульфідних станів діють як позаклітинні перемикачі специфічності функції рецептора. Вплив моноклональними антитілами, націленими на природну конформацію сигнального TF, інгібує клітину відповідь та зростання пухлини in vivo (наприклад, раку грудей або меланоми). Втручання в патофізіологічний індукований TF сигналінг без погіршення нормального індукованого TF гемостазу є прикладом того, що функціональні властивості дисульфідних перемикачів можуть бути використані в лікувальних цілях. Звичайно, цей винахід не обмежується окремими методиками, реагентами, сполуками, композиціями або біологічними системами, які можуть бути найрізноманітніші. Так само і термінологію вжито тут суто для потреб опису конкретних варіантів здійснення, й вона не є обмежувальною. Вжиті у цьому описі винаходу форми однини мають на увазі також і множину, якщо з контексту не витікає протилежне. Наприклад, "клітина" означає також сполучення двох або більше клітин, і т.ін. Термін "біля", якщо вживається з числовою величиною, як от кількість, тривалість тощо, мається на увазі, що відхилення не перевищують ±20% або ±10%, зокрема, ±5%, переважно ±1%, найкраще ±0.1% від наведеного значення, оскільки такі відхилення впливають на здійснення наведених способів. Якщо не зазначено інше, усі науково-технічні терміни тут мають значення, звичайно вживані фахівцями галузі. Хоча при практичних випробуваннях винаходу можуть вживатися будь-які прийоми та матеріали, подібні або еквівалентні до описаних тут, ми наводимо переважні матеріали та прийоми. В описі та формулі винаходу вживається наступна термінологія. 9 "Гемостаз" - припинення кровотечії з пораненої судини, вимагає спільної дії судинних, тромбоцитарних та плазматичних факторів, врівноважених регуляторними механізмами, що попереджають накопичення тромбоцитів та фібрину у зоні поранення. Аномалії гемостазу призводять до тромбозу або надлишкової кровотечії. "Ангіогенез" - утворення нових кровоносних судин у ссавця у здоровому або хворобливому стані. Ангіогенез має місце при загоєнні ран та для поновлення притоку крові до тканин після поранення або враження. У жінок ангіогенез відбувається також під час місячного репродуктивного циклу (для поновлення стінок матки, для визрівання яйця при овуляції) та під час вагітності (для утворення плаценти, кровообігу між матір'ю та плодом). Коли фактори ангіогенезу виробляються в надлишку в порівнянні кількості ангіогенних з інгібіторнми факторів росту судин, спостерігається зростання кровоносних судин. Коли інгібітори знаходяться в надлишку відносно стимуляторів, ангіогенез припиняється. Надлишковий ангіогенез відбувається при хворобах, серед яких, наприклад, рак, діабетична сліпота, вікова дегенерація жовтої плями, ревматоїдний артрит та псоріаз. За таких умов нові судини живлять вражені тканини, руйнують нормальні тканини, а у випадку раку прокладають шлях метастазам пухлин. Недостатній ангіогенез має місце, зокрема, при коронарній хворобі, інсульті та повільному загоєнні ран. Тоді зростають неадекватні судини, а кровообіг не відновлюється належним чином, що може призвести до вмирання тканин Лікування новоутворень "Новоутворення" - це ракові або інші злоякісні пухлини, спричинені ненормальним та неконтрольованим поділом клітин, які можуть поширюватися на інші частини організму через лімфатичну або кровоносну систему, "солідна пухлина" - це, зокрема, саркома, меланома, карцинома або інша солідна ракова пухлина. "Саркома" - це пухлина, утворена з речовини, що нагадує зародкову сполучну тканину, яка складається з щільно упакованих клітин, занурених до фібрилярної або гомогенної речовини. Існують, зокрема, хондросаркома, фібросаркома, лімфосаркома, меланосаркома, міксосаркома, остеосаркома, саркома Абернеті, адіпозна саркома, ліпосаркома, саркома альвеолярних м'яких тканин, амелобластна саркома, ботриоїдна саркома, хоріосаркома, ембріональна саркома, саркома Вільмса, ендо-метріальна саркома, стромальна саркома матки, саркома Юінга, фасціальна саркома, фібробластна саркома, злоякісна гігантоклітинна пухлина, гранулоцитарнна саркома, саркома Ходжкіна, ідіопатична геморагічна саркома з множинною пігментацією, імунобластна саркома Вклітин, лімфома, імунобластна саркома Т-клітин, саркома Єнсена, саркома Капоші, клітинна саркома Купфера, ангіосаркома, лейко-саркома, злоякісна саркома мезенхіми, паростеальна саркома, ретикулоцитна саркома, саркома Рауса, сероцистна саркома, синовіальна саркома та телеангіоектатична саркома. 94922 10 "Меланома" - пухлина, яка виникає з меланоцитної системи шкіри та інших органів, наприклад, акрально-лентигінозна меланома, безпигментна меланома, доброякісна підліткова меланома, меланома Клаудмена, меланома S91, меланома Гард інга-Пассея, ювенильна меланома, злоякісне ластовиння, злоякісна меланома, бугриста меланома, піднігтева меланома та поверхнева меланома. "Карцинома" - злоякісне новоутворення з епітеліальних клітин, які проникають до сусідніх тканин та продукують метастази, наприклад, ацинарна карцинома, аденоцистома, аденокистозна карцинома, аденоматозна карцинома, карцинома кори надниркових залоз, альвеолярна карцинома, карцинома базальних клітин, базаліома, плоскоклітинний рак, бронхоальвеолярна карцинома, альвеолярно-клітинний рак, бронхогенна карцинома, мізковидний рак, холангіоклітинна карцинома, хоріокарцинома, колоїдна карцинома, комедокарцинома молочної залози, ґратчаста карцинома, панцирна карцинома, рак шкіри, циліндрична карцинома, циліндрично-клітинна карцинома, рак протоків, тверда карцинома, ембріональний рак, круглоклітинна карцинома, епіермоїдальна карцинома, епітеліальний рак аденоїдів, екзофітна карцинома, позавиразкова карцинома, фіброкарцинома, желатиноподібна карцинома, гигантоклітинний рак, залозистий рак, рак зернистих клітин яєчників, карцинома матрикса волосу, гематоїдна карцинома, печінково-клітинний рак, карцинома клітин Гьортла, карцинома гіалинового хряща, гіпернефрома, ембріональна карцинома немовлят, преінвазивний рак, міжепідермальний рак, внутрі-шньоепідермальний рак, карцинома Кромпехера, карцинома клітин Кульчицького, великоклітинна карцинома, карцинома кришталика ока, ліпоматозна карцинома, лімфоепітеліальна карцинома, медулярний рак, меланокарцинома, мукоїдний рак, мукоепідермоїдна карцинома, слизовий рак, міксоматозна карцинома, рак носоглотки, овсяно-клітинний рак легенів, рак кісткоподібної тканини, папилярна аденокарцинома, перипортальна карцинома, рак шиловидних клітин, перстнеподібно-клітинний рак, клітинний рак нирок, карцинома резервних клітин, саркомопоподібна карцинома, карцинома Шнейдера, скірозний рак, карцинома яєчок, недиферен-ційований рак, карцинома дрібних клітин, картопляноподібний рак, веретеноклітинний рак, губчаста карцинома, гирляндоподібна карцинома, остеогенна карцинома із судинним компонентом, перехідно-клітинний рак, бугриста карцинома, сосочково-плоскоклітинний рак та віфльозна карцинома. "Лейкемія" - це прогресуюча злоякісна хвороба кровотвірних органів, яка характеризується неконтрольованою проліферацією і розвитком лейкоцитів та їх попередників у крові та кістковому мозку. Клінична класифікація лейкемії базується на (1) тривалості та характері захворювання - гостре чи хронічне; (2) виді зайнятих клітин: мієлоїдних (мієлогенна), лімфоїдних (лімфогенна) або моноцитарних; (3) збільшенні або незбільшенні кількості аномальних клітин у крові - лейкемія або алейкемія (сублейкемія). Існують такі види, як гостра не 11 лімфоцитарна лейкемія, хронічна лімфоцитарна лейкемія, гостра гранулоцитарна лейкемія, хронічна гранулоцитарна лейкемія, гостра промієлоцитарна лейкемія, лейкемія Т-клітин у дорослих, алейкемічна лейкемія, лейкоцитемічна лейкемія, базофільна лейкемія, недиференційований лейкоз, коров'яча лейкемія, хронічна мієлоцитарна лейкемія, гематодерматоз, ембриональна лейкемія, еозинофільна лейкемія, лейкемія Гросса, лейкемія клітин Корті, гемобластоз, гемоцитобластоз, гістіоцитарна лейкемія, лейкоз стовбурних клітин, гостра моноцитарна лейкемія, лейкопенічна лейкемія, лімфатична лейкемія, лімфобластна лейкемія, лімфоцитарна лейкемія, лімфогенна лейкемія, лімфоїдна лейкемія, лімфосаркомоподібна лейкемія, мастоцитоз, мегакаріоцитна лейкемія, мікромієлобластна лейкемія, моноцитарна лейкемія, мієлобластна лейкемія, мієлоцитарна лейкемія, мієлоїдна гранулоцитарна лейкемія, мієломоноцитарна лейкемія, лейкемія Негелі, плазмоцитарна лейкемія, промієлоцитарна лейкемія, лейкемія Шиллінга, сублейкемія та недиференційована лейкемія. Серед інших видів раку можна навести, наприклад, хворобу Ходжкіна, неходжкінівську лімфому, множинну мієлому, нейробластому, рак грудей, рак яєчників, рак легенів, рабдоміосаркому, первинний тромбоцитоз, первинну макроглобулинемію, рак дрібних клітин легенів, первинні пухлини мозку, рак шлунку, рак кишковика, злоякісну інсуліному підшлункової залози, злоякісні карциноїди, рак сечового міхура, передзлоякісні виразки шкіри, рак яєчок, лімфоми, рак щитовидної залози, нейробластому, рак стравоходу, рак сечостатевого тракту, злоякісну гіперкальцемію, рак шийки матки, рак ендометрію, рак кори надниркових залоз та рак простати. Лікування запалень Термін "запалення" чи "запалювальне захворювання" охоплює як гострі (коли активізуються запалювальні процеси), так і хронічні (з повільною течією та утворенням нової сполучної тканини) реакції. Гострі та хронічні запалення розрізняються типом клітин, що беруть у них участь. Гостре запалення часто буває пов'язане з поліморфоядерними нейтрофілами, а хронічне звичайно характеризується лімфогістоцитарною та/або гранульоматозною реакцією. Запалення включає реакції як специфічних, так і неспецифічних захисних систем. Реакція специфічної захисної системи - це відповідь специфічної імунної системи на появу антигена (у тому числі аутоантигена). Реакція неспецифічної захисної системи - це запалювальна реакція, опосередкована лейкоцитами, нездатними до імунологічної пам'яті, а саме гранулоцитами, макрофагами, нейтрофілами та еозинофілами. Приклади специфічного запалення - дифузне, фокальне, облітеративне, паренхіматозне, реактивне, специфічне, токсичне та травматичне запалення. Тварина захищається від захворювань, що опосередковують запалення, знижуючи потенціал запалювальної реакції на запалювального агента (агента, здатного спричинювати запалення, наприклад, метахолін, гістамін, алерген, лейкотриєн, 94922 12 соляний розчин, гіпервентиляція, фізичні вправи, двооксид сірки, аденозин, пропранолол, холодне повітря, брадикінін). В ідеалі потенціал запалювальної реакції знижується, бажано надовго, настільки, що організм більше не відчуває незручності та/або зміни функціонування від дії запалювального агента. Наприклад, захист може характеризуватися здатністю сполуки, введеної до організму, запобігти появі хвороби або усунути чи послабити симптоми, прояви, ознаки хвороби. Зокрема, захист може полягати у зміні запалювальної реакції таким чином, щоб усунути (тобто загальмувати, інгібувати або блокувати) занадто активну або шкідливу запалювальну реакцію. Також захист організму полягає у регулюванні опосередкованого клітинами імунітету та/або гуморального імунітету (наприклад, активності Т-клітин та/або IgE). Хворобою є будь-яке відхилення від нормального стану організму- як симптоми хвороби, так і стан, у якому відхилення (інфекція, мутація гену, генетичний дефект тощо) вже відбулося, але симптоми ще не проявилися. Терапевтичні антитіла У деяких варіантах винахід пропонує способи інгібування або пригнічення сигналізації TF/VIIa у ссавців, де потрібна знижена сигнальна активність TF/VIIa (наприклад, у випадку запалення або пухлини). Способи полягають у введенні ссавцю інгібітору TF/VIIa сигналінгу у достатній кількості для інгібування або пригнічення сигналізації TF/VIIa. В інших варіантах пропонуються способи лікування або послаблення симптомів хвороб, спричинених або пов'язаних із сигналізацією тканинного фактору/фактору VII у ссавців. Як зазначено вище, до таких хвороб належать, зокрема, захворювання, пов'язані з ангіогенезом, новоутвореннями, а також запалення. Способи полягають у введенні ссавцю інгібітору сигналізації тканинного фактору у достатній кількості для інгібування або елімінації захворювання, пов'язаного з ангіогенезом, новоутвореннями, а також запалення, або для запобігання його появи чи рецидиву. У варіантах здійснення винаходу застосовують інгібітор, який є антитілом до тканинного фактору та інгібує сигналізацію тканинного фактору, не заважаючи гемостазу (наприклад, коагуляції) у ссавців. Типовим антитілом є поліпептид, основу якого складає структурна ділянка гена імуноглобуліну або фрагменти, що специфічно розпізнають антиген й зв'язуються з ним. До відомих генів імуноглобуліну належать гені з константними ділянками капа, лямбда, альфа, гама, дельта, епсілон та мю, а також безліч генів імуноглобуліну з варіабельними сегментами. Легкі ланцюги класифікуються як капа або лямбда. Важкі ланцюги як альфа, гама, дельта, епсілон та мю, у свою чергу, визначають класи імуноглобулінів IgG, IgM, IgA, IgD та IgE відповідно. Анитген-зв'язуюча ділянка в антитілі найбільш критична в специфічності та афінності зв'язування. Антитіла та похідні від антитіл молекули, що зв'язують антигени, мають поліпептидні ланцюги, які демонструють міцне одно-, дво- або полівалентне зв'язування до даного епітопа чи епітопів (наприклад, TF або специфічний для TF пентидний 13 епітоп розпізнається MAb 10Н10). Якщо не зазначено інакше, антитіла або молекули, що зв'язують антигени, за винаходом можуть мати послідовності, одержані від будь-якого виду хребетних, верблюжих, пташиних чи риб. Їх можна одержувати будь-якою придатною технікою, наприклад, гібридомною, відтворенням рибосоми, відтворенням фагів, тасуванням бібліотек генів, напівсинтетичними або повністю синтетичними бібліотеками або комбінацією цих прийомів. Антитіла та молекули, що зв'язують антигени, за винаходом включають цілі антитіла, поліпептидні ланцюги, що зв'язують антигени, та інші сконструйовані антитіла (див., зокрема, Serafini, J Nucl Med. 34:533-6,1993). Антитіла або молекули, що зв'язують антигени, також включають фрагменти антитіл, які містять ділянки цілих антитіл, здатні зв'язувати відповідний антиген (наприклад, TF або специфічний для TF пептидний епітоп, що його розпізнає MAb 10Н10). До таких фрагментів антитіл належать (і) одновалентний фрагмент Fab, який складається з доменів VL, VH, CL та СН1; (іі) двохвалентний фрагмент F(ab')2 з двох фрагментів Fab, зшитих дисульфідним містком у зоні талії; (ііі) фрагмент Fd що складається з доменів VH та СНІ; (iv) фрагмент Fv що складається з доменів доменів VL та VH одного плеча антитіла, (ν) фрагмент dAb (Ward et al., Nature 341:544-546, 1989) що складається з домену VH; (vi) ізольована ділянка визначення комплементарності (CDR). Більш того, хоча двоє доменів фрагменту Fv - VL та VH - кодуються різними генами, іх можна з'єднувати рекомбінантними методами за допомогою синтетичного лінкера, який дозволяє зробити з них єдиний протеїновий ланцюг, де VL та VH домени паруються, утворюючи моновалентну молекулу (так звану одноланцюгову Fv (scFv) (Bird et al., Science 242:423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). Антитіла та молекули, що зв'язують антигени, за винаходом включають також один або кілька імуноглобулінових ланцюгів, які хімічно злиті з іншими білками або експресовані як злиті білки, будучи біспецифічними антитілами. Біспецифічні або біфункціональні антитіла, є штучними гібридними антитілами з двома різними парами важких та легких ланцюгів і двома різними сайтами зв'язування. До інших зв'язуючих антигени фрагментів антитіл за винаходом належать двовалентні scFv (дитіла), бівалентні антитіла scFv, де молекула антитіла розпізнає два різні епітопи, одинарні зв'язувальні домени (dAbs) та мінітіла. Різноманітні наведені антитіла можна одержувати ферментативною або хімічною модифікацією цілих антитіл, або синтезом наново за методиками рекомбінантної ДНК (наприклад, одноланцюговий Fv), або ідентифікацією з бібліотек фагових дисплеїв (див., зокрема, McCafferty et al., Nature 348:552-554,1990). Так, мінітіла можна одержувати відомими способами, наприклад, за Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001. Існує безліч способів одержання біс-пецифічних антитіл, у тому числі злиття гібридом або зшивання фрагментів Fab (Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); 94922 14 Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Одноланцюгові антитіла ідентифікуються за бібліотеками фагових дисплеїв або рибосом, чи перемішаних бібліотек генів. Такі бібліотеки можна будувати з синтетичних, напівсинтетичних або централізованих та імунокомпетентних джерел. Конкретним прикладом антитіл, що можуть застосовуватися у лікувальній практиці, може бути мишаче моноклональне антитіло 10Н10. Як буде показано нижче у прикладах, MAb 10H10 діє як інгібітор сигналізації тканинного фактору, не впливючи на гемостаз. Це антитіло докладно описане у патентах США №№ 5,223,427 та 6,001,978. Гібридома, що виробляє це антитіло, була депонована згідно з вимогами Будапештської угоди в Американській колекції типових культур (АТСС) (Манасас, штат Вірджинія) 27 березня 1987 р. під № НВ9383. На додаток до антитіла 10Н10, продуковані цією гібридомою, у способах лікування за винаходом можна використовувати будь-які антитіла, що мають таку само специфічність і таку само або кращу афінну спроможність, що й MAb 10Н10. Крім того, у способах лікування за винаходом можна використовувати будь-які молекули або фрагменти, що зв'язують антигени, які є похідними від MAb 10Н10, або антитіла, що мають таку само специфічність і таку само або кращу зв'язувальну спроможність, що й MAb 10H10. Деякі із способів згідно з винаходом мають на меті лікування людей. При лікуванні хворих людей бажано застосовувати пристосовані для використання на людях антитіла, людські антитіла або химерні антитіла, що містять людські послідовності (наприклад, у константному регіоні). У порівнянні з антитілами, отриманими з інших організмів (наприклад, мишей), таке антитіло, потрапляючи до організму людини, виявляє меншу антигенність або взагалі її не має. Химерне антитіло проти TF (наприклад, з такою само зв'язувальною спроможністю, як у MAb 10Н10) може складатися з композиту сегментів нелюдських антитіл проти TF з регіонами людських антитіл. Наприклад, химерний Η ланцюг може складатися з антиген-зв'язуючої ділянки варіабельного сегменту важкого ланцюга мишачого антитіла проти TF, наведеного тут, з частиною константної ділянки важкого ланцюга людського антитіла. Цей химерний важкий ланцюг може об'єднуватися з химерним L ланцюгом, що являє собою зв'язуючу антиген ділянку варіабельного сегменту легкого ланцюга мишачого антитіла проти TF, зшиту з частиною константної ділянки людського легкого ланцюга. Химерні антитіла проти TF за винаходом можна одержувати способами, наведеними в статях (див., наприклад, Robinson et al., міжнародна заявка PCT/US86/02269; Akira, et al., європейська заявка ЕР 184,187; Taniguchi, M., європейська заявка ЕР 171,496; Morrison et al., європейська заявка ЕР 173,494; Neuber-ger et al., міжнародна заявка WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., європейська заявка ЕР 125,023; Better et al., Science 240:1041-1043, 1988; Liu et al., PNAS 84:3239-3443, 1987; Liu et al., J. Immunol. 139:35213526,1987; Sun et al., PNAS 84:214-218, 1987; Nishimura et al., Cane. Res. 47:999-1005, 1987; 15 Wood et al., Nature 314:446-449, 1985; Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559, 1988). Химерні антитіла, що містять цілі варіабельні сегменти від нелюдських антитіл, можна надалі пристосовувати до використання у людини (гуманізувати), щоб зменшити антигенність антитіл у людському організмі. Для цього звичайно замінюють певні послідовності амінокислотних залишків у варіабельних сегментах Fv (каркасних або nonCDR ділянки) на еквівалентні послідовності або амінокислотні залишки з людських варіабельних сегментів Fv. Ці додатково заміщені послідовності амінокислотних залишків звичайно не беруть прямої участі у зв'язуванні антигенів. Частіше гуманізація антитіл, що не належать людині відбувається шляхом заміни лише CDR сегментів (зокрема, вищенаведених мишачих антитіл проти TF) на CDR сегменти людських антитіл. У деяких випадках після того замінюють певні додаткові залишки у людських каркасних сегментах на відповідні залишки з нелюдського донорського антитіла. Така додаткова заміна часто потрібна для поліпшення зв'язування антигену. Це пояснюється тим, що гуманізовані антитіла, у яких лише CDR сегменти пересаджені з нелюдського антитіла, не завжди мають таку само зв'язувальну активність, як нелюдські донорські антитіла. Отже, на додаток до CDR сегментів гуманізовані антитіла проти hTF за винаходом (наприклад, такі, що не поступаються за специфічністю зв'язування MAb 10Н10) можуть мати у людському каркасному сегменті деякі амінокислотні залишки, заміщені відповідними залишками від нелюдських донорських антитіл (наприклад, вищенаведеного мишачого антитіла). Способи одержання гуманізованих антитіл шляхом заміщення негіперваріабельних сегментів, включно з критеріями вибору каркасних залишків для заміщення, описані в статях (див., наприклад, Winter et al., заявка Великої Британії GB 2188638A (1987), патент США 5,225,539; Jones et al. Nature 321:552-525,1986; Verhoeyan et al., Science 239:1534, 1988; Beidler et al., J. Immunol. 141:40534060, 1988; та WO 94/10332). На додаток до химерних або гуманізованих антитіл до hPAR1, для лікування людей за винаходом можна використовувати чисто людські антитіла з такою само специфічністю зв'язування та порівнянною або кращою спорідненістю зв'язування, що й у мишачих антитіл типу MAb 10Н10. Людські антитіла проти TF можна одержувати будьяким відомим способом, наприклад, фаговим дисплеєм за допомогою бібліотеки антитіл, створеної з людських імуноглобулінових послідовностей (див., наприклад, Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol, 13:65-93 (1995), патенти США №№ 4,444,887 та 4,716,111; публікації РСТ WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 та WO 91/10741). Похідні антитіла або молекули, що зв'язують антигени, з такою само специфічністю зв'язування та рівною або кращою спорідненістю зв'язування, що й у MAb 10Н10, можна одержувати способами, відображеними в статях та представленими тут. Так, кандидатурні антитіла або імуноглобуліни, що 94922 16 виробляються проти антигена тканинного фактору, можна перевіряти, наприклад, на здатність конкурувати з MAb 10Н10 на зв'язування з поліпептидом чи пептидом тканинного фактору. Поліпептидні та поліенуклеотидні послідовності людського тканинного фактору описані в статях(наприклад, Scarpati et al., Biochemistry 26:5234-5238, 1987; Fisher et al., Thromb. Res. 48:89-99, 1987). Поліпептиди чи пептиди тканинного фактору, придатні для відбору, можна одержувати добревідомими або описаними тут способами. Крім того, у літературі описана низка специфічних антигенних пептидів, одержаних з людського тканинного фактору, наприклад, у патентах США №№ 5,223,427 та 6,001,978. У цих патентах також йдеться про характер зв'язування MAb 10H10 з низкою пептидів тканинного фактору. Наприклад, показано, що MAb 10H10 специфічно зв'язується з пептидом тканинного фактору з послідовністю SGTTNTVAAYNLTWKSTNFKTILEWEPKPV (SEQ ID NO:1) або ECDLTDEIVKDVKQTY (SEQ ID NO:2), але не до деяких інших пептидів, одержаних з людського тканинного фактору, таких, як, TKSGDWKSKCFYTTDTECDLTDEIVKDVKQTY (SEQ ID NO:3) або LARVFSYPAGNVESTGSAGEPLYENSPEFTPYLC (SEQ ID NO:4). Отже, кандидатурні антитіла (тобто антитіла, вироблені проти поліпептиду людського тканинного фактору) можна відбирати за здатністю блокувати зв'язування MAb 10Н10 з пептидом послідовністю SEQ ID NO:1 та/або SEQ ID NO:2. Можна також відбирати за картиною зв'язування, ідентичною або близькою до MAb 10Н10, з низкою пептидів людського тканинного фактору, як описано у патенті США № 5,223,427. Методики такого відбору добре відомі (див., наприклад, патенти США №№ 5,223,427 та 6,001,978) і також наводяться тут. На додаток до аналізів in vitro можна застосовувати методики ідентифікації in vivo антитіл проти TF, придатних для здійснення способу за винаходом. Наприклад, методика заміни варіабельного сегменту нелюдського антитіла на варіабельний сегмент людського антитіла in vivo при збереженні або поліпшенні характеристик зв'язування описана у заявці США № 10/778,726 (публікація № 20050008625). З метою вироблення людського антитіла з такою само специфічністю і такою само або кращою спорідненістю зв'язування, як у мишачого MAb 10Н10,у вищенаведена роботі пропонується базована на скерованій епітопами заміні варіабельних сегментів нелюдського антитіла на цілком людське антитіло. Одержане антитіло вцілому за структурою не схоже з вихідним нелюдським, але зв'язується з тими самими епітопами того ж самого антигена. Людські антитіла з такою само або кращою спорідненістю до специфічного епітопа, що й вихідне нелюдське антитіло (наприклад, мишаче MAb 10Н10) можна одержати від фірм, які виробляють людські антитіла. Наприклад, щоб виробити потрібне людське антитіло, KaloBios, Inc. (Маунтін-В'ю, Каліфорнія) використовує бібліотеку людських "акцепторних" антитіл. При цьому створюється бібліотека людських антитіл, напряму скерованих 17 або орієнтованих на той самий епітоп, що зв'язуються з тим епітопом, що й нелюдське антитіло, але з іншою спорідненістю. Далі антитіла в орієнтованій на епітопи бібліотеці відбираються за такою самою або кращу спорідненістю, що й вихідне нелюдське антитіло. Відібрані людські антитіла після того аналізують на афінність та ідентичнсть послідовності. На додаток до MAB 10Н10 та одержаних з нього антитіл або зв'язуючих антигени молекул отриманих з них, можна одержувати інші антитіла проти TF з властивостями, придатними для використання у способах лікування за винаходом, за допомогою загальновідомих методик та прийомів. Добре відомо, що реагентами, здатними до біоспецифічного зв'язування є антитіла, фрагменти антитіл, що зв'язуються з тканинним фактором, наприклад, на метастазних або запалювальних клітинах (наприклад, одноланцюгові антитіла, 1 фрагменти Fab , фрагменти F(ab)'2, a також scFv протеїни та аффітіла (Affibody, Teknikringen 30, 6 поверх, п/с 700 04, Стокгольм SE-10044, Швеція; див. патент США № 5,831,012, повністю включений сюди як посилальний матеріал). У залежності від призначення це також можуть бути рецептори та інші білки, здатні до специфічного зв'язування інших біомолекул. Гібридні антитіла та фрагменти гібридних антитіл включають цілі молекули антитіл з повними легкими та важкими ланцюгами або будь-які їх фрагменти, наприклад, Fab, Fab, F(ab')2, Fd, scFv, легкі ланцюги антитіл та важкі ланцюги антитіл. Придатні є також Химерні антитіла з варіабельними та константними сегментами від різних видів, що описані тут, також є придатними, (див., наприклад, заявку США № 20030022244). Спочатку обирають цільовий об'єкт, до якого можна створити антитіло. Прийоми створення моноклональних антитіл, спрямованих на цільові об'єкти, добре відомі. Серед них можна, зокрема, назвати ксено- або гуманізовані мишачі антитіла, гібридоми тощо. Цільовим об'єктом може бути будь-яка речовина, здатна виявляти антигенність; зазвичай це білки та полісахариди протеїдів, наприклад, рецептори, ферменти, фактори росту, пептиди тощо. Треба розуміти, що згідно з винаходом можуть використовуватися не лише природні антитіла, а й штучно створені, або ж фрагменти антитіл, спрямовані на завданий об'єкт. Антитілами (Аb), що їх можна піддавати зазначеним прийомам, можуть бути моноклональні та поліклональні антитіла, а також фрагменти антитіл, як от Fab, Fab', F(ab') 2, Fd, scFv, диатіла, легкі ланцюги антитіл, важкі ланцюги антитіл та/або фрагменти антитіл, одержані з бібліотек фагів або фагемідів. Первинне антитіло одержують з вихідних видів, зокрема, з послідовності нуклеїнових або амінокислот варіабельної ділянки легкого ланцюга, важкого ланцюга або обох їх, антитіла вихідного виду, що має специфічність щодо цільового антигена. Вихідним є будь-який вид, в якого можна генерувати антитіла або бібліотеки антитіл, тобто щури, миші, кролики, кури, мавпи, люди тощо. Прийоми вироблення та клонування моноклональних антитіл добре відомі фахівцям. Після одер 94922 18 жання потрібного антитіла варіабельні сегменти (VH та VL) поділяють на окремі компоненти (тобто каркас (FR) та CDR) з використанням будь-яких можливих визначень CDR (наприклад, чистий Kabat, чиста Chothia, комбіновані Kabat та Chothia й будь-які інші, відомі фахівцям). Після одержання треба обрати відповідний цільовий вид для одерження каркасу. В одному з варіантів співставляють кожний окремий каркасний сегмент з послідовності антитіл вихідного виду з варіативними послідовностями амінокислот або послідовностями генів від цільового виду. Програми пошуку співставлень відомі фахівцям - це BLAST та інші. Наприклад, якщо цільовим видом є людина, джерело таких послідовностей амінокислот або послідовностей генів (зародкова лінія або переформовані послідовності антитіл) можна знайти у будь-якій придатній базі даних, наприклад, Genbank, база даних протеїнів NCBI (http://ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), VBASE, базі даних генів людських антитіл (http://www.mrccpe.cam.ac.uk/imt-doc) та базі даних імуноглобулінів Kabat (http://www.immuno.bme.nwu.edu) або у трансльованих з них продуктах. Якщо співставлення робляться на основі послідовностей нуклеотидів, то треба проаналізувати гени з цієї субпослідовності, щоб відібрати ті, що мають найближчу гомологію амінокислот до антитіл вихідного виду. Вважається, що послідовності амінокислот або генів, гомологічно найближчі у порівнянні з іншими послідовностями у базі даних, є придатними для використання та маніпулювання відповідно до наведених тут процедур. Більш того, послідовності амінокислот або генів з менш близькою гомологією можна використовувати, коли вони кодують продукти, які після маніпуляцій та відбору згідно з винаходом демонструють специфічність до цільового антигена. У деяких варіантах придатними можна визнати більше ніж 50% гомологічного ряду. Звичайно, цільовим видом не обов'язково є людина. "Лікування" - це будь-які явні ознаки успішного втілення лікувальних заходів, або поліпшення стану, чи запобігання появи раку чи запалення, включаючи такі об'єктивні або суб'єктивні показники, як полегшення; ремісія; послаблення симптомів або поліпшення самопочуття хворого; уповільнення дегенерації або розпаду; або досягнення меншого виснаження кінцевою фазою дегенерації. Одужання або поліпшення симптомів може визначатися на підставі об'єктивних чи суб'єктивних параметрів, у тому числі результатів лікарського обстеження. Відповідно термін "лікування" стосується введення сполук за винаходом для запобігання або затримки, полегшення, припинення або інгібування розвитку симптомів або станів, пов'язаних із захворюванням очей. Термін "лікувальна ефект" охоплює послаблення, усунення або запобігання захворюванню, симптомам захворювання або бічним ефектам захворювання у хворого. "У сполученні з", "комбінована терапія" та "комбіновані продукти" у визначених варіантах стосується спільного введення хворому першого лікарського засобу та сполук за винаходом. При комбінованому введенні кожний компонент можна вводити одночасно або у будь-якій послідовності у 19 різні моменти часу. Отже, кожний компонент можна вводити нарізно, але досить близько у часі для досягнення потрібної лікувальної дії. "Лікування" раку, ракових метастазів або запалень згідно з винаходом включає профілактику появи симптомів у хворого, який має схильність до раку або запалення, але ще не має видимих проявів захворювання, інгібування симптомів раку або запалення (уповільнення або припинення їх зростання), полегшення симптомів або бічних ефектів раку чи запалення (у тому числі паліативне лікування), і полегшення симптомів раку чи запалення (спричинення регресії). "Лікування" - це будь-які явні ознаки успішного проведення лікувальних засобів, або поліпшення стану, або запобігання появи раку чи запалення, включаючи такі об'єктивні або суб'єктивні показники, як полегшення; ремісія; послаблення симптомів або поліпшення самопочуття хворого; уповільнення дегенерації або розпаду; або досягнення меншого виснаження кінцевою фазою дегенерації. Одужання або поліпшення симптомів може визначатися на підставі об'єктивних чи суб'єктивних параметрів, у тому числі результатів лікарського обстеження.. Відповідно термін "лікування" стосується введення сполук за винаходом для запобігання або затримки, полегшення, припинення або інгібування розвитку симптомів або станів, пов'язаних із очним захворюванням. Термін "лікувальна дія" охоплює послаблення, усунення або запобігання захворюванню, симптомам захворювання або бічним ефектам захворювання у хворого. "Одиниця дози" - фізично дискретна одиниця, що визначається як разова доза для конкретного хворого. Кожна одиниця містить завдану кількість діючої речовини (речовин), розраховану на завдання потрібної лікувальної дії у пов'язанні з відповідним фармацевтичним носієм. Призначення того чи іншого дозування визначається (а) характеристиками діючої речовини (речовин) та потрібним лікувальним ефектом, (b) обмеженнями, зумовленими характером такої діючої речовини (речовин). Терміни "ідентичний" або процент "ідентичності" двох або більше нуклеїнових кислот або послідовностей поліпептидів це однакові послідовності або ті містять певний процент однакових амінокислотних залишків або нуклеотидів (наприклад, біля 60% ідентичності, переважно 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%о, 97%о, 98%, 99%, або більше ідентичності у завданому сегменті (наприклад, послідовність нуклеотидів, яка кодує тканинний фактор або антитіло проти тканинного фактору за винаходом), при порівнянні та вишикуванні за максимальною відповідністю у вікні порівняння або призначеному сегменті) при порівнянні за алгоритмами порівняння послідовностей BLAST або BLAST 2.0 з наведеними нижче параметрами умовчання, або при ручному порівняльному аналізі та візуальному огляді (див. сайт NCBI). Такі послідовності вважаються "по суті ідентичними". Цей термін також стосується комплементарності дослідної послідовності. Термін також охоплює послідовності, що мають делеції та/або додатки, а також послідовності з заміщеннями. Як 94922 20 описано далі, преференційі алгоритми враховують розриви і т.п. Бажано, щоб ідентичності існували у сегменті, що має принаймні 25 амінокислот чи нуклеотидів завдовжки, краще ж 50-100 амінокислот чи нуклеотидів. При порівнянні послідовностей зазвичай одна послідовність слугує еталоном, з яким порівнюються дослідні послідовності. При застосуванні алгоритму порівняння послідовностей дослідні та еталонну послідовність вводять до комп'ютера, за потреби завдають координати послідовностей та визначають параметри програми алгоритму послідовностей. Переважно застосовують параметри програми за умовчанням або визначають альтернативні параметри. Далі алгоритм порівняння послідовностей визначає ступінь ідентичності дослідних послідовностей відносно еталонної послідовності, виходячи з параметрів програми. "Вікно порівняння" тут включає посилання на сегмент будь-якої кількості безперервних позицій, обраний з-поміж 20-600, звичайно 50-200, переважно 100-150 позицій, у якому послідовність можна порівнювати з еталонною послідовністю з такої само кількості безперервних позицій після оптимального порівняння структур двох послідовностей. Прийоми групування структур послідовностей для порівняння добре відомі фахівцям. Оптимальне групування послідовностей для порівняння можна здійснити, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math, 2: 482, 1981), алгоритму гомологічного групування (Needleman and Wunsch, J. Моl. Biol, 48:443, 1970, пошуком подібності за методикою Pearson and Lipman, Proc. Nafl. Acad. Sci. USA, 85:2444, 1988), машинними виконанням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA та TFASTA у пакеті Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science "Dr.Madison" WI); або ручним порівнянням структур та візуальним оглядом (див., наприклад, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology. 1995 supplement). Прикладом алгоритмів, яким надається перевага в алгоритмами для визначенні ступеню ідентичності та подібності послідовностей є BLAST та BLAST 2.0, описані у Altschul et al., Nuc. Acids Res, 25:3389-3402, 1977, та Altschul et al., J. Моl. Biol, 215:403-410, 1990, відповідно. BLAST та BLAST 2.0 з описаними тут параметрами використовуються для визначення ступеню ідентичності нуклеїнових кислот та протеїнів за винаходом. Програмне забезпечення для виконання аналізу BLAST є доступне від Національного центру біотехнологічної інформації (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). За цим алгоритмом спочатку знаходять пари з високою подібністю (HSP), визначаючи короткі слова довжини W у послідовності запиту, які або збігаються, або відповідають якійсь позитивній пороговій величині Τ при порівнянні структур із словом рівної довжини у базі даних послідовностей. Τ називають порогом подібності слова в оточенні (Altschul et al., вище). Ці початкові порогові влучення слугують зародками для подальшого пошуку довших HSP, що їх містять. Влучення поширюються в обох напрямках уздовж кожної послідовності до тих пір, поки кумулятивний рахунок влучень збільшується. 21 Розраховують кумулятивну множину, використовуючи для нуклеотидних послідовностей параметри Μ (множина відповідностей для пари збіжних залишків; завжди > 0) та N (множина невідповідностей для пари незбіжних залишків; завжди 80%. Можна припустити, що ефективність бібліотеки відображень на рІХ вища, ніж у рІll формату бібліотеки, і що вона є ідеальною для пенінгу до найрізноманітніших цільових антигенів (Gao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 1261212616,2001). Специфічне зв'язування між антитілом або іншим зв'язувальним агентом та антигеном перед-6 бачає спорідненість принаймні біля 10 Μ. Пере-7 важно спорідненість становить принаймні біля 10 -8 -9 -10 -11 -12 М, краще 10 Μ - 10 Μ, 10 Μ, 10 Μ або 10 М. Термін "епітоп" означає антигенну детермінанту, здатну зв'язуватися з антитілом. Епітоп звичайно складається з хімічно активних поверхневих груп або молекул, наприклад, амінокислот або бічних ланцюгів сахарів, й має специфічну трьохвимірну структуру та специфічні характеристики заряду. Конформаційні та неконформаційні епіто 37 пи розрізняються тим, що перші, але не останні, втрачають зв'язувальну здатність у присутності денатуруючих розчинників. Імунологічний аналіз зв'язування для виявлення сигналінгу тканинного фактору та його модуляторів Винахід пропонує способи виявлення сигналінгу тканинного фактору та ідентифікації модуляторів сигналінгу тканинного фактору. Як пояснюється далі, деякі методи скеровані на виявлення модуляторів сигналізації тканинного фактору у клітинній системі аналізу. В інших варіантах модулятори сигналізації тканинного фактору ідентифікуються у безклітинній системі. У деяких варіантах дослідні сполуки аналізуються для виявлення модуляторів тканинного фактору, які інгібують або пригнічують медійовану TF/VIIa сигнальну активність, але не впливають на гемостаз in vivo. Такі модулятори (наприклад, низькомолекулярні органічні сполуки) можна ідентифікувати за допомогою відомих сполук, що мають визначені властивості (наприклад, MAb 10Н10) у різнорідних конкурентних формах аналізу, що наведені тут. Так, деякі методики відбору за винаходом спрямовані на виявлення сполук, які інгібують сигналізацію TF/VIIa, але не блокують коагуляцію. Ці методики полягають у вимірюванні у присутності дослідних сполук або без них зв'язування між (і) антитілом або молекулою, що зв'язує антиген, які мають специфічність зв'язування на рівні MAb 10Н10, та (іі) поліпептидом тканинного фактору, після чого виявляють інгібування зв'язування у присутності дослідної речовини у порівнянні з відсутністю дослідної речовини. У деяких методиках використовується мишаче MAb 10Н10, вироблене гібридомою під № АТСС НВ93 83. У деяких методиках відбору застосовуються дослідні сполуки, що являють собою переважно низькомолекулярні органічні сполуки, наприклад, хімічні сполуки з молекулярною масою не вище 5000, бажано, не вище 2,500, 1,000 або 500. Ці методики можна здійснити будь-яким із наведених тут способів та форматів аналізу. На додаток до визначення здатності конкурентного зв'язування з тканинним фактором в присутності MAb 10Н10, вимірюється також активність у модулюванні сигналізації тканинного фактору (наприклад, інгібування сигнальної активності TF/VIIa без суттєвого ефекту на гемостазі). Сполуки випробують на інгібування будь-якої сигнальної активності, медійованої TF/VlIa, як описано тут (наприклад, фосфорилювання МАР кінази або комплексоутворення з сигналізацією через активований протеазо-активовний 2). Методики вимірювання медійованої TF/VlIa сигнальної активності добре відомі. Як зазначено далі у прикладі 8, медійовану TF/VIIa сигнальну активність можна визначити за кількісним фосфорилюванням МАР кінази, наприклад, дослідженням рівня фосфорилювання вестернблотінгу МАР кінази (наприклад, ERK кінази) у клітинах HUVEC (ендотеліальниї клітинах пупкової вени людини) або СНО (яєчниках китайського хом'яка), стимульованих факторами Vlla та X. Ці аналізи можуть застосовуватися у методиках відбору, що описані тут, для ідентифікації нових мо 94922 38 дуляторних сполук (наприклад, інгібіторів) сигналізації тканинного фактору. Вони також можуть використовуватися у методах лікування за винаходом для контролю ефекту прийнятого інгібітору сигналінгу тканинного фактору. Сполука вважається інгібітором сигналізації TF, якщо здатна інгібувати сигнальну активність TF принаймні на 50%, принаймні на 75%, принаймні на 90% або принаймні на 95% від рівня сигналізації TF у відсутності сполуки. Кількісне інгібування сигналізації TF можна визначити будь-яким відомим способом (наприклад, Ahamed et al., Blood 105:2384-91, 2005) або за наведеною тут методикою, наприклад, зниженням рівня фосфорилювання ERK у клітинах HUVEC протягом 6 діб за умов, наведених у прикладі 8 далі. За будь-яким з відомих або описаних тут методів аналізу ідентифіковані за скрінігом сполуки (або інгібітори у методиках лікування за винаходом) можуть додатково вивчатися з метою довести, що вони суттєво не впливають на медійований тканинним фактором гемостаз (наприклад, коагуляцію). Наприклад, активність медійованої TF коагуляції можна виміряти вестерн-блотінгом за кількісним фактором генерації Ха у клітинах НаСаТ, як демонструється у прикладах далі. Ці методики аналізу придатні для сполук, відібраних скрінігом за винаходом, або інгібіторів у методиках за винаходом. Сполука не впливає або не блокує активацію (тобто не має суттєвого ефекту) медійованого TF гемостазу (наприклад, коагуляції), якщо у її присутності активність гемостазу скорочується не більш ніж на 5%, не більш ніж на 10%, не більш ніж на 15%, або не більш ніж на 25% (наприклад, активність коагуляції, виміряна генерацією Ха за описаних умов) у порівнянні з величиною за її відсутності. У деяких варіантах потенціальну блокувальну активність сполуки щодо коагуляції можна визначити, вимірюючи дію сполуки на зв'язування тканинного фактору антитілом, яке блокує медійовану тканинним фактором коагуляцію. Таким є моноклональне антитіло 5G9, яке виробляє гібридома АТСС під № НВ9382. Інгібувальна дія цього антитіла на коагуляцію та відповідні аналізи докладно описані у патент і США № 5,223,427. Відсутність помітної дії сполуки на зв'язування MAb 5G5 з тканинним фактором (наприклад, скорочення на принаймні 20%, 30%, 40%, 50%, 75% чи більше) вказує на те, що дана сполука навряд чи блокує медійовану тканинним фактором коагуляцію. Сигналінг тканинного фактору можна також визначити якісно або кількісно за будь-яким відомим методом імунологічного аналізу зв'язування (наприклад, патенти США №№ 4,366,241; 4,376,110; 4,517,288 та 4,837,168). Антитіла, придатні для методів імунологічного аналізу, можуть діяти як інгібітори сигналізації тканинного фактору не впливаючи на гемостаз ссавців. В імунологічній практиці антитіла використовують при діагностиці або лікуванні хвороб, спричинених зміненою сигналізацією тканинного фактору - фактору Vlla у ссавців. Наприклад, антитіло MAB 10Н10 діє як інгібітор сигналізації тканинного фактору , не впливаючи на гемостаз у ссавців, і є придатним для імунологічного аналізу зв'язування за винахо 39 дом. Огляд загального імуноаналізу див. Methods in Cell Biology: Antibodies in Cell Biology, volume 37 (Asai, ed. 1993); Basic and Clinical Immunology (Stites & Terr, eds., 7th ed. 1991). Імунологічні аналізи зв'язування (або імуноаналізи) використовують антитіло, яке специфічно зв'язується з відповідним протеїном чи антигеном (у даному разі тканинним фактором або його антигенною субпослідовністю). Антитіло (наприклад, анти-тканинний фактор) можна одержувати будь-яким відомим або описаним тут способом. В імуноаналізі часто застосовуються маркери, які специфічно зв'язують та мітять комплекс, утворений антитілом та антигеном. Маркерним агентом може бути один з компонентів комплексу антиген/антитіло. Отже, маркером може бути мічений тканинний фактор або ж третє утворення, наприклад, вторинне антитіло, яке специфічно зв'язує комплекс антитіло/тканинний фактор (вторинне антитіло звичайно буває специфічним до антитіл того виду, з якого походить перше антитіло). Також маркерами можуть бути інші протеїни, здатні специфічно зв'язувати константні сегменти імуноглобуліну, як то протеїн А або протеїн G. Ці протеїни демонструють сильну анти-імуногенну реактивність щодо константних сегментів імуноглобуліну різних видів (наприклад, Kronval et al., J. Immunol. 111: 1401-1406, 1973; Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589-2542, 1985). Маркер можна модифікувати часткою, яка піддається розпізнаванню, наприклад, біотином, до якого може специфічно зв'язуватися інша молекула, наприклад, стрептавідин. Фахівцям відома безліч таких часток, що піддаються розпізнаванню. В ході аналізу після кожної комбінації реагентів можуть бути потрібними інкубація та/або промивка. Інкубація може займати від 5 секунд до кількох годин, факультативно від 5 хвилин до 24 годин. Втім, тривалість інкубації залежить від формату аналізу, антигена, об'єму розчину, концентрацій тощо. Звичайно аналізи виконують при кімнатній температурі, хоча діапазон температур може бути широким, від 10°С до 40°С. Неконкурентні форми аналізу: Імуноаналіз для виявлення сигналінгу тканинного фактору у зразках може бути конкурентним або неконкурентним. При неконкурентному аналізі прямо вимірюють кількість антигена. У методиці "сендвіч" антитіла проти тканинного фактору пришивають до твердого субстрата, на якому вони будуть імобілізованими. Далі ці імобілізовані антитіла захоплюють тканинний фактор, наявний у зразку. Потім імобілізований тканинний фактор зв'язується маркером, наприклад, вторинним антитілом до тканинного фактору, яке несе мітку. Або ж друге антитіло може не мати мітки, але воно, у свою чергу, зв'язується третім антитілом, специфічним до антитіл того виду, до якого належить друге антитіло. Друге або третє антитіло звичайно є модифікованою частиною, яка піддається розпізнаванню, наприклад, біотином, до якої може специфічно зв'язуватися інша молекула, наприклад, стрептавідин, утворюючи частину, що піддається розпізнаванню. Конкурентні форми аналізу: При конкурентному аналізі кількість сигналінгу тканинного фактору, 94922 40 наявного у зразку, вимірюється непрямим шляхом - визначенням кількості відомого, доданого (екзогенного) тканинного фактору, витісненого з антитіла до тканинного фактору невідомим тканинним фактором, наявним у зразку. Наприклад, до зразка додають відому кількість тканинного фактору, після чого зразок обробляють антитілом, що специфічно зв'язує тканинний фактор. Кількість екзогенного тканинного фактору, зв'язаного з антитілом, обернено пропорційна до концентрації тканинного фактору, наявного у зразку. У найкращому варіанті антитіло імобілізується на твердому субстраті. Кількість тканинного фактору, зв'язаного з антитілом, визначають або вимірюванням обсягу комплексу тканинний фактор/антитіло, або вимірюванням кількості протеїну, що лишився незв'язаним. Кількість тканинного фактору можна визначити за допомогою міченої молекули тканинного фактору. Іншим варіантом конкурентного аналізу є аналіз інгібування гаптену. Відомий тканинний фактор імобілізують на твердому субстраті. До зразку додають відому кількість антитіла до тканинного фактору, після чого зразок контактує з імобілізованим тканинним фактором. Кількість антитіла до тканинного фактору, зв'язаного з відомим імобілізованим тканинним фактором, обернено пропорційна до концентрації тканинного фактору, наявного у зразку. Знов-таки кількість імобілізованого антитіла визначають або за імобілізованою часткою антитіла, або за його часткою, що залишається у розчині. Визначення буває прямим, якщо антитіло мічене, або непрямим, додаючи мічену частину, яка специфічно зв'язується з антитілом, як описано вище. Визначення перехресної реактивності: Імуноаналіз у конкурентній формі часто використовують для визначення перехресної реактивності. Наприклад, тканинний фактор може бути іммобілізованим на твердому субстраті. До зразку додають протеїни (наприклад, тканинний фактор та гомологи), які конкурують за зв'язування антисироватки з імобілізованим антигеном. Здатність доданих протеїнів змагатися за зв'язування антисироватки з імобілізованим протеїном порівнюють із здатністю тканинного фактору змагатися з самим собою. Стандартним шляхом розраховують відсоток перехресної реактивності для зазначених протеїнів. Антисироватки з перехресною реактивністю менше 10% відносно кожного з доданих протеїнів відбирають та накопичують. Антитіла, що мають перехресну реактивність, відокремлюють від накопичених антисироваток імуноабсорбцією доданими сторонніми протеїнами, наприклад, далекими гомологами. Імуноадсорбовані та накопичені антисироватки далі використовують в імуноаналізі із конкурентним зв'язуванням, як описано вище, для порівняння з другим протеїном, можливо, аллелем або поліморфним варіантом тканинного фактору - імуногенним протеїном. Щоб виконати таке порівняння, кожний з двох протеїнів досліджують у широкому діапазоні концентрацій та визначають кількість кожного протеїну, потрібну для інгібування 50% зв'язування антисироватки з імобілізова 41 ним протеїном. Якщо кількість другого протеїну, потрібна для інгібування 50% зв'язування, перевищує кількість тканинного фактору, потрібну для інгібування 50% зв'язування, менше ніж у 10 разів, то вважається, що другий протеїн специфічно зв'язує поліклональні антитіла, вироблені до тканинного фактору. Інші форми аналізу: Вестерн-блотінг (імуноблотінг) використовується для знаходження та кількісного визначення тканинного фактору у зразку. Наявні у зразку протеїни розділяють гельелектрофорезом за молекулярною масою, переносять на твердий субстрат (фільтр з нітроцелюлози, нейлону або дериватизованого нейлону) та інкубують зразок з антитілами, які специфічно зв'язують тканинний фактор. Антитіло до тканинного фактору специфічно зв'язує тканинний фактор на твердому субстраті. Ці антитіла можна прямо мітити або виявляти потім міченими антитілами (наприклад, міченими антімишиними овечими антитілами), які специфічно зв'язують антитіла проти тканинного фактору. Ще один форма аналізу - це ліпосомний імуноаналіз (LIA), де використовуються ліпосоми, які зв'язують специфічні молекули (наприклад, антитіла) й виділяють замкнені у них реагенти або маркери. Потім виділені речовини виявляють стандартними прийомами (Monroe et al.,Amer. Clin. Prod. Rev. 5: 34-41, 1986). Зменшення неспецифічного зв'язування: Фахівцеві зрозуміло, що часто буває потрібно звести до мінімуму неспецифічне зв'язування при імуноаналізі. Зокрема, коли йдеться про антиген або антитіло, імобілізовані на твердому субстраті, треба мінімізувати неспецифічне зв'язування із субстратом. Засоби скорочення такого неспецифічного зв'язування добре відомі. Як правило, поверхню субстрату покривають протеїновою речовиною, переважно з альбуміну бичачої сироватки (BSA), знежиреного молочного порошку або желатину. Найчастіше з молочного порошку. Мітки: Вид мітки або групи, що піддається розпізнанню, при аналізі за винаходом не має суттєвого значення, якщо вона не впливає на специфічне зв'язування застосованого антитіла. Групою, що піддається розпізнанню, може бути будь-який матеріал, який має фізичні або хімічні властивості за якими його можна детектувати. Такі мітки широко застосовуються в імуноаналізі, і майже всі вони можуть використовуватися у цьому винаході. Це може бути будь-яка сполука, яку можна визначити спектроскопічними, фотохімічними, біохімічними, імунохімічними, електричними, оптичними або хімічними засобами. У цьому винаході можуть використовуватися магнітні гранули (наприклад, DYNABEADS™), флуоресцентні фарбники (наприклад, флуоресцеїн ізотіоціанат, техаський черво3 ний, родамін тощо), радіоізотопи (наприклад, Н, 125 35 14 32 І, S, C або Р), ферменти (наприклад, пероксидаза хрону, лужна фосфатаза та інші, прийняті в аналізах ELISA - твердофазному імуноферментному аналізі), люмінесцентні та колориметричні мітки, як от колоїдне золото, гранули з кольорового скла або пластику (наприклад, полістиролу, поліпропілену, латексу тощо). 94922 42 Мітку можна зв'язувати прямо чи непрямо з потрібним компонентом аналізу відомими прийомами. Як зазначено вище, мітки бувають різноманітні, їх вибір залежить від потрібної чутливості, зручності кон'югації із сполукою, стабільності, наявних приладів та можливостей видалення залишків після аналізу. Нерадіоактивні мітки часто приєднують непрямим шляхом. Як правило, молекула ліганду (наприклад, біотину) зв'язується з іншою молекулою ковалентно. Далі ліганд зв'язується до іншої молекули (наприклад, стрептавідину), яка або сама є помітна, або ковалентно зв'язана з сигнальною системою - помітним ферментом, флуоресцентною або люмінесцентною сполукою. Ліганди та їх цілі можна будь-яким чином комбінувати з антитілами, що розпізнають тканинний фактор, або вторинними антитілами, що розпізнають антитіла до тканинного фактору. Молекули можна також прямо кон'югувати з сигнальними сполуками, наприклад, ферментом чи флуорофором. Мітками можуть слугувати такі ферменти, як гідролази, особливо фосфатази, естерази та глікозидази, а також оксидази, особливо пероксидази. До флуоресцентних сполук належать флуоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, дансил, умбеліферон тощо. З хемілюмінісцентних сполук можна назвати люциферин та 2,3-дігідрофталазиндіони, наприклад, люмінол. Огляд різних міткових або сигнальних систем див. патент США № 4,391,904. Засоби знаходження міток добре відомі фахівцям. Наприклад, радіоактивні мітки виявляють лічильником сцинтилляцій або на фотоплівці методом радіоавтографії. Флуоресцентна мітка виявляється збудженням люмінофору на відповідній хвилі та визначенням одержаної флуоресценції. Флуоресценцію визначають візуально, за допомогою електронних детекторів - приладів із зарядовим зв'язком (CCD), фотопомножувачів тощо. Ферментні мітки можна виявити за допомогою відповідних субстратів для ферменту та знаходження відповідного продукту реакції. Нарешті, прості колориметричні мітки визначаються просто за кольором, пов'язаним з міткою. Так, у різних аналізах із щупами кон'юговане золото виглядає рожевим, а кон'юговані гранули показують власний колір. При деяких аналізах мітки взагалі не потрібні. Наприклад, реакція аглютинації виявляє цільові антитіла. У цій формі мітити компоненти не треба, бо наявність цільового антитіла виявляється візуально. Хімічний склад малих молекул "Мала молекула" або "мале хімічне утворення " - це будь-яке хімічне або інше утворення, здатне впливати на біологічні процеси, зокрема, здатне діяти як інгібітор сигналізації тканинного фактору, не впливаючи на гемостаз ссавця, корисне при діагностиці або лікуванні хвороби у ссавця. Малі молекули можуть містити будь-яку кількість добре відомих та тих, що використовують лікувальних агентів або бути синтезовані з бібліотеки таких молекул з метою скрінінгу для певної біологічної функції або функцій. Малі молекули відрізняються 43 від макромолекул за розміром. У цьому винаході малі молекули мають молекулярну масу менше 5,000 дальтонів (Da), переважно менше біля 2,500 Da, зокрема, менше біля 1,000 Da, оптимально менше біля 500 Da. У цьому винаході лікування хвороб ссавців, пов'язаних з сигналізацією тканинного фактору/фактору VІla, мала органічна сполука, пептидоміметика або міметика антитіла може бути міметиком антитіла-інгібітору, а саме MAb 10H10. Малі молекули - це органічні сполуки без імтації, пептидоміметики, міметики антитіл та їх кон'югати. Термін "органічна сполука " або "мале хімічне утворення " охоплює будь-які сполуки на основі вуглецю, крім макромолекул, як от нуклеїнові кислоти та поліпептиди. Крім вуглецю, органічні сполуки можуть містити кальцій, хлор, фтор, мідь, водень, залізо, калій, азот, кисень, сірку та інші елементи. Органічна сполука може бути ароматичною або аліфатичною. Як приклади органічних сполук можна навести ацетони, спирти, аніліни, вуглеводи, моносахариди, олігосахариди, полісахариди, амінокислоти, нуклеозиди, нуклеотиди, ліпіди, ретиноїди, стероїди, протеоглікани, кетони, альдегіди, насичені, ненасичені та поліненасичені жири, олії та воски, алкени, ефіри, етери, тіоли, сульфіди, циклічні сполуки, гетероциклічні сполуки, імідазоли та феноли. До органічних сполук тут включені також нітровані та галогеновані (наприклад, хлоровані) органічні сполуки. Способи одержання пептидоміметиків наведені далі. Колекції малих молекул та малі молекули, ідентифіковані за винаходом, характеризуються такими прийомами, як прискорювальна мас-спектрометрія (AMS; див. Turteltaub et al., Curr Pharm Des 6(10): 9911007, 2000, Bioanalytical applications of accelerator mass spectrometry for pharmaceutical research; Enjalbal et al, Mass Spectrom Rev 19(3): 139-61, 2000, Mass spectrometry in combinatorial chemistry.) Переважно малі молекули або малі хімічні утворення легкіші та дешевші в одержанні та виготовленні. Здебільшого малі молекули стабільні у різних умовах зберігання. їх можна тісно пов'язувати з макромолекулами, утворюючи біологічно активні молекули з поліпшеними фармацевтичними властивостями, такими як час напівжиття в організмі, розподіл в організмі, метаболізм, модифікація, екскреція, секреція, видалення та стабільність поліпшують бажану біологічну активність. Поліпшені фармацевтичні властивості включають зміни у токсикологічних показниках та ефективності хімічного утворення. Високоефективні аналізи для модуляторів сигналінгу тканинного фактору Як зазначено вище, винахід пропонує спосіб ідентифікації модуляторів, наприклад інгібіторів або активаторів сигналінгу тканинного фактору, де інгібітор не впливає на гемостаз (наприклад, у ссавців). Дослідні сполуки за цими способами можуть бути будь-якою малою органічною молекулою, або біологічним утворенням, як от протеїн, наприклад, антитіло або пептид, сахар, мала хімічна молекула, нуклеїнова кислота, наприклад, антисенсорний олігонуклеотид, ДНКі, рібозим або ліпід. Також модулятори можуть бути генетично 94922 44 зміненими варіантами тканинного фактору. Як правило, дослідні сполуки - це малі органічні молекули, пептиди, антитіла, ліпіди та аналоги ліпідів. По суті будь-яка хімічна сполука може бути потенційним модулятором або лігандом у аналізах за винаходом, хоча переважно йдеться про сполуки, розчинні у водних або органічних (особливо на основі ДМСО) розчинниках. Аналізи розраховані на скрінінг великих хімічних бібліотек шляхом автоматизації етапів аналізу та відбору сполук з будь-яких джерел для аналізу, який проходить паралельно (наприклад, у форматі мікротитрування на титраційних мікропланшетах у роботизованих аналітичних установках). Серед постачальників хімічних сполук можна назвати Sigma (СентЛуіс, штат Місурі), Aldrich (Сент-Луіс, штат Місурі), Sigma-Aldrich (Сент-Луіс, штат Місурі), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Бюхс, Швейцарія) та інших. У переважному варіанті високоефективні методи скрінінгу передбачають створення комбінаторних бібліотек малих органічних молекул або пептидів, що містять велику кількість потенційних лікарських сполук (потенційних модуляторів або лігандів). Такі "комбінаторні хімічні бібліотеки" або "бібліотеки лігандів" просіюють один або кілька разів, як описано тут, для виявлення тих елементів бібліотек(конкретних хімічних видів або підкласів), які демонструють потрібну характеристичну активність. Відібрані речовини слугують "лідерними сполуками" або можуть розглядатися як потенційні чи актуальні ліки. Комбінаторна хімічна бібліотека - це зібрання різних хімічних сполук, одержаних хімічним або біологічним синтезом, при сполученні багатьох хімічних "будівельних блоків", наприклад, реагентів. Наприклад, лінійна комбінаторна хімічна бібліотека, як от бібліотека поліпептидів, створюється комбінуванням набору хімічних будівельних блоків (амінокислот) в усіх можливих сполученнях для даної довжини сполуки (тобто числа амінокислот у поліпептидній сполуці). Таким комбінуванням хімічних будівельних блоків можна синтезувати мільйони хімічних сполук. Побудова та скрінінг комбінаторної хімічної бібліотеки добре знайомі фахівцям. До таких комбінаторних хімічних бібліотек належать, зокрема, бібліотеки пептидів (наприклад, патент США 5,010,175, Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493, 1991 та Houghton et al., Nature 354: 84-88, 1991). Можна використовувати й інші хімікати для створення бібліотеки, зокрема пептоїди (наприклад, публікація РСТ № WO 91/19735), кодованих пептидів (наприклад, публікація РСТ № WO 93/20242), довільних біоолігомерів (наприклад, публікація РСТ № WO 92/00091), бензодіазепинів (наприклад, патент США № 5,288,514), діверсомерів, як гідантоїни, бензодіазепіни та діпептиди (Hobbs et al.,Proc. Nat. Acad. Set USA 90: 6909-6913,1993), вінілоподібних поліпептидів (Hagihara et al.,J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568, 1992), не-пептидних пептидоміметиків з глюкозним каркасом (Hirschmann et al.,J. Amer. Chem. Soc. 114: 92179218, 1992), аналогічного органічного синтезу біб 45 ліотек малих сполук (Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661, 1994), олігокарбаматів (Cho et al., Science 261: 1303, 1993) та/або пептиділфосфонатів (Campbell et al.,J. Org. Chem. 59: 658, 1994), бібліотеки нуклеїнових кислот (Ausubel, Berger and Sambrook, вище), бібліотеки нуклеїнових кислот пептидів (наприклад, патент США 5,539,083), бібліотеки антитіл (наприклад, Vaughn et al., Nature Biotechnology, 14: 309-314, 1996 та PCT/US96/10287), бібліотеки вуглеводів (наприклад, Liang et al., Science 274: 1520-1522,1996 та патент США 5,593,853), бібліотеки малих органічних молекул (наприклад, бензодіазепинів, Baum C&EN, Jan 18, page 33 (1993); ізопреноїдів, патент США 5,569,588; тіазолідинонів та метатіазанонів, патент США 5,549,974; піролідинів, патенти США 5,525,735 та 5,519,134; морфолінових сполук, патент США 5,506,337; бензодіазепинів, 5,288,514 та подібні). Апаратура для побудови комбінаторних бібліотек доступна для комерційного придбання (наприклад, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Луісвілл, штат Кентукі; Symphony, Рамм, Воберн, штат Масачусетс, 433А; Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія; 9050 Plus, Millipore, Бедфорд, штат Масачусетс). Крім того, за плату існує доступ до багатьох готових комбінаторних бібліотек (наприклад, ComGenex, Princeton, NJ.; Asinex, Moscow, Ru; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, RU: 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD та ін.). Сполуки-кандидати є частиною стратегії створення ліків проти новоутворень або запалень, де сполука інгібує сигналізацію тканинного фактору, не підвищуючи ризик кровотечі. Кандидатом вважається сполука, що зв'язує сигнальний тканинний фактор. До обсягу винаходу також входять скрінінгові аналізи для виявлення кандидатів або дослідних сполук, що зв'язують тканинний фактор або модулюють активність протеїнів, поліпептидів або біологічно активних частин тканинного фактору. Дослідні сполуки можна одержати одним з численних відомих підходів в створенні комбінаторних бібліотек, серед яких: біологічні бібліотеки; бібліотеки паралельних гомогенних чи твердофазних аналізів з об'ємною адресацією; синтетичні бібліотеки, що потребують зворотної деконволюції; бібліотеки за принципом "одна гранула-одна сполука" та синтетичні бібліотеки з відбором за допомогою афінної хроматографії. Підхід біологічної може бути використаний, наприклад, до бібліотеки пептидів, тоді як чотири інші підходи придатні для бібліотек пептидів, непептид-них олігомерів або малих молекул (Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997). Про методи синтезу молекулярних бібліотек йдеться, наприклад, у: De Witt et al., Proc. Nail. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37: 2678, 1994; Cho et al., Science 261: 1303, 1993; Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl 33: 2059, 1994; Carell et al.,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994; and Gallop et al.,J. Med. Chem. 37: 1233, 1994. У деяких способах дослідними сполуками є активуючі варіанти тканинного фактору. 94922 46 Бібліотеки сполук можна представляти у розчинах (наприклад, Houghten, Bio/Techniques 13: 412-421, 1992), гранулах (Lam, Nature 354: 82-84, 1991), уламках (Fodor, Nature 364: 555-556, 1993), бактеріях (патент США № 5,223,409), спорах (патенти США №№ 5,571,698, 5,403,484 та 5,223,409), плазмідах (Cull et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 89: 1865-1869, 1992) або на фагах (Scott et al., Science 249: 386-390, 1990; Devlin, Science 249: 404-406, 1990; Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382, 1990 та Felici, J. Mol. Biol. 222: 301-310,1991). Здатність дослідної сполуки інгібувати сигнальну активність тканинного фактору або його біологічно активної частини визначають, наприклад, контролюючи інгібування сигналізації тканинного фактору у відсутності коагуляційної активності у присутності дослідної сполуки. Здатність дослідної сполуки модулювати сигнальну активність тканинного фактору або його біологічно активної частини також визначають за здатністю тканинного фактору зв'язувати протеїндісульфідізомеразу. Аналізи на зв'язування проводять у клітині або поза клітиною. Здатність сполуки інгібувати сигналізацію тканинного фактору при лікуванні новоутворень або запалень, не підвищуючи ризик кровотечі, визначають одним із відомих або описаних тут способів шляхом визначення прямого зв'язування. В одному з варіантів здатність сполуки інгібувати сигналізацію тканинного фактору при лікуванні новоутворень або запалень, не підвищуючи ризик кровотечі, визначають, спостерігаючи за сигналізацію тканинного фактору у кератиноцитах або ендотеліальних клітинах. Виявлення сигналізації тканинного фактору може полягати у виявленні експресії рекомбінатного тканинного фактору, який кодує детекторний маркер, такий як послідовність FLAG або люциферазу. Такий аналіз слугує доповненням до аналізу прямого зв'язування. У цілому такі аналізи використовуються для визначення здатності дослідної сполуки інгібувати сигналізацію тканинного фактору. Як правило, здатність дослідної сполуки зв'язувати тканинний фактор, впливати на сигналізацію тканинного фактору порівнюють з контрольним зразком, зв'язування якого визначають у відсутності дослідної сполуки. У деяких випадках користуються завданою еталонною величиною. Така величина визначається для контрольного зразку, і тоді відхилення у дослідній сполуці від неї свідчать про те, що сполука зв'язує цільову молекулу (наприклад, тканинний фактор) або модулює спричинений тканинним фактором сигналінг PAR2 у присутності протеїндисульфидізомерази. Еталонна величина також відображає обсяг зв'язування, досягнутий еталоном (наприклад, спорідненість антитіла до сигнального тканинного фактору). У такому випадку подібність дослідної сполуки (наприклад, рівний або менший обсяг зв'язування) до еталону свідчить про те, що це є сполука-кандидат (тобто вона зв'язується з сигнальним тканинним фактором у такому само або більшому ступені, ніж еталонне антитіло). 47 Далі цей винахід стосується нових агентів, що визначаються вищеописаними скрінінговими аналізами, та їх застосування при лікуванні хвороб за винаходом. В одному з варіантів пропонується аналіз розчинного типу з використанням тканинного фактору або клітини чи тканини з експресією природного або рекомбінантного тканинного фактору. В іншому варіанті йдеться про високоефективний твердофазний аналіз in vitro, де тканинний фактор, тканинний фактор у відповідно модифікованій конформації для імітації клітинних сигнальних пулів, або його ліганд приєднується до твердофазного субстрату шляхом ковалентної або нековалентної взаємодії. Будь-який з описаних аналізів є придатним до високоефективної процедури скрінінгу. У високоефективних розчинних або твердофазних аналізах за винаходом можливо просіювати по кілька тисяч різних модуляторів або лігандів за добу. Ця методика може використовуватися для аналізів протеїну тканинного фактору in vitro або для клітинно- чи мембраннобазованих аналізів що містять генний продукт або протеїн тканинного фактору. Зокрема, у кожній лунці мікротитровального планшету можна проводити окремий аналіз потенційного модулятора, або, якщо йдеться про різні концентрації або часи інкубування, можна виділяти на один модулятор 5-10 лунок. Отже, на стандартному мікротитровальному планшеті можна одночасно аналізувати біля 100 (точніше, 96) модуляторів. На планшеті з 1536 лунками аналізують від 100 до біля 1500 різних сполук. При використанні багатьох планшетів денна пропускна спроможність становитиме 6,000, 20,000, 50,000 й навіть більше 100,000 різних сполук завдяки такій інтегральній системі за винаходом. При твердофазному аналізі цільовий протеїн або його фрагмент, наприклад, позаклітинний домен, або клітину чи мембрану, яка містить цільовий протеїн або його фрагмент у складі злитого протеїну, з'єднують прямо чи непрямо, ковалентно або нековалентно, з твердим субстратом, наприклад, через мітку. Міткою може бути будь-який компонент. Як правило, молекула, що зв'язує мітку, прикріплюється до твердої основи, а мічена цільова молекула з'єднується з твердою опорою шляхом взаємодії між міткою та молекулою, що її зв'язує. Можна використовувати чимало міток та молекул, що їх зв'язують, на базі відомих з літератури взаємодій. Наприклад, у випадку коли мітка має природного партнера, що її зв'язує, наприклад, біотин, протеїн А або протеїн G, можна використовувати у відповідну молекулу, що зв'язує (авідин, стрептавідин, нейтравідин, сегмент Fc імуноглобуліну тощо) Антитіла до молекул з природними зв'язувальними сполуками, таких як біотин, також широко використовуються для зв'язування міток (див. каталог SIGMA Immunochemicals 1998, SIGMA, St. Louis MO). Подібним чином будь-яка гаптенова або антигенна сполука у комбінації з відповідним антитілом може утворювати пару мітка/зв'язувальна сполука. Тисячі специфічних антитіл є у продажі, також ба 94922 48 гато описано у літературі. Наприклад, у поширеній конфігурації міткою слугує перше антитіло, а зв'язувальною сполукою - друге антитіло, яке розпізнає перше. Крім взаємодій антитіло-антиген, парами мітка-зв'язу вальна сполука можуть слугувати взаємодії рецептор-ліганд. Наприклад, агоністи та антагоністи рецепторів клітинних мембран, як от такі рецептор-лігандні взаємодії можливі, серед їх елементів: дзвоноподібні рецептори, трансферин, с-набір, ліганди вірусних рецепторів, рецептори цитокіну, рецептори хемокіну, рецептори інтерлейкіну, рецептори імуноглобуліну та антитіла до нього, сімейство кадгерину, сімейство інтегрину, сімейство селектину тощо (наприклад, Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I, 1993). Подібним чином токсини та отрути, вірусні епітопи, гормони (наприклад, опіати, стероїди тощо.), міжклітинні рецептори (наприклад, ті, що медіюють дію різних малих лігандів, у тому числі стероїдів, тіреоїдного гормону, ретиноїдів та вітаміну D; пептиди), ліки, лектини, сахари, нуклеїнові кислоти (у лінійних та циклічних полімерних конфігураціях), олігосахариди, протеїни, фосфоліпиди та антитіла здатні взаємодіяти з різними клітинними рецепторами. Синтетичні полімери (поліуретани, полиефіри, полікарбонати, полісечовина, поліаміди, поліетиленіміни, поліариленсульфиди, полісилоксани, полііміди та поліацетати) також можуть бути мітками або зв'язувати мітки. Багато інших пар мітка/молекула, що її зів'язує придатні у системах аналізу за винаходом описаним тут, вони відомі фахівцям в цій галузі. Звичайні зшивальні агенти - пептиди, поліефіри тощо - також можуть бути мітками і включати поліпептидні послідовності, наприклад, поліглікопослідовності від 5 до 200 амінокислот. Такі гнучкі зшивальні агенти добре відомі фахівцям. Наприклад, поліетиленглікольні лінкери випускає фірма Shearwater Polymers, Inc. у Гантсвілі, штат Алабама. Ці лінкери можуть мати амідні, сульфгідрильні або гетерофункціональні групи зчеплення. Сполуки, що зв'язують мітки, прикріплюються до твердих субстратів будь-яким відомим чином. Тверді субстрати, як правило, піддають дериватизації або фу-нкціоналізації повною або частковою обробкою реагентом, який фіксує хімічну групу на поверхні, що реагує з частиною сполуки, яка зв'язує мітки. Наприклад, для прикріплення до дільниці довшого ланцюга придатні аміни, гідроксили, тіоли та карбоксильні групи. Аміноалкілсилани та гідроксіалкілсилани функціоналізують численні поверхні, наприклад, скляні. Побудова таких твердофазних біополімерів описана у літературі (наприклад, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 21492154, 1963 (опис твердофазного синтезу, наприклад, пептидів); Geysen et at, J. Immun. Meth. 102: 259-274, 1987 (опис синтезу твердофазних компонентів на шпильках); Frank & Doring, Tetrahedron 44: 6031-6040, 1988 (опис синтезу різних пептидних послідовностей на целюлозних дисках); Fodor et at, Science 251: 161-111, 1991; Sheldon et at, Clinical Chemistry 39: 718-719,1993; Kozal et at, Nature Medicine 2: 753-759, 1996 (усі описують масиви біополімерів на твердих субстратах). Сполу 49 ки, що зв'язують мітки, прикріплюють до субстратів також нехімічними способами - нагріванням, зшиванням під дією УФ опромінювання тощо. Біспецифічні сполуки як модулятори сигналінгу тканинного фактору Запропоновано спосіб виявлення кандидатурних біспецифічних дослідні сполуки, які знижують концентрацію агента у сироватці та/або кровообігу тварин, крім людей. Сполуки, відібрані або оптимізовані представленими за винаходом методами, можуть використовуватися для лікування пацієнтів, котрим буде корисне введення цих сполук, наприклад, людей. Кандидатурні сполуки, що можуть випробуватися у методиках за винаходом, є біспецифічнми молекулами. "Біспецифічною сполукою" є, та що має дві різні специфічності зв'язування, наприклад, біспецифічні антитіла, гетерополімери та гетерополміери на основі антигенів. Біспецифічні молекули за винаходом переважно містять зв'язувальну частину, специфічну для тканинного фактору, протеїндісульфидізомерази або PAR2, переважно для людських тканинного фактору, протеїндісульфидізомерази або PAR2, зшиту з другою зв'язувальною частиною, специфічною для цільового агента (наприклад, певного антитіла або антигена). Серед прикладів зв'язувальних частин, специфічних до тканинного фактору, можна навести ліганди тканинного фактору переважно антитіла до сигналінгу тканинного фактору. Антитіло може бути інгібітором сигналізації тканинного фактору у ссавців, який не впливає на гемостаз. В іншому варіанті нові молекули, що зв'язують тканинний фактор, можна виявити за їх здатністю зв'язувати тканинний фактор та інгібувати сигналінг тканинного фактору. Наприклад, бібліотеки сполук або малих молекул можна піддати аналізу на зв'язування в безклітинній системі. Будь-яку кількість дослідних сполук, наприклад пептидоміметики, малі молекули або інші препарати, можна використовувати для тестування та одержати одним з багатьох відомих підходів комбінаторних бібліотек, включаючи біологічні бібліотеки; бібліотеки паралельних розчинних чи твердофазних аналізів з об'ємною адресацією; синтетичні бібліотеки, що потребують зворотного скручування; бібліотеки за принципом "одна гранула- одна сполука" та синтетичні бібліотеки з використанням афінної хроматографії для відбору. Біологічна бібліотека обмежується бібліотеками пептидів, тоді як чотири інші підходи придатні для бібліотек пептидів, непептидних олігомерів або малих молекул (Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145, 1997). У багатьох програмах відбору ліків котрі тестують бібліотеки модулюючих агентів та природні екстракти потрібні високоефективні аналізи, щоб швидко пропустити якомога більше сполук. Часто як первинним аналізам віддають перевагу аналізам на безклітинних системах, що можуть бути отримані з очищених та напівочищених протеїнів, бо вони дозволяють швидко спостерігати розвиток подій та відносно легко виявляти зміни у цільовій молекулі, медійовані дослідним модулювальним агентом. Більш того, вплив токсичності на клітини 94922 50 та/або біотолерантності дослідного модулювального агента, як правило, можна ігнорувати у системі in vitro, зосереджуючи аналіз на дії препарату на цільовій молекулі, що виявляється у зміні зв'язувальної спорідненості з елементами, які передують або йдуть після цільової молекули в сигнальному ланцюзі. В іншому варіанті для виявлення нових зв'язуючих тканинний фактор молекул використовують відомий прийом фагового дисплею. В одному з варіантів винахід дозволяє проводити скрінінг кандидатурних або тестованих сполук, що зв'язуються з тканинним фактором чи його біологічно активною ділянкою. Клітинні аналізи для виявлення молекул, що зв'язують тканинний фактор, дозволяють знайти додаткові агенти, здатні діяти як біспецифічні сполуки за винаходом. Наприклад, експресований в клітинах тканинний фактор можна використовувати у скрінінговому аналізі. Наприклад, можна виявляти сполуки, що дають статистично значущі зміни показників зв'язування з тканинним фактором. Ще в одному варіанті безклітинного аналізу молекулу, що зв'язує тканинний фактор, виявляють за здатністю зв'язувати протеїн тканинного фактору in vitro. Молекулу, що зв'язує протеїн тканинного фактору, можна знайти і здатність протеїну зв'язувати білок тканинного фактору випробувати відомими методами визначення прямого зв'язування. Здатність протеїну зв'язувати цільову молекулу визначають, зокрема, аналізом бімолекулярної взаємодії у реальному масштабі часу (ΒΙΑ) (Sjolander et al., Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991, та Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699705, 1995). "ΒΙΑ" - це технологія вивчення біоспецифічних взаємодій у реальному часі без застосування міток (наприклад, ВІАсоrе). Зміни в оптичному явищі - поверхневому плазмонному резонансі (SPR) - слугують ознакою реакцій, що відбуваються між біологічними молекулами у реальному часі. Безклітинні аналізи за винаходом придатні як для розчинних, так і мембранно зв'язаних форм протеїнів. У разі мембранно зв'язаних форм протеїнів доцільно використовувати солюбілізатор, щоб утримувати мембранно зв'язану форму протеїну у розчині. До таких солюбілізаторів належать неіонні детергенти, як от n-октилглюкозид, nдодецилглюкозид, n-додецилмальтозид, октаноїлN-метилглюкамід, деканоїл-N-метилглюкамід, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, ізотридециполі(ефір етилен гліколю)n, 3-[(3холамідопропил)діметиламін]-1-пропансульфонат (CHAPS), 3-[(3-холамідопропил)діметиламін]-2гідроксі-1-пропансульфонат (CHAPSO), або Nдодецил-N,N-діметил-3-амоній-1-пропансульфонат. Відомі методи аналізу, які дозволяють виявити взаємодії між протеїнами (наприклад, імунопреципітація, двугібридний аналіз тощо). При постановці таких аналізів у присутності дослідних сполук або без них можна виявити сполуки, що модулюють (наприклад, інгібують або підсилюють) взаємодію протеїнів за винаходом з цільовими молекулами. 51 Здатність протеїну зв'язуватися або взаємодіяти з цільовою молекулою можна визначити, наприклад, прямим зв'язуванням. При аналізі прямого зв'язування протеїн можна помітити радіоізотопом або ферментом таким чином, що ознакою зв'язування протешу з цільовою молекулою стане виявлення міченого протеїну у комплексі. Наприклад, протеши можна прямо або непря125 35 14 3 мо мітити І, S, C або Н, а радіоізотоп виявляти підрахунком радіовипромінювання або лічильником сцинтиляцій. Або ж молекулу можна помітити ферментом - пероксидазою з хрону, лужною фосфатазою або люциферазою, а ферментну мітку визначити за ступнем перетворення відповідного субстрату на продукт. Звичайно доцільно імобілізувати або протеїн за винаходом, або той, що його зв'язує, щоб полегшити відокремлення комплексу від некомплексованих форм того чи іншого протеїну, а також автоматизувати аналіз. Зв'язування з попереднім чи наступним елементом сигнального ланцюга у присутності кандидатурної сполуки або без виконують у будь-якому сосуді, придатному для реагентів мікротитрувальному планшеті, пробірці або мікроцентрифузі. В одному з варіантів бере участь злитий протеїн, який додає домен, що дозволяє протеїну зв'язатися з матрицею. Наприклад, злиті протеїни глютатіон-S-трансферази (GST) з тканинним фактором адсорбуються на гранулах глютатіонсефарози (фірми Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) або на дериватизованих від глютатіону мікротитрувальних планшетах, які потім комбінують з 35 лізатами клітини, наприклад, міченими S, та модулювальним агентом, і суміш інкубують за умов, що сприяють утворенню комплексу, наприклад, за фізіологічних умов стосовно солі та рН, хоча ці умови можна зробити трохи жорсткішими. Після інкубації гранули відмивають від незв'язаної мітки, а імобілізовану на матриці радіоактивну мітку визначають або прямо (наприклад, вміщують гранули до сцинтилянту), або у супернатанті після дисоціації комплексів. Або ж комплекси дисоціюють від матриці, розділяють за допомогою SDS-PAGE (та електрофорезу у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію) та визначають рівень зв'язуючого тканинний фактор протеїну у гранульованій фракції, обрахований за стандартними електрофорезними методами. При аналізі можна використовувати інші прийоми імобілізації протеїнів на матрицях. Наприклад, можна одержувати біотиновані молекули з комплексу біотин-NHS (N-гідроксісукцинімід) відомим способом (наприклад, біотинувальний набір фірми Pierce Chemicals, Rockford, l11.) та імобілізувати його у лунках покритого стрептавідином 96лункового планшету (фірми Pierce Chemical). Також у рамках винаходу можливо визначати здатність сполуки модулювати взаємодію між тканинним фактором та протеїндісульфидізомеразою або тканинним фактором та PAR2, не вдаючись до мічення реагентів. Наприклад, мікрофізіометром можна визначати взаємодію протеїну за винаходом з його цільовою молекулою без міток ані на протеїні, ані на цільовій молекулі (McConnell et at, Science 257: 1906-1912, 1992). Використане слово 94922 52 "мікрофізіометр" (наприклад, Cytosensor) - це аналітичний прилад, який вимірює швидкість закислення клітиною свого оточення за допомогою світлоадресованого потенціометра (LAPS). Зміни швидкості закислення характеризують взаємодію між сполукою та рецептором. Гетерополімери на антигенній основі, які можуть випробуватися за цим винаходом, переважно містять зв'язувальну частину, яка є специфічною до тканинного фактору, зокрема, людського тканинного фактору, зшиту з антигеном, який розпізнається аутоантитілом. Антигеном, який розпізнається аутоантитілом, може бути, зокрема, фактор VIII (антитіла, пов'язані з лікуванням гемофілії шляхом заміни рекомбінантного фактору VIII); м'язовий рецептор ацетилхоліну (антитіла, пов'язані з міастенією); кардіоліпин (пов'язаний з вовчаком); протеїни, пов'язані з тромбоцитами (пов'язані з ідіопатичною тромбоцитопенією); численні антигени, пов'язані з синдромом Шьогрена; антигени, що виникають при аутоімунних реакціях на пересадку тканин; антигени серцевого м'язу (пов'язані з аутоімунним міокардитом); антигени, пов'язані з медійованим імунним комплексом захворюванням нирок; антигени dsДНК та ssДНК (пов'язані з люпуснефритом); десмоглеїни та десмоплакини (пов'язані з пухирчаткою та пемфігоїдом); та будь-які інші антигени, які чітко зхарактеризуються та пов'язані з патогенезом хвороби. Типові гетерополімери та гетерополімери на антигенній основі, придатні для використання у цьому винаході, та способи їх одержання добре відомі. Наприклад, типові гетерополімери описані у таких джерелах: WO 03007971А1; U.S. 20020103343А1; патент США № 5,879,679; патент США № 5,487,890; патент США № 5,470,570; WO 9522977A1; WO/02075275 A3, WO/0246208A2 or A3, WO/0180883A1, WO/0145669A1, WO 9205801 A1, Lindorfer et al., J. Immunol. Methods. 248: 125,2001; Hahn et at, J. Immnol 166: 1057, 2001; Nardin et at, J. Immunol Methods. 211: 21, 1998; Kuhn et al., J. Immunol. 160: 5088, 1998; Taylor et al., Cancer Immunol. Immunother. 45: 152, 1997; Taylor et al., J. Immunol. 159: 4035,1997; та Taylor et al., J. Immunol 148: 2462, 1992. Крім того, можна одержувати варіантні форми таких гетерополімерів. Наприклад, можна одержувати форми біспецифічних молекул, вдаючись до різних методик зшивання. Для зшивання компонентів біспецифічної молекули можна використовувати, наприклад, поліетиленгліколь, SATA, SMCC та інші відомі реагенти, що їх випускає фірма Pierce Biotechnology. Приклади придатних для випробування форм біспецифічних молекул наведені у заявці США № 60/411,731 від 16 вересня 2002, зміст якої включений до цієї заявки як посилальний матеріал. В іншому варіанті готують різні мультимерні форми біспецифічних молекул (наприклад, дімери, тримери, тетрамери, пентамери або вищі мультимери). Або випробують очищені форми біспецифічних молекул, наприклад, за заявкою США № 60/380,211 від 13 травня 2002, зміст якої включений до цієї заявки як посилальний матеріал. Якщо однією із зв'язувальних частин гетерополімеру є антитіло, можна вживати антитіла різ 53 них ізотипів (наприклад, IgA, IgD, IgE, IgGl, IgG2 (наприклад, IgG2a), IgG3, IgG4 або IgM). Або ж однією із зв'язувальних частин можуть буим частини молекули антитіла (наприклад Fab фрагменти). У переважному варіанті однією із зв'язувальних частин є антитіло, що містить Fc домен. Це може бути мишаче антитіло. Також можна випробувати вплив модифікацій на антитіла, наприклад, вплив деімунізації на антитіло, як описано у заявці США № 60/458,869 від 28 березня 2003. Згідно з винаходом можливо зменшувати концентрацію агента, наприклад, патогенного агента, у сироватці, кровообігу та/або тканинах тварини, крім людини, принаймні на, наприклад, біля 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% або біля 100%. Також можливе непряме вимірювання концентрації агента у сироватці, кровообігу та/або тканинах хворого. Наприклад, патологію внаслідок присутності агента у сироватці та/або кровообігу можна виміряти, вивченням зразків тканини від тварини. Інший спосіб непрямого вимірювання концентрації агента у сироватці, кровообігу та/або тканинах тварини, крім людини, полягає у визначенні здатності агента спричинювати інфекцію у тварини, крім людини. Наприклад, можна вимірювати вплив біспецифічної сполуки на клінічні прояви та симптоми інфекції. Здатність біспецифічної сполуки інгібувати поширення інфекції, наприклад, від системи одного органу до іншого або від одного хворого до іншого також можна виміряти. В іншому варіанті вимірюють здатність біспецифічної сполуки зв'язувати клітини, що несуть тканинний фактор, у тварин, крім людини. Наприклад, в одному варіанті здатність біспецифічної сполуки зв'язувати цільову молекулу тканинного фактору визначають аналізом бімолекулярної взаємодії у реальному масштабі часу (ΒΙΑ) (Sjolander et al., Anal. Chem. 63: 2338-2345, 1991 and Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699-705, 1995). "ΒΙΑ" це технологія вивчення біоспецифічних взаємодій у реальному масштабі часу без застосування міток (наприклад, ВІАсоrе). Зміни в оптичному явищі поверхневому плазмонному резонансі (SPR) - слугують ознакою реакцій, що відбуваються між біологічними молекулами у реальному масштабі часу. Або ж вимірюють руйнування агента клітинами у тварин, крім людини (наприклад, знищення макрофагами). Сполуки, що зменшують концентрацію агента у сироватці та/або кровообігу тварин, крім людини (у порівнянні з концентраціями у тварин, крім людини, які не одержували біспецифічну сполуку), можуть бути відібрані. Сполуки для тестування в аналізах хворого можна вибирати з багатьох випробуваних. Так, біспецифічні сполуки для випробування в експресаналізах можуть вже довести свою здатність зв'язувати тканинний фактор, наприклад, в аналізі in vitro й можуть проходити подальшу оцінку або оптимізацію в експрес-аналізі. У таких випадках здатність біспецифічної сполуки зменшувати концентрацію агента у сироватці та/або кровообігу можна 94922 54 порівнювати з іншою біспецифічною сполукою або з неоптимізованою версією тієї самої сполуки, визначаючи здатність біспецифічної сполуки зменшувати концентрацію агента у сироватці та/або кровообігу. У переважних варіантах здійснення біспецифічні сполуки за винаходом вводять у концентраціях, що становлять від приблизно 1 мкг сполуки / кг маси тіла до приблизно 100 мкг сполуки / кг маси тіла. У цьому винаході терапевтично дійова кількість біспецифічної сполуки (тобто ефективна доза) становить від біля 0.01 до 5000 мкг сполуки / кг маси тіла, бажано, від 0.1 до 500 мкг сполуки / кг маси тіла, краще, від 2 до 80 мкг сполуки / кг маси тіла, ще більш бажано від біля 5 до 70 мкг сполуки / кг маси тіла, від 10 до 60 мкг сполуки / кг маси тіла, від 20 до 50 мкг сполуки / кг маси тіла, від 24 до 41 мкг сполуки / кг маси тіла, від 25 до мкг сполуки / кг маси тіла, 40 мкг сполуки / кг маси тіла, від 26 до 39 мкг сполуки / кг маси тіла, від 27 до 38 мкг сполуки / кг маси тіла, від 28 до 37 мкг сполуки / кг маси тіла, від 29 до 36 мкг сполуки / кг маси тіла, від 30 до 35 мкг сполуки / кг маси тіла, від 31 до 34 мкг сполуки / кг маси тіла або від 32 до 33 мкг сполуки / кг маси тіла. Фахівцеві відомо що різні фактори можуть впливати на дозування, потрібне для ефективного лікування хворого, у тому числі важкість хвороби або розладу, попереднє лікування, загальний стан здоров'я та/або вік хворого й наявність інших хвороб. Більш того, лікування хворого терапевтично ефективними дозами протеїну, поліпептиду або антитіла може займати один або кілька курсів. У переважному варіанті лікувальна доза біспецифічної сполуки для тварини становить від біля 1 до 500 мкг/кг маси тіла при внутрішньовенному (iv) введенні агента. Ефективну дозу біспецифічної сполуки можна зменшувати або збільшувати протягом курсу лікування. Зміна дозування витікає з результатів вищеописаних діагностичних аналізів. Дослідні сполуки та/або агенти можна вводити до кровообігу хворого внутрішньовенно (iv). Можливі інші шляхи, зокрема, топікальний, парентеральний, підшкірний або інгаляційний. Термін "парентеральний" охоплює підшкірні, внутрішньовенні або внутрішньом'язові ін'єкції, а також локалізоване введення, наприклад, у місці хвороби або травми. Відоме також уповільнене виділення сполук з імплантатів. Фахівцеві зрозуміло, що лікувальні дози можуть розрізнятися у залежності від таких факторів, як природа розладу, маса тіла хворого, вік, загальний стан здоров'я та шлях введення. Попередньо дози встановлюють шляхом випробувань на тваринах, а їх пристосування до людського організму здійснюється за встановленою практикою. Кандидатурні сполуки та агенти вводять тваринам у певному інтервалі доз. Якщо вводиться також і агент, сполуку-кандидат можна вводити одночасно, до або після введення агента. Трансгенні тварини з експресією тканинного фактору за винаходом, наприклад, миші можуть слугувати для відсіву та оцінки кандидатурних сполук на здатність лікування розладів чи хвороб у 55 людей, пов'язаних з наявністю небажаних агентів у сироватці та/або кровообігу хворого, як аутоантитіла, інфекційні агенти або токсини. До цільових агентів, що їх можуть зв'язувати біспецифічні сполуки за винаходом, належать присутні у крові агенти, зокрема, віруси, пухлинні клітини, клітини запалювального інфільтрату, полінуклеотиди, антитіла, наприклад аутоантитіла, пов'язані з аутоімунним розладом. В одному з варіантів здійснення аналізу за винаходом агент вводять трансгенній тварині одночасно, до або після введення біспецифічної сполуки. Біспецифічні сполуки за винаходом або їх частини можна модифікувати для подовження періоду напіврозкладу. Аналоги пептидів вживають у фармацевтичній промисловості як непептидні ліки, властивості яких аналогічні властивостям шаблонних пептидів. Ці типи непептидних сполук називають "пептидоміметиками" (Fauchere, Adv. Drug Res. 15: 29, 1986; Veber et al., TINS p.392, 1985; та Evans et al., J. Med. Chem 30: 1229, 1987, включені сюди як посилальний матеріал) й розробляють шляхом машинного моделювання молекул. Пептидоміметики, схожі за структурою до терапевтично корисних пептидів, чинять аналогічну лікувальну або профілактичну дію. Зазвичай пептидоміметики є схожі за структурою до парадігмального поліпептиду (тобто поліпептиду, який виявляє біологічну або фармацевтичну активність), як от антигений поліпептид, але один або кілька пептидних зв'язків у них можуть бути заміщені зв'язком, обраним з-поміж: -CH2NH-, -CH2S-, CH2-CH2-, -СН=СН- (ціс і транс), -СОСН2-, СН(ОН)СН2- та -CH2SO-, відомими способами, як описано у наступних джерелах : Spatola, A. F., in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins Weinstein, В., ed., Marcel Dekker, New York, p. 267,1983; Spatola, A. F., Vega Data, Vol. 1, Issue 3, "Peptide Backbone Modifications," 1983; Morley, Trends. Pharm. Sci. pp.463-468, 1980; Hudson et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185, 1979 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola et al., Life. Sci. 38: 1243-1249,1986 (-CH2-S); Hann, J. Chem. Soc. Perkin. Trans. 1: 307-314, 1982 (-CH-CH-, ціс і транс); Almquist et al., J. Med. Chem. 23: 1392-1398, 1980 (-COCH2-); Jennings-White et al., Tetrahedron Lett. 23:2533, 1982 (-COCH2-); Szelke et al., Європейська заявка № ЕР 45665 CA: 97: 39405, 1982 (-CH(OH)CH2-); Holladay et al., Tetrahedron. Lett. 24: 4401-4404, 1983 (-C(OH)CH2-); та Hruby, Life Sci. 31: 189-199, 1982 (-CH2-S-); усі включені сюди як посилальний матеріал. Переважним непептидним зв'язком є CH2NH-. Ці пептидоміметики мають певні переваги перед поліпептидними варіантами, наприклад: меншу вартість одержання, кращу хімічну стабільність, кращі фармакологічні властивості (період напіврозкладу, засвоюваність, потужність, ефективність тощо), змінену специфічність (наприклад,, розширений спектр біологічної активності), меншу антигенність тощо. Пептидоміметики ковалентно зв'язуються з однією або кількома мітками, прямо або крізь спейсер (наприклад, амідну групу), у не 94922 56 критичних позиціях на пептидоміметику, які можна прогнозувати з даних про кількісну структурну активність та/або шляхом молекулярного моделювання. Такі некритичні позиції не вступають до прямого контакту з макромолекулами, до яких зв'язується пептидоміметик для лікувальної дії. Дериватизація (наприклад, мічення) пептидоміметика суттєво не впливає на його корисну біологічну або фармакологічну дію. Систематичним заміщенням однієї або кількох амінокислот або послідовності D-амнокислотою того само типу (наприклад, D-лізином замість Lлізину) використовується для створення більш стабільних пептидів. Крім того, можна одержувати відомими способами конформаційно обмежені пептиди (Rizo et al., Annu. Rev. Biochem. 61: 387, 1992, включено до опису як посилальний матеріал); наприклад, шляхом додання внутрішніх цистеїнових залишків, здатних утворювати внутрішньомолекулярні дісульфидні містки, що циклізують пептид. Такі модифіковані поліпептиди можна одержувати у прокаріотичних або еукаріотичних клітинаххазяях. Або ж такі пептиди можна синтезувати хімічним шляхом. Способи експресії чужорідних поліпептидів у рекомбінантних хазяїнах, хімічного синтезу поліпептидів та трансляції in vitro добре відомі й описані у Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Berger et al., Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 91: 501, 1969; Chaiken, CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255, 1981; Kaiser et al, Science 243: 187, 1989; Merrifield, Science 232: 342, 1986; Kent, Annu. Rev. Biochem. 57: 957, 1988; та Offord, Semisynthetic Proteins, Wiley Publishing, 1980, які включені до опису як посилальний матеріал). Поліпептиди можна одержувати прямим хімічним синтезом та використовувати як зв'язувальну частину гетерополімеру. Модифіковані поліпептиди можуть мати непептидну частину, ковалентно приєднану до N-закінчення та/або С-закінчення. У певних переважних варіантах карбоксізакінчення чи амінозакінчення, або обидва, є хімічно модифіковані. Найчастіше аміно- та карбоксильні групи закінчень модифікують ацетилюванням та амідуванням відповідно. Модифікації амінозакінчень, як ацилювання (наприклад, ацетилювання) або алкілювання (наприклад, метилювання) й модифікації карбоксізакінчень, як от амідування, та інші модифікації закінчень, у том числі циклізацію, можна включати до різних варіантів дослідних сполук. Певні модифікації карбоксізакінчень, та/або амінозакінчень, та/або продовження пептидів до ядерних послідовностей можуть надавати певних корисних фізичних, хімічних, біохімічних та фармакологічних властивостей, як от: підвищену стабільність, збільшену потужність та/або ефективність, стійкість до протеаз сироватки, бажаних фармакокінетичних властивостей тощо. Детектовні мітки Мітку групи, що застосовується в аналізі, можна визначити спектроскопічними, фотохімічними, 57 біохімічними, імунохімічними, електричними, оптичними або хімічними засобами. Той чи інший вид мітки не має суттєвого значення за винаходом, якщо не впливає на специфічне зв'язування антитіла із сигнальним тканинним фактором, наприклад, Mab 10Н10, що застосовується в аналізі. Такі детектовні мітки широко застосовуються у хімічному або імуноаналізі, і майже всі вони можуть знайти використання у цьому винаході. Мітка - це будь-яка сполука, яку можна виявити спектроскопічними, фотохімічними, біохімічними, імунохімічними, електричними, оптичними або хімічними засобами. У винаході можуть використовуватися магнітні мітки (наприклад, Dynabeads™), флуоресцентні фарбники (наприклад, флуоресцеїнізотіоціанат, техаський червоний, родамін тощо), радіоі3 14 35 125 121 зотопи (наприклад, Н, С, S, I, In, "mTc), інші агенти, що створюють відповідне зображення, наприклад, мікропухирці (для ультразвукового зо18 11 15 браження), F, С, О (для позитронної томо111 графії), "mTc, Іn (для однофотонної томографії), ферменти (наприклад, пероксидаза з хрону, лужна фосфатаза та інші, що їх застосовують у твердофазному імуноферментному аналізі ELISA), колориметричні мітки, як от колоїдне золото та гранули з кольорового скла чи пластику ("наприклад, полістиролу, поліпропилену, латексу тощо). Застосування цих міток описується у патентах США №№ 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149; and 4,366,241 (усі включені до опису як посилальний матеріал). Див. також Handbook of Fluorescent Probes and Research th Chemicals (6 Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.). Мітку можна зв'язувати прямо чи непрямо з потрібним компонентом відомими прийомами. Як зазначено вище, мітки бувають різноманітні, їх вибір залежить від потрібної чутливості, зручності кон'югації із сполукою, стабільності, наявних приладів та можливостей видалення залишків аналізу. Нерадіоактивні мітки часто приєднують непрямим шляхом. Як правило, молекула ліганду (наприклад, біотину) зв'язується з молекулою ковалентно. Далі ліганд зв'язується до іншої молекули (наприклад, стрептавідину), яка або сама є помітна, або ковалентно зв'язана з сигнальною системою - помітним ферментом, флуоресцентною або люмінісцентною сполукою. Ліганди та їх цілі можна будь-яким чином комбінувати з антитілами, що розпізнають тканинний фактор, або вторинними антитілами, що розпізнають антитіла до тканинного фактору. Молекули можна також прямо кон'югувати з сигнальними сполуками, наприклад, ферментом чи флуорофором. Мітками можуть слугувати такі ферменти, як гідролази, особливо фосфатази, естерази та глікозидази, а також оксидотази, особливо пероксидази. До флуоресцентних сполук належать флуоресцеїн та його похідні, родамін та його похідні, дансил, умбеліферон тощо. З хемілюмінісцентних сполук можна назвати люциферин та 2,3-дігідрофталазиндіони, як от люмінол. Огляд різних міткових або сигнальних систем див. патент США № 4,391,904. 94922 58 Засоби знаходження міток добре відомі фахівцям. Наприклад, радіоактивні мітки виявляють лічильником сцинтиляцій або на фотоплівці методом радіоавтографії. Флуоресцентна мітка виявляється збудженням люмінофору на відповідній хвилі та визначенням одержаної флуоресценції. Флуоресценцію визначають візуально, за допомогою електронних детекторів - приладів із зарядовим зв'язком (CCD), фотопомножувачів тощо. Ферментні мітки можна виявити за допомогою відповідних субстратів для ферменту та знаходження відповідного продукту реакції. Нарешті, прості колориметричні мітки визначаються просто за кольором, пов'язаним з міткою. Так, у різних аналізах із щупами кон'юговане золото виглядає рожевим, а кон'юговані гранули показують власний колір. При деяких аналізах мітки взагалі не потрібні. Наприклад, реакція аглютинації виявляє цільові антитіла. Покриті антигеном частки аглютинуються зразками, що містять цільові антитіла. У цьому формаі мітити компоненти не треба, бо наявність цільового антитіла виявляється візуально. Часто клітинний маркер та антитіла до нього мітять ковалентним або нековалентним з'єднуванням з речовиною, яка дає помітний сигнал. Аналітичні набори Обсяг винаходу також охоплює аналітичні набори, що можуть містити наступні сполуки: моноклональні антитіла, антитіла людських послідовностей, людські антитіла, мультиспецифічні та біспецифічні молекули, малі хімічні молекули, композиції нуклеїнових кислот, наприклад, антисенсові олігонуклеотиди, олігонуклеотиди з двохланцюговою РНК (RNAi, shRNA, si RNA) або олігонуклеотиди ДНК чи вектори, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують транскрипцію молекул shRNA(short hairpin) за винаходом, та інструкції з їх застосування. Набір може також містити принаймні один додатковий реагент, або одне чи кілька додаткових людських антитіл за винаходом (наприклад, людське антитіло з комплементарною активністю, яке зв'язується з іншим епітопом антигена, ніж перше людське антитіло). Набори звичайно мають ярлик, де зазначається застосування їх вмісту. Ярлик - це будь-який друкований або записаний матеріал, що додається до набору або іншим чином супроводжує набір. Фармацевтичні композиції Лікувальні композиції (наприклад,, моноклональні антитіла, антитіла людських послідовностей, людські антитіла, мультиспецифічні та біспецифічні молекули, малі хімічні молекули, композиції нуклеїнових кислот, наприклад, антисенсові олігонуклеотиди, олігонуклеотиди з двохланцюговою РНК (RNAi, shRNA, si RNA(small interfering)) або олігонуклеотиди ДНК чи вектори, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують транскрипцію молекул shRNA), є придатні для композицій та методів введення хворій людині самі по собі, у вигляді стереоізомерів, прекурсорів, фармацевтично прийнятних солей, гідратів, сольватів, гідратів кислих солей, N-оксидів або ізоморфних кристалічних форм, або ж у вигляді фармацевтичних композицій, де сполука є змішана з відповідними носі 59 ями або наповнювачами у терапевтично дійовій кількості проти, наприклад, раку або метастазів раку. Фармацевтично прийнятні носії визначаються як складом самої композиції, так і способом її введення до організму. Відповідно існує величезна кількість придатних складів фармацевтичних композицій для введення лікувальних антитіл у сполученні з композиціями проти пухлинних клітин, або малих молекул, або лігандів (наприклад, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack th Publishing Co., Easton, PA 18 ed., 1990, включений сюди як посилальний матеріал). Фармацевтичні ком-позиції,як правило, містять відмінно експресований протеїн, агоніст чи антагоніст у формі, придатній для введення хворому. Фармацевтичні композиції складають як стерильні, по суті ізотонічні та у повній відповідності до правил Доброї виробничої практики (GMP) Управління з ліків та харчових продуктів США. Режими лікування Винахід пропонує фармацевтичні композиції у складі однієї або кількох композицій (наприклад,, моноклональні антитіла, антитіла людських послідовностей, людські антитіла, мультиспецифічні та біспецифічні молекули, малі хімічні молекули, композиції нуклеїнових кислот, наприклад, антизмістовні олігонуклеотиди, олігонуклеотиди з двохланцюговою РНК (RNAi, shRNA, si RNA) або олігонуклеотиди ДНК чи вектори, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують транскрипцію молекул shRNA, які специфічно зв'язують сигнальний тканинний фактор у новоутворених пухлинних клітинах або запалювальних клітинах, разом із фармацевтично прийнятним носієм. Деякі композиції являють собою комбінації багатьох (наприклад, двох чи більше) антитіл або лікувальних малих молекул. Профілактичні фармацевтичні композиції або лікарські засоби вводять хворим, які схильні або іншим чином ризикують одержати хворобу або стан (тобто імунну хворобу), у кількості, достатній для зменшення або усунення ризику, пом'якшити симптоми або віддалити появу хвороби, включаючи біохімічні, гістологічні та/або поведінкові симптоми хвороби, її ускладнення та проміжні патологічні фенотипи, прояви яких мають місце при розвитку хвороби. Терапевтичні композиції або лікарські засоби вводять хворим, які підозрюються або вже одержали таку хворобу, у кількості, достатній для усунення або принаймні часткового призупинення біохімічних, гістологічних та/або поведінкових симптомів, включаючи ускладнення та проміжні патологічні фенотипи, прояви яких мають місце при розвитку хвороби. Кількість, достатня для досягнення терапевтичного або профілактичного ефекту, вважається терапевтично або профілактично ефективною дозою. У терапевтичному або профілактичну режимі звичайно вводять кілька доз до досягненні потрібної імунної реакції. Імунну реакцію відслідковують і вводять повторні дози, якщо імунна реакція починає згасати. Ефективні дози Ефективні дози фармацевтичних композицій які можуть містити: моноклональні антитіла, анти 94922 60 тіла людських послідовностей, людські антитіла, мультиспецифічні та біспецифічні молекули, малі хімічні молекули, композиції нуклеїнових кислот, наприклад, антизмістовні олігонуклеотиди, олігонуклеотиди з двохланцюговою РНК (RNAi, shRNA, si RNA) або олігонуклеотиди ДНК чи вектори, що містять нуклеотидні послідовності, які кодують транскрипцію молекул shRNA, які інгібують сигналізацію тканинного фактору, або інші інгібітори тканинного фактору, наприклад, інгібючі малі молекули, для лікування новоутворень або запалень, що описані тут, розрізняються у залежності від багатьох факторів, як от шляхів введення, цільового сайту, фізіологічного стану хворого, виду хворого (людина чи тварина), прийому інших ліків та характеру прийому (профілактика або лікування). Звичайно хворим є людина, але можна лікувати й інших ссавців, у тому числі трансгенних. Для оптимізації безпечності та ефективності лікувальні дози треба піддавати аналізу. Доза лікувальної композиції з антитіл або малих молекул становить від біля 0.0001 до 100 мг/кг, зокрема, від 0.01 до 5 мг/кг маси тіла хворого. Наприклад, дози можуть становити від 1 мг/кг маси тіла до 10 мг/кг маси тіла, тобто у діапазоні 110 мг/кг маси тіла. Вводити ліки можна раз на два тижні, або раз на місяць, або кожні 3-6 місяців. У деяких методиках одночасно вводять дві або більше лікувальні композиції антитіл або малих молекул з різною цільовою специфічністю; у таких випадках доза кожної композиції антитіл або малих молекул знаходиться у зазначених межах. Лікувальну композицію антитіл або малих молекул звичайно вводять багатократно. Проміжки між прийомами окремих доз можуть вимірюватися тижнями, місяцями або роками. Вони можуть бути нерегулярними у залежності від показників рівня лікувальної композиції антитіл або малих молекул у крові хворого. У деяких методиках дозу регулюють так, щоб концентрація композиції антитіл або малих молекул у плазмі була у межах 1-1000 мкг/л, в інших випадках 25-300 мкг/л. Або ж можна вводити композицію антитіл або малих молекул уповільненого виділення, тоді частота прийому зменшується. Розмір дози та частота прийому залежать від періоду напіврозкладу лікувальної композиції антитіл або малих молекул в організмі хворого. Також має значення, йдеться про профілактику чи про лікування. Профілактична композиція вводиться відносно малими дозами з відносно великими інтервалами протягом тривалого часу. Деякі хворі приймають ліки до кінця життя. Лікувальні композиції вводяться відносно великими дозами досить часто, доки не буде зупинено або уповільнено розвиток хвороби, а переважно до повного або часткового усунення симптомів хвороби. Після того хворого можна переводити на профілактичний режим. Дози для лікувальної сполуки антитіл або малих молекул коливаються у межах від 10 нг до 1 г, 100 нг - 100 мг, 1 мкг - 10 мг або 30-300 мкг у залежності від хворого. Шляхи введення Лікувальні сполуки (наприклад,, моноклональні антитіла, антитіла людських послідовностей, люд